Stx2 induce expresia genică diferențială și perturbă genele ritmului circadian în tubul proximal Ⅱ

3. Discuție

3.1. Patologia tubulară proximală la pacienții cu STEC și modelele animale

Oliguria este un semn alnecroza tubulara acuta(ATN). Din cauza ATN, celulele epiteliale deformate obstrucționează lumenul tubilor pentru a reduce fluxul de lichid care apare ca oligurie. La pacienții cu STEC, oliguria și anuria sunt adesea constatări care sugerează ATN. Reducerea funcției tubului proximal în stadiile anterioare ale bolii infecțioase STEC a fost demonstrată ca creșteri ale 2MG și NAG urinar [3,33]. B2MG este o proteină mică de 12 kDa care este filtrată liber prin glomeruli și absorbită complet de tubii proximali într-o stare sănătoasă. Cu toate acestea, odată ce tubii proximali sunt deteriorați, cantitatea de 2MG din urină crește, servind astfel ca un biomarker pentru funcția tubulară proximală. NAG este o enzimă lizozomală mare de 130 kDa și principala glucozidază din tubul proximal. Datorită dimensiunii mari, glomerulul nu poate filtra NAG, în timp ce tubii proximali deteriorați secretă NAG în urină. Astfel, o creștere a NAG urinar este un alt biomarker pentru afectarea tubulară proximală. Histopatologia glomerulară, cum ar fi capilarele obstrucționate de fibrină, este o constatare frecventă la pacienții cu STEC; cu toate acestea, datele urinare de mai sus sugerează leziuni tubulare proximale în boala anterioară. De asemenea, urina de la pacienții cu STEC conține gipsuri constând din epiteliu tubular care este rezultatul desprinderii celulelor tubulare proximale deteriorate [1]. La modelele animale, desprinderea celulelor tubulare proximale este adesea găsită atât în ​​infecția cu STEC, cât și în modelele de injecție cu Stx [25–27,34]. În studiul actual, am găsit desprinderea celulelor tubulare proximale în rinichii murini injectați cu Stx2-sugerând alterarea tubulară proximală indusă de Stx2-(Figura 1). De asemenea, am detectat receptorul Stx2 Gb3 atât la șoarece, cât și latubii proximali ai rinichiului umancu expresia laterală luminală care indică o interacțiune directă a Stx2 cu tubii proximali (Figurile 2 și 3). PDK4 fosforilează piruvat dehidrogenaza pentru a-i inhiba activitatea, rezultând o scădere a utilizării glucozei și o creștere a metabolismului grăsimilor ca răspuns la postul prelungit și înfometarea. Protejează celulele epiteliale detașate împotriva morții celulare induse de detașare (anoikis) [35]. PDK4 a avut inițial un vârf la 4 ore, apoi un alt vârf la 8 ore (Figura 5A). S-a redus la 12 ore, dar de acolo a avut o creștere treptată până la 72 de ore cu o schimbare log2-ori și a ajuns la 3 (12-modificare) (Figura 5A). Detașarea celulelor epiteliale a avut loc în celulele tubulare proximale de șoarece injectate cu Stx2-(slăbire) cu morfologie relativ intactă (Figura 1), aceasta poate reflecta reglarea PDK4.

EXTRACT DE CISTANCHE TUBULOSA PULBER PENTRU RINCHI

Deoarece NHERF1 (SLC9A3R1) contribuie la aderența normală a celulelor la matricea extracelulară [36], la organizarea citoscheletului de actină și la menținerea morfologiei celulare, expresia scăzută a acestei gene poate avea consecințe precum desprinderea celulelor (Figura 5K).

Efectul Stx2 asupra tubilor proximali pare un factor atât de important pentru boala infecțioasă STEC; cu toate acestea, modificările în expresia genelor concentrându-se pe celulele tubulare proximale in vivo nu au fost disponibile înainte. Keepers și colab. [37] au arătat gene exprimate diferențial (DEG) în rinichii șoarecilor injectați cu Stx2+LPS, astfel încât majoritatea genelor anterioare și în mare parte modificate au fost din influența LPS și genele care au fost modificate foarte târziu sunt din efectul Stx2. . Datele lor au arătat o perspectivă valoroasă asupra expresiilor genice diferențiale ale rinichilor, dar nu au separat tipurile de celule care au fost responsabile pentru această schimbare. În studiul actual, am încercat să căutăm DEG care sunt asociate cu celulele tubulare proximale comparând datele microarray de la șoarece.rinichi și tubular proximal primar umancelule care au fost tratate cu Stx2.

