Studiul mecanismului asemănător estrogenic al glicozidelor din Cistanche folosind metabolomica

Introducere

Estrogenii joacă un rol important în multe procese de dezvoltare, fiziologice și conexe, inclusiv dezvoltarea uterului.1–3 Cu toate acestea, utilizarea pe termen lung a estrogenului poate avea multe efecte secundare, cum ar fi creșterea riscului de cancer de sân, cancer endometrial și alte tumori ginecologice.4,5 Prin urmare, cercetătorii s-au angajat să caute înlocuitori de estrogeni care ar putea evita aceste efecte secundare, cunoscute sub numele de modulatori selectivi ai receptorilor de estrogeni, dintre care fitoestrogenii cuprind o categorie importantă.6 Compușii fitoestrogeni apar în mod natural la plantele cu potență estrogenică și se pot lega de receptorii de estrogeni pentru a-și exercita activitatea. Prin urmare, fitoestrogenii ar putea stimula creșterea uterului prin combinarea cu receptorii abundenți de estrogeni din uter, ceea ce înseamnă că testul uterotrofic ar putea fi utilizat pentru screeningul preliminar și evaluarea fitoestrogenilor.

Cistanchedeserticola (CD), cunoscut sub numele de Rou Cong-Rong în China, se presupune că este eficient pentru funcțiile de reproducere, dezvoltare și fertilitate și a fost folosit ca tonic de mai bine de 1800 de ani.8,9 Recent, studiile de farmacologie au demonstrat că acest lucru tonic are funcții medicinale largi, cum ar fiActivități de reglare hormonală, aperientă, imunomodulatoare, anti-oxidative, anti-apoptotice, neuroprotectoare, antinociceptive, antiinflamatorii, anti-oboseală și estrogenice.10 Glicozidele de cistanche (GC) extrase din CD sunt printre principalele componente active și prezintă diverse activități biologice.11 ​​Deși constituenții activi ai CD au fost elucidați anterior,12 mecanismul asemănător estrogenic al GC nu a fost niciodată investigat.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU PREVENIREA OSTEOPOROZEI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

În acest studiu continuu, ne-am propus să confirmăm posibila utilizare a GC ca fitoestrogeni și să efectuăm o analiză metabolomică pentru a explora mecanismul asemănător estrogenic al GC. În primul rând, au fost utilizate un test uterotrofic și o analiză histologică pentru a confirma activitatea estrogenică a GC. Cel mai important, ne-am concentrat asupra modificărilor metabolice în serul și urina de șobolan folosind analiza metabolomică bazată pe UPLC-MS/MS. Datorită deficiențelor metabolomicelor nețintite, cum ar fi repetabilitatea și influența complicată a matricei, a fost utilizată o pseudometodă bazată pe modul MRM pentru a monitoriza în mod specific metaboliții și indici (inclusiv metabolismul energetic, stresul oxidativ, metabolismul lipidelor și metabolismul amino) legate de efectele estrogenice, creșterea și dezvoltarea a fost selectată ca biomarkeri pentru detectare. Rezultatele noastre aruncă lumină asupra mecanismului estrogenic al GC, care va ajuta la dezvoltarea și utilizarea GC.

Experimental

Reactivi

L-leucină, L-chinurenină, L-triptofan, 5-HTP, acid colic, Nfenilacetilglicină, 5-HT, glutation (GSH) și 2,4-dinitrofenilhidrazină (99 USD{{ 8}}%, HPLC) au fost achiziționate de la Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, China). N-etilmaleimidă ($98%, HPLC), L-glutation oxidat (GSSG, $98%, HPLC) și 1,1,3,3-tetraetoxipropan (TEP) au fost achiziționate de la Sigma (Madrid, Spania). L-fenilalanina (Ring-D5, 98%, DLM-1258-5) a fost achiziționată de la laboratoarele de izotopi Cambridge (MA, SUA). Metanol și acetonitril de calitate MS au fost achiziționate de la ACS (Houston, SUA). Dietilstilbestrol (puritate, $99,0%), acid formic, acid acetic glacial și hematoxilină și eozină (H&E) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, SUA). Naringenin (puritate, $98% (HPLC)) a fost achiziționat de la Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co. (Shanghai, China). GC-urile au fost preparate în laboratorul nostru și puritatea lor a fost determinată a fi de 60% prin spectrofotometrie ultravioletă folosind actozidă ca marker pentru determinare.

