Studiu asupra funcției neuroendocrine-imunitare a Cistanche Deserticola și a produselor sale de aburire a vinului de orez în modelul de șobolan indus de glucocorticoizi-Ⅰ

1. Introducere

Cistanche deșert, care se numește „ginseng de deșert”, este un medicament tradițional chinezesc care a fost folosit de secole ca plantă yang-tonică pentrurevigorând rinichiul și întărind yang-ul[1]. Opt specii și o variație aCistanche Herba au fost înregistrate în China și numaiCistanche deserticolaYC Ma șiCistanche tubulosa(Schenk) Wight sunt înregistrate în Farmacopeea Chineză [2]. Studiile farmacologice au demonstrat căCistanches Herbaau prezentat neuroprotector [3], imunomodulator [4], cardioprotector [5], antiobosit [6], antiinflamator [7], hepatoprotector [8], antioxidant [9], antibacterian [10], laxativ [11] și antitumoral efecte [12]. Spectrul larg de activități biologice raportate ale acestui gen a fost atribuit compoziției sale fitochimice complexe și variate.Cistanche deserticolaconţine feniletanol glicozide, iridoide, polizaharide [13] etc. Conţinutul de feniletanol glicozide este cel mai mare din materialele medicinale originale [14].

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU VIGORAREA RINCHIULUI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Procesarea Materiei Medicale Chineze (CMM) este o tehnică farmaceutică tradițională pentru a îndeplini diferitele cerințe pentru tratarea, distribuirea și prepararea preparatelor conform teoriei medicinei tradiționale chineze. Aceste produse prelucrate poartă denumirea de bucăți de decoct, care sunt folosite în clinici. Prelucrarea urmărește să sporească eficacitatea reducerii toxicității medicamentelor brute. Farmacopeea Chineză din 2015 a înregistrat că felii groase de Cistanche (CD) și Cistanche de orez aburit în vin (WCD) pot fi folosite ca bucăți de decoct în clinică. Grupul nostru de cercetare a arătat că efectul laxativ a fost ameliorat, iar efectele anti-îmbătrânire și revigorante pentru rinichi-yang au fost îmbunătățite după ce Cistanche a fost aburit cu vin de orez [15].

Funcția axei hipotalamus-hipofiză-glanda suprarenală-timus (HPAT) este dezordonată în sindromul de deficiență rinichi-yang [16]. Pacienții cu deficiență de rinichi-yang au, de asemenea, o disfuncție imunitară extinsă. Disfuncția axei HPA este strâns legată de imunodeficiența. Teoria rețelei neuroendocrine-imune (NEI) arată că sistemele imunitar și neuroendocrin împărtășesc mulți liganzi și receptori [17], iar hipotalamusul este considerat pivotul pentru a lega neuroendocrinul de sistemele imunitare.

În acest studiu, am replicat deficiența de rinichi-yang la șobolani model cu injecție de corticosteroizi exogen și am explorat mecanismul deficienței de rinichi-yang ca răspuns la diferite produse procesate de Cistanche deserticola din perspectiva funcției endocrino-imune.

2. Materiale și Metode

2.1. Materiale și reactivi

Cistanche deserticola a fost colectată de la Alashan Neimenggu în 2019.5 și identificată ca fiind tulpinile cărnoase uscate ale Cistanche deserticola YC Ma de către prof. Yanjun Zhai (Școala de Farmacie, Universitatea de Medicină Tradițională Chineză Liaoning, China). Exemplarele de voucher au fost păstrate în Centrul Tehnologic de Inginerie de Procesare Liaoning.

Compușii standard ai ajugolului au fost achiziționați de la Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, China); cistanozidă F,echinacozidă, cistanozidă A și izoacteozidăau fost achiziționate de la Must Company (Sichuan China); acteozidul a fost achiziționat de la Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, China). Acetonitril și metanol de grad MS au fost achiziționate de la Merck KGaA (Darmstadt, Germania). Acidul formic de calitate HPLC a fost achiziționat de la Merck KGaA (Darmstadt, Germania). Vinul de orez a fost achiziționat de la Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).

