Studiu asupra efectului Acteozidului (un ingredient activ în Cistanche Deserticola) asupra NAFLD prin inducerea autofagiei

2 rezultate

2.1 Comparația LC 3- ⅱ Niveluri de expresie proteică în celulele HepG2 tratate cuAcționează și echivalează expresia relativă a LC 3- ⅱ proteinăÎn celulele HepG2 tratate cu bafa1 (0. 67 ± 0. 0 4) a fost semnificativ mai mare decât cea din grupul de control gol (0. 41 ± 0. 0 2). Expresia relativă a LC {{1 {{2 0}}}} ⅱ Proteina în celulele HepG2 din grupul rapamycin+bafa1 (1,24 ± {{3 0}}. 0 6) a fost mai mare decât cea din grupul Rapamicininin (0. 28 ± {{4 0}}. 02). Expresia LC 3- ⅱ proteină în celulele HepG2 din grupul ECH+BAFA1 și grupul ACT+BaFA1 [0,43 ± 0,02 și 1,36 ± 0,11, respectiv] au fost semnificativ mai mari decât cele din grupul Ech și, respectiv, grupul ACT [(0,18 ± 0,01 și 0,28 ± 0,02, respectiv]]] și diferențele au fost semnificativ<0.05).

TCM Herb Cistanche pentru protecția ficatului

2.2 Comparația LC 3- ⅱ Niveluri de expresie proteică în celulele HepG2 tratate cu diferite concentrații de ACT

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}. 0 5); LC 3- ⅱ Niveluri de expresie proteică a celulelor HepG2 în BAFA1 combinate cu 25, 5 0 și 1 0 0 μmol/L Grupuri de act (1,17 ± 0. 3 0}, 1,83 ± 0. 53, și 0. 97 ± 0,25, respectiv) au fost semnificativ mai mari decât cele din grupurile 25, 50 și 100 μmol/L (0,38 ± 0,09, 0,35 ± 0,18 și, respectiv, 0,30 ± 0,15), cu diferențe semnificative (p<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Notă: A. Imunoblotare proteică; B. Rezultate ale analizei semi-cantitative; în comparație cu grupul ACT fără BaFA1, AP<0.05.
Figura 1 Comparația LC 3- ⅱ Niveluri de expresie proteică în celulele HepG2 tratate cu diferite concentrații de ACT

2.3 Comparația viabilității celulelor HepG2 tratate cu diferite concentrații de ACT pentru 24 și 48 de ore

Valorile OD ale celulelor HepG2 după intervenția cu 0, 2 0, 4 {{1 0}}, 6 0, 8 0, și 1 0 0} și 1 0 0} și 1 0 0} și 1 0 0} și 1 {Act pentru 24 h au fost 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 0}}. 15, 0. 99 ± 0}. 0. 94 ± 0. 15, și 0. 94 ± 0. 20, respectiv; iar valorile OD ale celulelor HepG2 după intervenție timp de 48 h au fost 3,06 ± 0,27, .96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13 și, respectiv, 0,09 ± 0,22. Nu a existat nicio diferență semnificativă în valorile OD ale celulelor HepG2 după 24 și 48 h de intervenție cu diferite concentrații de ACT (F =0. 213, 0,213, p =0. 96, 0,36). Vezi Figura 2.

Notă: Celulele A. HepG2 au fost tratate cu diferite concentrații de ACT timp de 24 de ore; B. Celulele HepG2 au fost tratate cu diferite concentrații de ACT timp de 48 de ore.

Figura 2 Valori OD la 570 nm după 24 și 48 h de tratament cu diferite concentrații de ACT

2.4 Comparația nivelurilor de TG și a colorației roșii de ulei în modelul de celule in vitro a NAFLD după intervenția ACT

Nivelul TG al celulelor HepG2 din grupul model (34,15 ± 1,90) a fost semnificativ mai mare decât cel din grupul de control gol (14,17 ± 2,74) și grupul de intervenție ACT (19,11 ± 1,68), iar diferențele au fost semnificative statistic (P<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

Notă: A. Nivel TG; B. colorare roșie de ulei (20 ×); în comparație cu grupul model, AP<0.05.
Figura 3 Comparația nivelului TG și a uleiului roșu O în modelul de celule in vitro NAFLD după tratamentul ACT

2,5 Comparația de autofagosomi și picături de lipide după tratamentul ACT în comparație cu grupul de control gol, picăturile lipidice ale celulelor HepG2 din grupul de tratament cu rapamicină și grupul de intervenție ACT au crescut semnificativ, iar autofagosomii LC3 ale celulelor HEPG2 în grupul de intervenție ACT a crescut semnificativ și co-localizați cu picături de lipide în spațiu. Vezi Figura 4.