3.2. Factori tubulari proximali implicați în patologia indusă de Stx2-în relație cu activitățile Stx2 cunoscute în celulele care exprimă Gb3

3.2.1. Activitate (I), Transducția semnalului indusă de legarea Stxs la Gb3

Subunitățile B ale Stxs induc non-receptor src tirozin kinaza Da fosforilarea [4]. Da fosforilat activează moleculele de semnalizare din aval prin activitatea sa kinazei și duce la remodelarea citoscheletului [5]. Fosforilarea proteinei asociate cu Da (YAP) în Y357 de către Yes este cunoscută pentru a induce translocarea nucleară YAP, unde acționează ca un co-activator transcripțional pentru a induce gene țintă, cum ar fi CTGF [38]. Proteinele matricelulare CYR61 (CCN1) și CTGF (CCN2) sunt secretate în matricea extracelulară (ECM) și contribuie la menținerea adeziunii celulă-ECM prin legarea integrinelor receptorilor și proteoglicanilor heparan sulfat (HSPG) atașați la suprafața celulei [39,40]. Molecula cheie a transcripției CCN1 și 2 este YAP și este menținută inactivă (fosforilată la reziduul de serină 127) într-o stare normală sub calea de semnalizare Hippo. Odată ce este detectată o aderență scăzută celulă-celulă, YAP (S127) nu mai este fosforilat, permițându-i să intre în nucleu, iar transcripția CCN1 și 2 crește [41-43]. CCN1 și 2 acționează ca molecule de vindecare a rănilor pentru a repara țesutul pierdut de celule [38,44]. În setul nostru de date, CCN1 și 2 au avut vârfuri mici la un moment de timp anterior (6 ore). Acest lucru poate reflecta activarea Da indusă de legarea Stx2. Orele ulterioare, desprinderea poate declanșa o activare suplimentară a YAP prin oprirea căii de semnalizare Hippo pentru a induce o expresie mai mare a CCN1 și 2 la 12 ore sau mai târziu (Figura 5C).

3.2.2. Activitate (II), Inducerea ER-Stress/UPR

Stxs ajung în ER, unde fragmentele A1 scindate și subunitățile B imită proteinele desfăcute [9,10,45,46]. Proteina reglată cu glucoză de 78 kDa (Grp78, proteina de legare a imunoglobulinei (Bip)) ancorează trei proteine ​​cheie UPR Enzima care necesită inozitol-1 (Ire{-1), kinaza reticulului endoplasmatic asemănătoare protein kinazei R (PERK) ) și activarea factorului de transcripție 6 (ATF6) în membrana ER în timpul stării normale. Cu toate acestea, datorită afinității mai mari a Grp78 față de proteinele desfășurate, eliberează acele proteine ​​ancorate. ATF6 este activat după eliberare și crește ARNm CHOP (DDIT3) și X-box binding protein 1 (XBP-1), în timp ce Ire-1 îmbină ARNm XBP{-1 pentru a produce XBP{{ 22}} proteină, care contribuie la transcripția CHOP (DDIT3). Activarea PERK duce la activarea ATF4 care crește, de asemenea, ARNm CHOP (DDIT3). Prin urmare, o creștere a ARNm CHOP (DDIT3) este un semn distinctiv al UPR [47,48]. Stxs sunt raportate că induc UPR și CHOP (DDIT3) este reglat în sus în setul nostru de date (Figura 5D-G).

GDF15 aparține familiei factorului de creștere transformant beta (TGF). Recent, s-a demonstrat că GDF15 mediază pierderea în greutate indusă de metformină [49]. La șoarecii administrați oral cu metformină, mRNA-ul GDF15 intestinal și renal a fost crescut, rezultând o creștere a GDF15 seric. GDF15 circulant funcționează prin intermediul unui receptor restricționat de trunchi cerebral pentru a suprima aportul de alimente și a reduce greutatea corporală [50]. La șoarecii cărora li s-a administrat metformină, creșterea GDF15 renală este cel puțin parțial sub reglementarea CHOP (DDIT3). În setul nostru de date de rinichi de șoareci injectați cu Stx2-, CHOP (DDIT3) a crescut inițial la 4 ore cu un vârf foarte mic și apoi a început să aibă o tendință de creștere spre 48 de ore, unde a menținut nivelul unui log{{16 }}schimbări de ori în jurul valorii de 1,3 (Figura 5E). Conform analizei clusterului STRING, GDF15 primește input activ de la factorii de transcripție CHOP (DDIT3) și ATF3 (Figura 5E) [51,52]. Greutatea murină injectată cu Stx2-a început să scadă sau să se abate de la controlul salin după 24 de ore (Figura S3B). O creștere a ARNm GDF15 în rinichi la 12 ore poate să fi influențat trunchiul cerebral să reducă aportul de alimente, care la rândul său a apărut ca o pierdere în greutate (Figurile 5E și S3B). Deoarece nivelul de expresie GDF15 a continuat să fie ridicat după 24 de ore, șoarecii au continuat să piardă în greutate (Figurile 5E și S3B).