Corticosteron (CAS: 50-22-6, puritate > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pastile chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), șobolan ACTH, CRH, T, IL{{ Trusele de detectare ELISA 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 și IL-10 au fost achiziționate de la Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Trusa ELISA de cortizol pentru șobolani a fost furnizată de BOSK Co., anticorp CD4 de șobolan, anticorp CD8a (nr. 561833 și 559976), lizat RBC (Solarbio, R1010), soluție tampon PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), primeri CaM și -actin în amonte și în aval au fost furnizate de Guangzhou Invitrogen Co. Kitul de transcripție inversă (nr. RR037A) și kitul de sinteză cADN (nr. 10000068167) au fost furnizate de Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Cloroform, izopropanol, 75% etanol și uretan Toate soluțiile au fost pure din punct de vedere analitic și produse de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Apa ultrapură a fost produsă de sistemul Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, SUA).

2.2. Instrumente experimentale

Un marker de enzime (Thermo, model 3530911931), spălator automat de plăci (model HBS- 4009), contor de forță de împingere și tragere cu afișaj digital (model VICTOR- 50N), centrifugă de congelare de mare viteză (model Sigma 3k15 ), spectrofotometru ultramicro (modelul B-50Q), amplificator genic (modelul L96G), PCR cantitativ cu fluorescență în timp real (modelul StepOne), citometru în flux (modelul AC66051710132), microtom cu parafină (modelul Laika), microscop (Olympus). , modelul BS-53) și un instrument cu apă pură (modelul F7JA36507).

2.3. Pregătirea probelor pentru UPLC-Q-TOF-MS și experimente farmacologice

WCD a fost procesat din același lot deCistanche deșertîn laboratorul nostru. Pentru prepararea WCD, bucăți CD uscate (5 mm grosime) (100 g) au fost infuzate cu vin de orez (30 ml), au fost aburite la presiune înaltă (1,25 kPa) timp de 4 ore și apoi au fost uscate la 55 de grade.

Pulberile grosiere de CD și WCD au fost înmuiate în 10 ori 95% etanol timp de 0,5 ore, extrase la reflux de 3 ori de fiecare dată timp de 1 oră și filtrate, iar filtratele au fost combinate de 3 ori. Etanolul a fost recuperat la presiune redusă şi extractul a fost obţinut pentru administrare. Extractul (1 mL) a fost adăugat la 50% metanol, aducând volumul total la 20 mL, și depozitat la 4 grade pentru analiza conținutului.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. Condiții UPLC-QqQ-MS pentru analiza extraselor CD și WCD

2.4.1. Condiții analitice LCThMS

Sistemul UPLC-MSThMS cu software MassLynx 4.1 Analyst a fost utilizat pentru a efectua achiziția și procesarea datelor. Coloana analitică a fost un Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) la o temperatură de 4{0 grade C. Faza mobilă a fost 0,1% soluție apoasă de acid formic (A) și acetonitril care conține 0,1% acid formic (B). Gradientul de eluție a fost de 0,00–1,00 min cu 3% B, 1,01–2,00 min cu 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} min cu 12% B, 3,01–4.00 min cu 15% B, 4,01–5.00 min cu 20% B, 5,01–6.00 min cu 22 % B, 6,01–8,00 min cu 25% B și 8,01–9,00 min cu 10% B. Debitul a fost de 0,3 mLTh min, iar volumul de injecție a fost de 1,0 μL.

Spectrometrul de masă triplu cvadruplu Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, SUA) echipat cu o sursă de ionizare electrospray (ESI) a fost utilizat în modul de ioni negativi. Gazul de desolvatare a fost azot cu un debit de 500 LThh la o temperatură de 250 de grade. Toți compușii detectați au fost măsurați în modul de monitorizare a reacțiilor multiple (MRM); Tabelul 1 prezintă parametrii energetici, iar Tabelul 2 prezintă curbele de calibrare pentru componentele analizate.

2.4.2. Prepararea Substanţelor de Referinţă

Tubulozidă A (3,02 mg), echinacozidă (3,00 mg), 2′-acetillacteozidă (2,34 mg), acteozidă (2,45 mg), izoacteozidă (0,61 mg), cistanozidă F ( 2,14 mg), salidrozidă (3,39 mg), acid geniposidic (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) și catalpol (2,39 mg) au fost dizolvate în metanol pentru a prepara o soluție stoc. Soluția stoc a fost diluată cu metanol pentru a obține concentrațiile adecvate pentru soluțiile standard de lucru. Toate soluțiile preparate au fost păstrate la 4 grade înainte de utilizare.