Pregătirea GC-urilor

Briey,pulbere de cistanche(100 g) a fost înmuiat în etanol 75% (1000 ml) timp de 1 oră, apoi extras la reux timp de 2,5 ore de trei ori. Supernatantul a fost concentrat sub vid pentru a se obţineextract de cistanche(23,3 g). Extractul a fost diluat cu apă la o concentrație de 0,5 g mL{- 1 (solubilitatea determinată cu medicamentul brut). După adsorbţia cu răşină macroporoasă AB-8 timp de 8 ore, coloana a fost eluată secvenţial cu apă şi 85% etanol. Eluantul de etanol 85% a fost concentrat pentru a obţine extract de etanol (8,4 g). Extractul etanolic (0.{02 g) a fost cântărit cu precizie și dizolvat în 50% metanol (10 ml). O parte alicotă de 1 ml de soluție a fost diluată la 100 ml cu metanol într-un amestec volumetric. În cele din urmă, soluția diluată a fost măsurată la 330 nm prin spectrofotometrie ultravioletă. Absorbția ultraviolete a fost 0,341, iar relația liniară pentru actozidă prin UV a fost y=24,905X + 0,0426 (R2=0,9982). Când au conținut 5,04 g de GC, rata de purificare a fost de 60% (acteozida a fost folosită ca marker pentru determinarea GC). Evaluarea amprentelor digitale a GC-urilor este prezentată în ESI Fig. S1.

Experimente pe animale și colectare de probe

Femele de șobolani SD cu imaturitate sexuală (45–60 g) și maturitate sexuală (320–380 g) au fost furnizate de Centrul pentru animale al Universității Medicale din Harbin, licență pentru animale de laborator, SCXK- (Armata): 2013-001. Animalele au fost găzduite în condiții de laborator SPF și au fost furnizate cu o dietă standard de laborator cu apă de la robinet modificată ad libitum. Toate procedurile pentru animale au fost aprobate de Ghidurile provinciale de bunăstare și îngrijire a animalelor din Heilongjiang și efectuate conform ghidurilor Institutului Național de Sănătate cu privire la principiile îngrijirii animalelor (2004). Toți șobolanii utilizați în acest experiment au fost aclimatizați la mediul de mai sus timp de o săptămână.

Șobolanii SD imaturi sexual au fost împărțiți aleatoriu în trei grupuri de 10 șobolani: grup martor, grup dietilstilbestrol și grup GC. Între timp, 10 șobolani SD cu maturitate sexuală au fost selectați ca grup de control. Grupul dietilstilbestrol a fost ig administrat cu dietilstilbestrol (0,35 mg kg- 1, 1 ml/100 g), grupul GC a fost administrat ig cu soluție GC (30 g kg{- 1, 1 ml/100 g) ), iar grupul martor și grupul martor au primit apă distilată de același volum de două ori pe zi (dimineața și seara) timp de 3 zile. În a treia zi, șobolanii au fost găzduiți în cuști metabolice după administrare, iar probe de urină au fost colectate continuu timp de 24 de ore. Șobolanii au fost anesteziați folosind pentobarbital și au fost obținute probe de sânge și colectate din aorta abdominală și centrifugate la 3000 × g (15 min, 4°C) pentru a obține ser. Toate mostrele au fost stocate la - 20. C. În plus, uterul a fost separat, cântărit și examinat folosind formol 10%.