3 Discuții

NAFLD este cea mai frecventă boală hepatică cronică din lume, reprezentând aproximativ 1/4 din populația totală a lumii și a devenit o problemă globală de sănătate publică. Supranutriția este principalul factor care conduce NAFLD. Aportul excesiv de nutrienți de către celulele hepatice determină depunerea excesivă a grăsimilor în celule, ceea ce duce la reacții lipotoxice, cum ar fi stresul celular (stresul oxidativ și stresul reticulului endoplasmic), activarea inflammasomului și apoptoza celulară și, ulterior, provocând o serie de modificări ale fenotipurilor de țesut hepatic, cum ar fi stimularea inflamatorie, regenerarea țesutului. În ultimii ani, studiile au arătat că autofagia joacă un rol important în prevenirea dezvoltării NAFLD umane. Rezultatele detectării indicelui legate de autofagie la ficatele pacienților cu NAFLD și boală hepatică grasă nealcoolică și ficatul șoarecilor obezi și diete cu conținut ridicat de grăsimi au arătat că procesul de autofagie în hepatocite a fost blocat, ceea ce a dus la acumularea masivă de TG și alte picături lipidice [16]. Alte studii au arătat că, după ce gena cheie 7 a autofagiei hepatocitelor a fost eliminată în mod specific la șoarecii hrăniți o dietă bogată în grăsimi, nivelul de TG în hepatocitele de șoarece a crescut semnificativ [17]. Cu toate acestea, după supraexprimarea genei ATG7 sau a intervenției cu inductori de autofagie, cum ar fi rapamicina și carbamazepina, degenerarea grasă în ficatul de șoarece a fost redusă semnificativ [18-20].
Acest lucru sugerează că degenerarea grasă a ficatului poate fi redusă semnificativ prin îmbunătățirea activității autofagiei hepatice, oferind o strategie eficientă pentru tratamentul NAFLD. Produsele naturale, ca sursă majoră de dezvoltare a medicamentelor noi, sunt utilizate pe scară largă în prevenirea și tratamentul diferitelor boli hepatice. Ca un produs excelent utilizat în mod obișnuit în medicina tradițională chineză, Cistanche Deserticola a atras atenția pe scară largă pentru efectele sale farmacologice, cum ar fi neuroprotecția, imunomodularea, antioxidantul, anticancerul și protecția hepatică. Până în prezent, mai mult de 120 de compuși au fost izolați de Cistanche Deserticola, incluzând glicozide feniletanoide, terpenoizi și glicozide, lignani și glicozide, oligozaharide, poliol și polizaharide [21]. Printre aceștia, glicozidele feniletanoide sunt cea mai studiată clasă de compuși în ingredientele active ale Cistanche Deserticola. ECH și ACT sunt compuși reprezentativi ai glicozidelor feniletanoide cistanChe deserticola, care au efecte pozitive în antioxidanți, protejând ficatul, miocardul, celulele nervoase și îmbunătățirea memoriei [22-23]. Cu toate acestea, nu există un raport de literatură relevant dacă glicozidele feniletanoide Cistanche Deserticola sunt implicate în procesul de autofagie în protejarea ficatului.

Autofagia este un proces de autodegradare care este omniprezent în organism. Este un proces catabolic în care autofagosomii degradează deșeurile metabolice celulare. Procesul de autofagie include, în general, trei procese: inițierea autofagiei, extensia membranei autofagice și formarea lizozomului autofagic, care sunt reglementate în principal de proteina țintă de rapamicină și fosfatidilinositolul -3 căi de semnalizare kinazei. Autofagosomii sunt markeri ai autofagiei celulare. În procesul de formare a autofagosomului, o serie de proteine ​​legate de autofagie, inclusiv Atg5 ~ 12 și LC3, joacă un rol important. Prin urmare, acest studiu a construit un sistem de evaluare a autofagiei, a detectat nivelul de expresie al proteinei marker autofagie LC3 la nivel molecular și a evaluat capacitatea de inducție a autofagiei a două glicozide feniletanoide ale cristancului deserticola în celulele HepG2. Rezultatele au arătat că după adăugarea tratamentului BAFA1 pe baza intervenției inductorului de autofagie rapamicină, LC intracelular 3- ⅱ al celulelor HepG2 a crescut semnificativ, ceea ce indică faptul că sistemul de evaluare a autofagiei poate evalua cu exactitate activitatea de inducție autofagică a medicamentului; După ce Ech și ACT au fost tratate cu BaFA1, expresia proteinei LC 3- ⅱ în celulele HepG2 din grupul ECH+BaFA1 și grupul ACT+BaFA1 a fost semnificativ mai mare decât cel din grupul ECH și grupul ACT, iar diferențele au fost semnificative statistic (P<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and Exercitarea protecției ficatuluiși alte funcții biologice. În al doilea rând, siguranța este o considerație principală în dezvoltarea medicamentelor. Pentru a evalua siguranța ACT, acest studiu a testat în continuare efectul actului asupra viabilității celulelor HepG2. Rezultatele au arătat că viabilitatea celulelor HepG2 a fost aproape neafectată de intervenția cu diferite concentrații de ACT, ceea ce indică faptul că ACT poate fi utilizat ca medicament candidat pentru a studia în continuare efectele farmacologice și mecanismele moleculare.