2.5. Pregătirea și gruparea modelelor animale

Șobolani masculi SD (180–220 g) au fost achiziționați de la Liaoning Changsheng Biotechnological Co., numărul permisului de animale: SCXK (Liao) 2015–0001. Toți șobolanii au fost menținuți cu acces liber la hrană și apă la 25 de grade și o umiditate relativă de 30-50%. Animalele au fost adăpostite timp de 7 zile înainte de experimente.

O sută de șobolani au fost împărțiți aleatoriu în 10 grupuri: grup martor (BC), grup control model (MC), grup control pozitiv (PC), grup control vin de orez (WC), CD cu doză mare (CD -HD), grup CD cu doză medie (CD-MD), grup CD cu doză mică (CD-LD), grup WCD cu doză mare (WCD-HD), grup WCD cu doză medie (WCD-MD) și Grupul WCD cu doză mică (WCD-LD). Dozele de CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD și CD-LDThWCD-LD au fost de 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) și, respectiv, 1,37 gTh (kg ∙ d). Doza pentru grupul PC a fost de 1,646 gTh(kg ∙ d), iar pentru grupul WC, 1 mLTh100 g timp de 40 de zile. În a 6-a zi după administrare, șobolanii au fost injectați subcutanat cu suspensie apoasă de corticosteron (corticosteron + 0,1% dimetil sulfoxid + 0,1% Tween{-80 + 0,9% clorură de sodiu), cu excepția pentru grupul BC [18]. Concentrația de corticosteron a fost de 5 gThL, iar doza a fost de 0,1 mLTh100 g. Șobolanilor din grupul BC li sa administrat soluție salină normală + 0,1% dimetil sulfoxid + 0,1% Tween{- 80 + 0,9% clorură de sodiu prin injectare în aceeași doză.

2.6. Determinarea funcțiilor axei HPA

2.6.1. Test de greutate, temperatură și putere de reținere

Un test de greutate a fost efectuat la fiecare 3 zile, iar temperatura a fost luată la fiecare 6 zile. în timpul experimentului. În a 39-a zi, puterea maximă a membrelor posterioare a fost măsurată cu un metru de prindere. Șobolanii au fost așezați pe platforme netede, făcându-și membrele posterioare să prindă stâlpul. Șobolanii vor apuca instinctiv orice obiect pentru a preveni mișcarea înapoi atunci când coada este trasă până când forța de tragere depășește prinderea. Când șobolanul și-a pierdut prinderea, preamplificatorul putea înregistra automat forța maximă de prindere.

2.6.2. Determinarea nivelului de T, CRH, ACTH, CORT și cortizol în ser

La o oră după ultima administrare, șobolanii au fost anesteziați prin injectarea intraperitoneală a unei soluții de uretan (20 gTh100 mL). Apoi, probele de sânge au fost colectate, centrifugate la 3500 r timp de 15 minute pentru a obține serul și depozitate la -20 de grade. Concentrațiile de T, CRH, ACTH, CORT și cortizol au fost măsurate cu truse ELISA de șobolan conform instrucțiunilor producătorului.

2.6.3. Observații la microscop

Structura morfologică a țesutului glandei suprarenale a fost observată prin colorarea HE. Țesutul suprarenal a fost fixat în paraformaldehidă 10%, deshidratat în etanol, făcut transparent printr-o soluție de xilen, încorporat prin metode convenționale, tăiat la felii groase de 4 μm, deparafinat cu soluție de xilen, hidratat cu gradient de etanol și apoi colorat cu hematoxilină și eozină. soluție de colorare. După ce a fost făcută transparentă cu xilen, placa a fost sigilată cu gumă neutră și observată la microscop.