Analiza histologică

Țesuturile în serie de 5 mm grosime au fost tăiate din uter. Secțiunile de țesut au fost apoi încorporate în parafină, colorate cu H&E folosind metode de rutină și observate cu un microscop optic (BZ-9000; Keyence, Osaka, Japonia). Înălțimea celulelor epiteliale uterine a fost măsurată cu un micrometru la microscop.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU PROMOVAREA CREȘTERII SÂNULUI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metabolomica

Prepararea serului decapat cu cărbune activat

Ser martor special a fost preparat din ser de șobolan care a fost îndepărtat de materiale endogene folosind pulbere de cărbune activat. Pulbere de cărbune activat (6 g) a fost adăugată la serul de șobolan (100 ml) agitat timp de 2 ore la temperatura camerei și centrifugat la 4°C. C și 13 500 rpm timp de 20 min. Supernatantul a fost modificat folosind membrane Millipore express PES (Merck Millipore, Ltd.) atașate la o seringă de 20 ml în următoarea secvență: 5 mm, 1,2 mm și 0,45 mm. S-a confirmat că serul „decapat” este lipsit de biomarkeri prin LC-MS/MS.

Prepararea soluțiilor standard

L-triptofan (Try), L-chinurenină (Kyn), GSSG, N-fenilacetilglicină (N-Phe), 5- HTP, L-leucină (Leu), 5-HT și acid colic ( CA) soluții stoc (1 mg mL- 1) ​​au fost preparate folosind 100% metanol. GSH a fost preparat la 0,5 mg ml- 1 în tampon NEM PBS 10 mM și depozitat la - 40. C în sticle maro. Calibratorii au fost generați folosind combinate L-triptofan, L-chinurenină, GSSG, N-fenilacetilglicină, 5-HTP, L-leucină, 5-HT, acid colic și GSH-NEM care au fost diluate în serie cu distilat apă. Soluția stoc IS de L-fenilalanină-d5 (d5-Phe) a fost preparată în metanol 100% și soluția de lucru de d5-Phe (10 ng mL{- 1) a fost preparată în metanol 100% și depozitat la - 40. C.

În timpul analizei, a fost necesară o etapă de derivatizare pentru a evita degradarea GSH, ceea ce a îmbunătățit stabilitatea pentru detectarea și cuantificarea GSH. GSH a fost determinat după reacția cu NEM.15,16 Conform raportului anterior, 50 mM NEM a fost selectat pentru GSH.

pregătirea unei mostre

Pentru probele de ser, 10 mM NEM (200 mL) a fost adăugat la probă (200 mL), urmat de metanol (1000 mL care conține IS Phe-d5 la 10 ng mL- 1) și incubat timp de 20 de minute la - 1 {9}}. C. După centrifugare la 4°C și 12 000 rpm timp de 10 min, supernatanții (1000 ml) au fost transferați în centrituburi de 2 ml și evaporați la sec. Reziduul uscat a fost reconstituit în apă distilată (100 ml) după centrifugare timp de 15 min la 4°C. C și 13 500 rpm și o alicotă de 10 ml de supernatant a fost injectată pentru analiză.

Pentru probele urinare, 100 ml de probă au fost plasați într-un tub de 2 ml și 1 volum de PBS (m/v) care conține 50 mM NEM a fost adăugat la fiecare probă urinară. Apoi, s-a adăugat metanol (1000 mL care conține IS la 10 ng mL- 1) și proba a fost incubată la - 20. C timp de 20 min, apoi centrifugat la 12 000 rpm timp de 10 min la 4 . C. Supernatantul (1000 ml) a fost evaporat la sec sub un curent blând de azot la temperatura camerei, iar apoi reziduul a fost dizolvat în 60 ml de fază mobilă și agitat timp de 1 minut înainte de centrifugare la 13 500 rpm și 4 . C timp de 15 min. Un supernatant alicot de 10 ml a fost injectat pentru analiză.

Validarea metodologiei

Validarea testului a fost efectuată conform „Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation” (Food and Drug Administration, septembrie 2013). Calibratoarele au fost generate folosind o matrice surogat pentru Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe și CA din soluții standard de lucru din serul „decapat”. Fiecare calibrator de concentrație a fost duplicat. Curba standard a fost calculată prin regresia liniară cu cele mai mici pătrate ponderate 1/X a concentrațiilor de calibrare a curbei standard și a rapoartelor ariei de vârf pentru analit la IS.