Autofagia este un proces biologic extrem de conservat în celule, iar modificările ușoare ale concentrațiilor de medicamente vor afecta nivelul autofagosomilor celulari. Pentru a determina în continuare concentrația optimă a ACT pentru a induce formarea autofagosomilor în celulele HepG2, acest studiu a folosit concentrații diferite de ACT combinate cu BaFA1 pentru a trata celulele HepG2 și a detectat nivelul de expresie al proteinei LC 3- ⅱ proteină în celule. Rezultatele au arătat că 50 μmol/L Act ar putea crește semnificativ nivelul de autofagosomi în celulele HepG2. Prin urmare, acest studiu a utilizat 50 μmol/L Act pentru a interveni în modelul de celule NAFLD construit in vitro și a explorat preliminar relația dintre ITSProtecția ficatuluiFuncție și autofagie.
Studiile conexe asupra modelelor de celule NAFLD au arătat că după intervenția in vitro cu acizii grași liberi, nivelul TG al celulelor HepG2 a crescut semnificativ, iar agregarea picăturilor de lipide uleioase ar putea fi observată clar în celulele [24-25]. În acest studiu, 100 μmol/L PA a fost utilizat pentru a interveni în celulele HepG2 in vitro timp de 24 de ore. Nivelul TG al celulelor HepG2 din grupul model a fost semnificativ mai mare decât cel din grupul de control gol. În același timp, agregarea picăturilor lipidice ar putea fi observată clar în celule, ceea ce indică faptul că modelul celulelor NAFLD a fost construit cu succes. Pentru a observa în continuare efectul ACT asupra modelului de celule NAFLD, 50 μmol/L Act a fost utilizat pentru a interveni în modelul de celule in vitro NAFLD in vitro, iar efectul actului asupra NAFLD a fost evaluat prin detectarea nivelului TG și prin colorarea roșie a uleiului. Rezultatele au arătat că după intervenția ACT, nivelul TG și numărul de picături de lipide uleioase în celulele HepG2 au fost semnificativ mai mici decât cele din grupul model, ceea ce indică faptul că ACT are activitatea de a reduce TG în modelul de celule NAFLD induse de PA. Pentru a studia în continuare relația dintre activitatea de scădere a lipidelor ACT și autofagia celulară, acest studiu a folosit LC 3- anticorpi proteici specifici și sonde fluorescente bodipy pentru a co-b-fofagosomi și picături de lipide. S-a observat că numărul de autofagosomi în celulele HepG2 după intervenția ACT a fost semnificativ crescut în comparație cu grupul de control, ceea ce a fost în concordanță cu rezultatele imunoblotării proteice în acest studiu, confirmând în continuare că ACT are o activitate de inducere a autofagiei în celulele HepG2. În plus, după intervenția medicamentelor, autofagosomii intracelulari și picăturile lipidice co-localizate, ceea ce indică faptul că efectul ACT asupra îmbunătățirii degenerarii grase NAFLD induse de PA poate implica implicarea autofagiei celulare. Cu toate acestea, în modelul de celule NAFLD, dacă ACT își exercită activitatea farmacologică de a reduce nivelul TG intracelular pe calea lipofagică trebuie să fie încă explicată în continuare prin blocarea procesului autofagiei intracelulare.
În rezumat, printre cei doi compuși de glicozid feniletanol din Cistanche Deserticola, ACT are o capacitate semnificativă de a induce autofagia în celulele HepG2. În același timp, în modelul de celule hepatice hepatice induse de PA, CT a redus semnificativ nivelul TG în celulele HepG2. După intervenția ACT, autofagosomii și picăturile lipidice din celulele HepG2 au avut o anumită relație de co-localizare, ceea ce indică faptul că autofagia poate fi o nouă cale implicată în procesul farmacologic de ACT în ceea ce privește protecția hepatică. A se vedea figura 5. În studiile ulterioare, mecanismul de acțiune al ACT în scăderea lipidelor va fi studiat în detaliu în detaliu folosind blocanții autofagieni pentru a pune bazele dezvoltării viitoare a medicamentelor.