2.6.4. Colorarea imunohistochimică a expresiei proteinelor Bax, Bcl-2, caspaze{-3, Fas și FasL în glanda suprarenală

Secțiunile suprarenale de șobolan fixate în formol, încorporate în parafină au fost deparafinizate și rehidratate după ce au fost tăiate la o grosime de 4 μm. Pentru blocarea activității peroxidazei endogene, secțiunile au fost preincubate în bloc de peroxid de hidrogen timp de 10 min. Secțiunile au fost scufundate în 0,01 M citrat (pH 6,0) și încălzite până la fierbere. Procesul se repetă după 5-10 minute. După răcire, secțiunile au fost spălate cu PBS (pH 7,2-7,6) de 1-2 ori, lăsate la temperatura camerei timp de aproximativ 5 minute și spălate cu PBS (pH 7,2-7,6) de 2-3 ori. Soluția de blocare BSA 5% a fost adăugată la temperatura camerei și excesul de lichid de pe secțiune a fost scuturat 20 min mai târziu. Anticorpi primari diluați specifici pentru FasTh FasL, Bcl-2ThBax și caspaza{-3 (1:100 diluat cu PBS) au fost adăugați și incubați la 37 de grade timp de 1 oră sau 4 grade peste noapte. Secțiunile au fost spălate de 2-3 ori cu PBS (pH 7,2-7,6). Apoi, s-a adăugat IgG anti-șoarece de capră biotinilat, iar secțiunile au fost uscate la 20-37 grade timp de 20 de minute și spălate cu PBS (pH 7,2-7,6) de 4 ori timp de 5 minute. După spălare minuțioasă în PBS, secțiunile au fost incubate cu un amestec de reactivi A și B timp de 30 de minute, incubate cu PBS timp de 45 de minute și, în final, dezvoltate cu substrat DAB (DAKO) timp de 30 de minute înainte de a fi ușor contracolorate cu hematoxilină, deshidratate, si montat.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTIREA SENSATIILOR SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Determinarea Funcțiilor Imune

2.7.1. Calculul indicelui de organe imune

La o oră după ultima administrare, șobolanii au fost anesteziați prin injectare intraperitoneală cu soluție de uretan (20 gTh100 mL), apoi splina și glanda timus au fost îndepărtate și cântărite imediat într-o hotă sterilă. Coeficienții de greutate ai splinei sau timusului (%) � greutatea splinei sau timusului (mg) Greutatea corporală (g).

2.7.2. Detectarea subgrupurilor de limfocite T în sângele periferic

Splenocitele și hemocitele au fost incubate cu anticorpii monoclonali anti-CD4 (PE) și anti-CD8 (FITC) timp de 30 de minute la întuneric. S-au adăugat 2 mL de lizat de eritrocite, iar soluţia a fost amestecată prin vortexare. Soluția a fost lăsată în întuneric timp de 10 minute și centrifugata timp de 5 minute. Supernatantul a fost aruncat și apoi soluția a fost spălată de 3 ori cu PBS răcit cu gheață și resuspendată în soluție de permeabilizare a PBS. Cel puțin 10,000 celule au fost analizate prin citometrie în flux în decurs de 1 oră de la fiecare colorare Mab.

2.7.3. Determinarea nivelului de IL-10, IL{-6, IL{-2, TNF- și IFN-c în ser

La o oră după ultima administrare, șobolanii au fost anesteziați prin injectare intraperitoneală cu soluție de uretan (20 gTh100 ml) și s-a prelevat sânge din aorta abdominală. Sângele a fost centrifugat la 3500 r timp de 15 minute pentru a obține serul și depozitat la -20 de grade. Concentrațiile de IL-10, IL-6, IL-2, TNF- și IFN-c au fost detectate cu truse ELISA de șobolan conform instrucțiunilor producătorului.

2.8. Exprimarea CaM în țesuturile hipotalamus și hipofize

ARN-ul total a fost extras din hipotalamus și țesuturile hipofizei prin TRIzol. Transcripția inversă a fost efectuată pe 10 μL de ARN total conform instrucțiunilor producătorului. Au fost analizate cantități egale de cADN prin qPCR în prezența colorantului de legare a dsDNA (Promega, SUA) și a sistemului CFX 96 Real-time PCR System (Bio-Rad, SUA) pentru a analiza diferitele gene în condițiile activării inițiale la 95 de grade timp de 10 min, 40 de cicluri de denaturare la 95 de grade timp de 15 s și extensie de recoacere la 60 de grade timp de 1 min.

Primerii pentru CaM și -actină sunt dați în Tabelul 1, iar -actina a fost utilizată ca control intern. Fiecare probă a fost normalizată utilizând diferența în pragurile critice (Ct) dintre gena țintă și -actină. Următoarea ecuație a fost utilizată pentru a descrie rezultatul: ΔΔCt � (genă țintă Ct − gena actină Ct) grup experimental − (genă țintă Ct − gena actină Ct) grup de control. Nivelurile de ARNm ale fiecărei probe au fost apoi comparate, utilizând expresia 2- ΔΔCt gena țintă. Rezultatele fiecărui grup au fost mediate (Tabelul 3).