Test de precizie și acuratețe

Preciziile testelor ale probelor QC reunite și probelor QC de ser/urină de șobolan netratate au fost evaluate utilizând o secțiune analitică în timpul zilei și trei cicluri analitice între zile. Probele QC cu trei concentrații diferite au fost generate prin adăugarea de L-triptofan, L-chinurenină, GSSG, N-fenilacetilglicină, 5-HTP, L-leucină, 5-HT, acid colic și GSH-NEM soluții standard la ser/PBS „stripat”, care au fost apoi procesate în același mod ca probele in vivo. Încercați, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu și CA soluții stoc standard (1 mg mL{- 1 ) au fost preparate în 10 0% metanol, cu excepția celui de GSH, care a fost preparat la 0,5 mg mL- 1 în tampon NEM PBS 10 mM. Curbele standard la opt concentrații diferite au fost generate în același mod ca probele QC și analizate prin regresie liniară cu cele mai mici pătrate ponderate 1/X. Pentru studiul de validare a metodei, o altă metodă QC a fost efectuată simultan folosind ser/urină (50 ml) din fiecare probă din grupele de control sau model pentru a obține o probă QC și apoi procesată ca probe in vivo. O serie de probe QC și curbe standard au fost efectuate pentru fiecare 50 de probe de animale.

Efecte de matrice

Variația matricei, definită ca variația acurateței testului pentru diferite loturi de matrice, a fost evaluată folosind șase diagrame diferite de ser/urină de șobolan pentru analiză și evaluarea recuperării cu vârf.17 Evaluarea întregului efect de matrice pentru un test de compus endogen este o provocare. . O modalitate de a testa dacă un test are vreun efect de matrice (general) este de a evalua recuperarea intensificată. Testul de recuperare cu dotare implică dozarea analitului în probe pre-extracție, care este diferită de testul factorilor de matrice (MF), care implică adăugarea analitului în probe post-extracție.18 MF a fost calculată ca aria de vârf a analitului în prezenţa unei matrice biologice comparativ cu cea în absenţa unei matrice biologice. S-a utilizat MF normalizat IS: MF ¼ aria de vârf/raport IS în prezența matricei vs. raportul aria de vârf/IS ​​în absența matricei.

Analiza UPLC-MS/MS

Echipamentul MS echipat cu o coloană analitică Waters X BridgeTM BEH C18 XP (2,5 mm, 3,0 × 1{00 mm; Waters, Torrance, CA) a fost utilizat pentru LC-MS Analiza /MS. Faza mobilă cu gradient liniar Q compusă din 0,1% apă cu acid formic (solvent A) și metanol (solvent B) a fost utilizată conform următorului program de gradient: 0–3.0 min (0–1% B); 3.0–10.0 min (1–3% B); 10.0–14,0 min (3–5{0% B); 14.0–18,0 min (50–95% B); 18,0–22,0 min (95–0% B), timpul de oprire este de 25 min. Volumul de injectare a fost de 10 ml și viteza a fost de 0,6 ml min- 1. Metoda finală a folosit următorii parametri: tipul de scanare, MRM; modul ionic, ionizare electrospray (ESI) în moduri de ioni pozitivi și negativi; tensiune de pulverizare ionică, ± 4500 V; gaz cortina, 20; temperatura, 450. C; gaz sursă de ioni 1, 40; gaz sursă de ioni 2, 40. Toate datele UPLC-MS au fost obținute folosind software-ul AB Analyst (versiunea 1.6.2) și m/z 171.1–125.2 pentru standardul intern d5-Phe (DP, 63 V; CE , CXP, 21 V EP, 24 V) și condițiile MS detaliate sunt prezentate în Tabelul S1.

analize statistice

Toate valorile au fost exprimate ca medie ± SD. Semnificația diferențelor dintre grupuri a fost comparată printr-un test ANOVA unidirecțional urmat de testul lui Dunnett folosind programul Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Chicago, IL, SUA). Pragul de semnificație a fost stabilit la p < 0,05 în acest test.