2.9. Analiza Statistică

Toate datele au fost analizate folosind software-ul SPSS (versiunea 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Diferențele dintre grupuri au fost analizate cu analiza de varianță cu măsuri repetate unidirecționale (ANOVA). Rezultatele au fost exprimate ca medie ± abatere standard (SD) folosind software-ul GraphPad Prism (versiunea 6.0, San Diego, CA, SUA). Diferențele cu o valoare P mai mică de 0,05 au fost considerate semnificative statistic.

3. Rezultate experimentale

3.1. UPLC-QqQ-MSAnaliză

Pentru a obține cea mai bună separare, forma vârfului și un timp scurt de analiză, condițiile cromatografice inclusiv coloana, faza mobilă și programul de gradient au fost studiate în experimentul nostru preliminar. Cromatogramele tipice cu modul MRM sunt prezentate în Figura 1.

Din Tabelul 4, putem observa că conținutul de glicozide feniletanoide din WCD a crescut comparativ cu cel din CD, în special pentru echinacozide și acteozide, în timp ce conținutul de iridoizi a fost scăzut în WCD.

3.2. Reglementare pentru funcția axei HPA

3.2.1. Test de greutate, temperatură și putere de reținere

Șobolanii din grupul MC și din grupurile experimentale au prezentat simptome de deficiență renală-yang treptat după ce au primit corticosteron. Simptomele, cum ar fi scăderea în greutate, hipotermia, pierderea strălucirii părului, spiritul căzut, întârzierea răspunsului și o scădere semnificativă a consumului de apă și a activității, s-au îmbunătățit mult în grupurile CD și WCD. Figura 2(a) arată modificările de greutate. Greutatea fiecăruia dintre grupurile de droguri a crescut, în special în grupurile CDHD și WCD-HD. Creșterea în greutate în grupul MC a fost cea mai mică. Figura 2(b) arată schimbările de temperatură, care au fost cele mai scăzute în grupul MC, iar temperatura a crescut în grupurile WCD-HD, WCD-MD și WCD-LD.

Figura 2(c) arată că puterea de reținere a crescut pentru grupul BC și fiecare dintre grupurile experimentale, iar grupul WCD-MD a fost cel mai mare, ceea ce a demonstrat că semnele de slăbiciune induse de deficiența rinichi-yang s-au îmbunătățit după administrare.

3.2.2. Nivelurile de T, CRH, ACTH, CORT și cortizol

Figura 3 arată că, în comparație cu cele din grupul BC, nivelul de T, CRH, ACTH și CORT din serul de șobolan a scăzut (P < 0.01) și nivelul de cortizol a scăzut (P < 0.05) în grupul MC. În comparație cu cele ale grupului MC, nivelul T în grupurile WCD-HD și WCD-MD a crescut (P <0.{01), nivelul CRH în WCD-LD, Grupurile WCD-MD și WC s-au îmbunătățit (P < 0.01), conținutul de ACTH a crescut în grupurile CD-HD, WCD-MD și WCD-HD (P < 0,01), nivelul CORT a fost îmbunătățit în Grupurile CD-MD, WCD-MD și WCD-HD (P < 0,01) și a crescut în grupurile CDHD și WCD-LD (P < 0,05), iar nivelul de cortizol a crescut în fiecare dintre grupurile de medicamente.

3.2.3. Rezultatele observării la microscop

Țesutul glandei suprarenale poate fi împărțit în stratul cortical și stratul medular. Straturile corticale includ straturi globulare, mănunchi și reticulare. Celulele conțin mai multe lipide, iar stratul medular constă în principal din celule feocromocitom și o cantitate mică de țesut fibros. După cum se arată în Figura 4, am constatat că totul a fost normal în grupul BC, în timp ce în grupul MC, cortexul suprarenal avea hiperplazie evidentă, atrofie celulară și densitate în creștere. Banda bulboasă s-a îngroșat, iar zona fasciculară translucidă, zona reticulară îngustă și celulele mai mici au prezentat o colorare neuniformă și congestie capilară. În grupul PC, limitele corticale și medulare au fost vizibile. Celulele benzilor globulare și mănunchiului au fost dispuse uniform, iar structura morfologică a fost restabilită. Aceeași restaurare mai bună a fost observată în grupurile WCD, iar efectele în grupul WCD-MD au fost mai bune decât cele ale grupurilor WCD-HD și WCD-LD. Morfologia glandei suprarenale în grupurile CD nu a fost la fel de bună ca cea din grupurile WCD.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%