Rezultate și discuții

Efectul GC asupra uterului

Greutatea uterului și analiza histologică au fost utilizate pentru a evalua efectul GC asupra uterului. Greutatea uterului a fost semnificativ crescută în grupurile de dietilstilbestrol, GC și martor în raport cu grupul martor (P < {{0}}.01). În grupul martor, epiteliul endometrial a fost columnar scăzut, cu glande mici, un epiteliu glandular de formă cubică și fără celule inflamatorii interstițiale. În grupul cu dietilstilbestrol, epiteliul glandular și endometrul au fost columnare înalte și au prezentat hiperplazie, cu multe celule inflamatorii interstițiale. În grupul GC, epiteliul glandular și endometrul erau foarte zimțați în coloană și prezentau hiperplazie cu multe celule inflamatorii interstițiale și îngroșarea intimale. În lotul martor, endometrul a fost înalt columnar, iar epiteliul glandular a fost scăzut columnar, cu puține celule inflamatorii interstițiale. Comparativ cu grupul martor, înălțimea celulelor epiteliale uterine a fost semnificativ crescută în celelalte grupuri (P < 0,01) (Fig. 1).

Validarea metodei a biomarkerului detectat prin UPLC-MS/MS

Linearitate și interval de calibrare

Pentru fiecare măsurătoare, a fost construită o curbă de calibrare liniară cu un factor de ponderare de 1/X în matricea studiată. Curbele de calibrare pentru analizele în ser au fost analizate în zile diferite. Intervalele de calibrare pentru analize au fost distribuite de-a lungul a șapte puncte de calibrare, așa cum se arată în Tabelul 1.

Acuratețe și precizie. Metoda s-a dovedit a fi adecvată, în ceea ce privește acuratețea și precizia, atât inter-zi, cât și intra-zi, pentru toate probele studiate. Valorile acestor parametri au fost mai mici de 5% la concentrațiile stabilite pentru GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, acid colic, 5-HT și N-fenilacetilglicină, cu trei replici din fiecare concentraţie analizată. Datele corespunzătoare valorilor inter-zi și intra-zi de acuratețe și precizie sunt prezentate în tabelul ESI S2.

Efecte de matrice

După cum se arată în tabelul ESI S3,† recuperările sporite au fost de 92,5–118,1% la adăugarea a 1000 ng mL- 1 de GSH, 2000 ng mL{- 1 de GSSG, 1000 ng mL{- 1 de Leu , 6000 ng mL- 1 de Trp, 50 ng mL- 1 de Kyn, 2 ng mL{- 1 de 5-HTP, 400 ng mL- 1 de acid colic , 8 ng mL- 1 de 5-HT și 2500 ng mL{- 1 de N-fenilacetilglicină în trei parcele diferite de ser de șobolan și când se adaugă 100 ng mL- 1 de GSH, 200 ng mL- 1 de GSSG, 1000 ng mL- 1 de Leu, 6000 ng mL- 1 de Trp, 50 ng mL- 1 de Kyn, 2 ng mL{ {37}} de 5-HTP, 400 ng mL- 1 de acid colic, 8 ng mL- 1 de 5-HT, 2500 ng mL- 1 de N -fenilacetilglicină în trei parcele diferite de urină de șobolan cu diferite niveluri de bază. CV-urile concentrațiilor măsurate de Trp și Kyn din aceste loturi au fost #10% (n=5). Aceste rezultate au indicat că diferitele matrice nu au afectat în mod semnificativ testul.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCĂ PENTRU PREVENIREA CANCERULUI UTERIN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiza profilării metaboliților prin metoda pseudo-țintită

Metoda pseudo-țintită a fost exploatată pentru a investiga metabolitul MRM din ser și urină a patru grupuri (martor, dietilstilbestrol, martor și GC).

În primul rând, modelul PCA a fost construit pentru a prezenta distincția metabolică a celor patru grupuri. Din analiza multivariată, au existat diferențe metabolice evidente între grupurile GC (inclusiv dietilstilbestrol și grupurile de control) și grupul martor. Probele QC s-au grupat strâns în diagrama de scor al PCA, ceea ce a indicat că stabilitatea sistemului a fost acomodativă pentru acest studiu de metabolomică (Fig. 2).

Apoi, valoarea P critică a fost setată la 0.05 pentru metaboliții diferențiați semnificativ în această cercetare. În consecință, așa cum se arată în Tabelul 2, metaboliții diferențiați în comparație cu grupul martor au fost identificați în mod provizoriu după cum urmează: 17 în probele de ser și

12 în probe de urină pentru grupul GC, 15 în probe de ser și 9 în probe de urină pentru grupul dietilstilbestrol, 12 în probe de ser și 11 în probe de urină pentru grupul de control și 11 în probe de ser și 7 în probe de urină care au fost simultan prezent în grupele GC, dietilstilbestrol și martor. Pentru a înțelege în continuare diferențele metabolice dintre diferitele grupuri, a fost generată o hartă termică de grupare pentru toți metaboliții diferențiali, demonstrând creșterea relativă (roșu) sau scăderea (verde) (Fig. 3).

Optsprezece metaboliți diferențiali prezenți simultan în grupele GC, dietilstilbestrol și martor au fost descriși ca

urmează: glucoză, acid citric, prolină, betaină, ornitină, N-fenilacetilglicină, acid fenil piruvic, inozină, C16:0LPC, creatinină și xantozină în ser și benzen acetilglicină, acid piroglutamic, acetilcarnitină și S-a observat că N6-acetil lizină din urină este semnificativ scăzută (P <0.05); în timp ce taurina, ornitina, acidul a-cetoglutaric și spermidina în urină au fost semnificativ crescute (P <0.05). În plus, taurina (ser) a crescut semnificativ, în timp ce acidul a-ketoglutaric (ser), C18:0LPC (ser) și betaină (urină) au fost semnificativ scăzute în grupurile dietilstilbestrol și GC (P < {{ 19}}.05); L-chinurenina (ser) a fost reglată în sus în grupul dietilstilbestrol, dar a fost reglată în jos în grupul GC (P < 0,05); acidul piroglutamic (ser) și prolina (urină) au fost reglate în jos, iar acidul citric (urină) și nicotinamida (urină) au fost semnificativ crescute în grupul de control și GC (P < 0,05); iar fenilalanina a fost reglată în jos în grupul GC (P <0,05).

În acest studiu, au fost investigate efectele GC asupra uterului șobolanilor imaturi. Uterul este cel mai sensibil organ pentru determinarea efectelor dependente de ER ale substanțelor chimice.Herba Cistanchessa raportat că induce o creștere a greutății uterine prin îmbunătățirea funcției de eliberare a lutropinei a ovarului hipotalamo-hipofizar,20 care a fost observată și pentru GC în acest studiu. Acest lucru a indicat că GC-urile au activitate asemănătoare estrogenului. Recent, rapoartele s-au concentrat în principal asupra mecanismului predominant prin care efectele estrogenice sunt exprimate prin legarea de ER,21–23, dar mecanismul metabolic nu a fost studiat în profunzime. În acest studiu, a fost folosită o metodă pseudometabolomică pentru a explora mecanismul asemănător estrogenic al GC.

Intermediarii metabolici ai unei serii secvențiale de reacții s-au schimbat într-un mod mai pronunțat decât cinetica enzimatică sau individualizează.24 Șaptesprezece metaboliți în ser, inclusiv glucoză, acid citric, taurină, prolină, betaină, ornitină, acid piroglutamic, acid a-cetoglutaric, N- fenilacetilglicină, acid fenilpiruvat, inozină, C18:0LPC, C16:0LPC,

creatinină, fenilalanină, L-chinurenină și xantozină și 12 metaboliți în urină, inclusiv benzen acetilglicină, betaină, taurină, acid citric, ornitină, acid piroglutamic, acetilcarnitină, N6-acetil lizină, a-cetotinaglutaric acidul, spermidina și prolina s-au dovedit a fi implicate în mecanismul estrogenic al GC. Câțiva metaboliți modificați au fost de interes special deoarece au fost prezenți atât în ​​ser, cât și în urină. De exemplu, acidul citric, format prin condensarea acetil coenzimei A și a acidului oxaloacetic și care joacă un rol important în ciclul acidului citric legat de metabolismul energetic25, a fost reglat în jos în serul grupului GC, dar suprareglat în urină. . În plus, acidul a-ketoglutaric cu un cadru de carbon glutamin, care poate menține echilibrul total de azot și poate promova sinteza proteinelor și este materialul central al ciclului acidului citric, a fost reglat în jos în serul grupului GC, dar reglat în sus. în urină.26 Ciclul acidului citric nu este doar calea metabolică finală a trei nutrienți majori (carbohidrați, lipide și aminoacizi), ci și legătura dintre metabolismul zahărului, lipidelor și aminoacizilor și principala modalitate de a obține energie. pentru organism.27,28 Aceasta a arătat că mecanismul asemănător estrogenic al GC a fost legat de metabolismul energetic, care este același cu dietilstilbestrolul. Prin urmare, a existat o legătură clară între ciclul acidului citric și creșterea greutății uterine la șobolanii imaturi tratați cu GC. Ca donator important de metil, betaina joacă un rol important în creșterea și dezvoltarea fătului, ceea ce indică faptul că betaina este implicată în creșterea greutății uterine. și absorbția celulară și utilizarea glucozei prin promovarea metabolismului glucozei. De asemenea, s-a raportat că deficitul de taurină duce la pierderea în greutate la animalele tinere, sugerând că taurina joacă un rol important în creștere și dezvoltare. efect comparativ cu dietilstilbestrol.

În plus, numeroși aminoacizi au fost modificați semnificativ. Rezultatele noastre au sugerat că GC-urile au cauzat anomalii metabolice în aminoacizi. Metabolismul aminoacizilor ar putea fi utilizat pentru sinteza proteinelor specifice, peptidelor și alți compuși azotați, sau decarboxilarea prin dezaminare, transaminare, combinată cu descompunerea amoniacului, sau pentru eliberarea de energie prin ciclul acidului citric.31,32 Prin urmare, modificările acestora. compușii pot fi implicați în evenimentele importante de semnalizare care declanșează creșterea greutății uterine.

Mai mult, pentru o analiză detaliată a căii, metaboliții diferențiali au fost clasificați în mai multe căi majore, inclusiv ciclul citratului (ciclul TCA), metabolismul glutationului,

metabolismul argininei și prolinei, metabolismul D-glutaminei și D-glutamatului, biosinteza fenilalaninei, tirozinei și triptofanului, metabolismul fenilalaninei și alte căi utilizând Pathway Analysis of MetaboAnalyst software (http://www.metaboanalyst.ca), după cum se arată în Fig. 4. Calea legată de metabolismul energetic, inclusiv ciclul TCA și metabolismul glutationului (atât în ​​ser, cât și în urină), a fost una dintre țintele principale ale efectelor estrogenice. Rolul critic al substanțelor chimice estrogenice în metabolismul energetic a fost verificat de ER care reglementează genele necesare pentru funcția mitocondrială, ciclul TCA și multe altele, conform studiilor anterioare.33,34 S-ar putea concluziona că mecanismul asemănător estrogenic al GC a fost similar. cu cel al dietilstilbestrolului, cu ambele legate, într-o oarecare măsură, de ciclul TCA și metabolismul glutationului, dar cu GC-urile care au performanțe mai bune decât dietilstilbestrolul.

Deși mecanismele posibile nu au putut fi clarificate în acest studiu, au fost selectați unii metaboliți care ar putea fi utilizați pentru a explora alte mecanisme estrogenice ale GC în uter în viitor. Prin urmare, pentru a explora mai bine mecanismul, alte tehnologii, cum ar fi proteomica, vor fi aplicate în cercetările viitoare.

Concluzii

Pentru a rezuma, a fost stabilită o metodă de metabolomică pseudoțintită în ser și urină bazată pe UPLC-QTRAP MS pentru explorarea mecanismelor asemănătoare estrogenice ale GC, care a oferit rezultate robuste și de încredere. Folosind abordarea pseudo-țintită stabilită, a fost dezvăluită o viziune holistică a modificărilor în metabolomica serică și urinară a mecanismului de tip estrogenic (GC).

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%