La stresul ER, PERK este eliberat din Grp78 (Bip) și se oligomerizează pentru a fosforila și a inhiba eIF2, ceea ce duce la reprimarea translației globale, cu excepția câtorva proteine ​​care răspund la UPR, cum ar fi ATF4, CHOP și Grp78. GADD34 (subunitatea de reglare a proteinei fosfataza 1 15A (PPP1R15A)) este una dintre proteinele crescute sub inhibarea asociată cu eIF2 fosforilat (eIF2 (P)) și suprareglată în setul nostru de date (Figura 5D, G). GADD34 este o proteină fosfatază-1 care defosforilează eIF2 (P) pentru a regla negativ inhibarea sintezei proteinelor indusă de UPR [53]. Expresia GADD34 (PPP1R15A) devine o modificare log2-ori mai mare de 1 după 12 ore de Stx2 în setul nostru de date și continuă să crească până la 24 de ore când se stabilește (modificarea log2-fold este egală cu 2,1) și menține acest lucru nivel până la sfârșit (Figura 5D,G). Acest lucru sugerează că UPR2-indusă de Stx a avut feedback negativ după 12 ore. Creșterea transcripției și traducerii CHOP (DDIT3, GADD153) este un semn distinctiv al stresului ER și modelul de expresie diferențială seamănă cu GADD34, cu excepția faptului că log2 mai mare decât 1 apare după 24 de ore și apoi se stabilește treptat (log2 este egal cu 1,3) (Figura 5D, G). De asemenea, CEBPB, partenerul de dimerizare predominant al CHOP, este reglat în sus în setul nostru de date (Figura 5D, G). Aceste rezultate sugerează că, în timp ce stresul ER indus de Stx2-începe de la foarte devreme în cursul timpului, el crește efectul până la 24 de ore și menține acest nivel de stres ER până la sfârșit, în timp ce un braț cu feedback negativ se echilibrează, de asemenea, simultan.

3.2.3. Activitatea (III), Activitatea proteinei de inactivare a ribozomilor (RIP).

Prin scindarea unei adenine din ARNr, Stxs inhibă sinteza proteinelor de novo. ARNr depurinat influențează alterarea morfologiei ribozomale, care activează transducția semnalului [11] cunoscut sub numele de răspuns la stres ribotoxic (RSR), conducând la activarea genei caracteristice (vezi paragraful următor).

3.2.4. Activitate (IV), Activitate de răspuns la stres ribotoxic (RSR).

ZAK (un MAPKKK) este kinaza cunoscută în RSR și activează în aval JUN N terminal kinaza (JNK) și căile p38 MAPK [12,15]. Stx1 induce expresia ARNm JUN și FOS în celulele epiteliale intestinale umane și acest eveniment a necesitat Stx1 pozitiv pentru activitate RIP despre care se crede că este sub control RSR [15]. O altă moleculă RSR în aval, p38 MAPK, este cunoscută că induce gene de răspuns timpuriu, cum ar fi JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 și ATF3 [54], toate acestea fiind exprimate diferențiat în setul nostru de date. Căile JNK și p38 MAPK sunt, de asemenea, cunoscute ca fiind activate evenimente în aval ale Ire-1 sub UPR (Figurile 4B, D și 5B, E, F) [47]. Din acest motiv, Stx-urile pot activa aceste două căi prin RSR și/sau UPR. Calea kinazei reglate de semnal extracelular (ERK) 1/2 este, de asemenea, demonstrată a fi în aval de RSR [55] și se știe că gena DUSP1 (MKP1) este indusă de calea ERK1/2 [56]. Stx1 și anisomicină (un alt inhibitor al sintezei proteinelor) sunt capabile să inducă expresia DUSP1 în celulele Caco-2 [57]. În setul nostru de date, expresia DUSP1 a fost indusă și acest lucru poate indica activarea ERK1/2 (Figura 4B, D).

3.2.5. Activitate (V), transcrierea genelor particulare care duce la citokine

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 după 24 și, respectiv, 48 de ore (Figura 5F). Acest lucru sugerează că sunt induse gene hat sub ambele căi NF-kB, IkB (clasică) și RelB (alternativă). Deoarece expresia diferențială CHOP (DDIT3) depășește log2 mai mare decât 1 după 24 de ore, rinichiul de șoarece suferă UPR, astfel că PERK activat fosforilează factorul de inițiere a translației eucariote 2 subunitatea alfa (eIF2) pentru a inhiba translația NFKBIA [60]. Din acest motiv, este posibil ca o creștere a ARNm NFKBIA să nu inhibe o mare parte a căii NF-kB, astfel încât transcrierea factorilor inflamatori este permisă (Figura 5L).

Sobbe et al. [61] a arătat că atât căile clasice (RelA-p50) cât și cele alternative (RelB-p52) NF-κB au fost active la șoarecii injectați cu Stx, detectând reglarea în creștere a citokinelor țintă RelA CCL20, CXCL1 și CXCL10, care au fost, de asemenea, exprimate diferențiat în set de date (Figura 5L).

3.2.6. Activitate (VI), apoptoză indusă de Stxs

Caspaza 3 scindată a fost găsită în moartea celulară asociată cu Stxs [13,15,62]. S-a demonstrat că activarea caspazei-3 sau inducerea apoptozei de către Stxs are loc în contextul RSR și UPR. În RSR indusă de Stxs, sunt implicate atât căile p38 MAPK, cât și JNK [15], precum și activarea ERK [55]. Pe de altă parte, se știe că UPR induce căile NF-kB, JNK și p38 MAPK. CHOP (DDIT3) sub UPR este implicat în apoptoză [63] și a fost demonstrat, de asemenea, în apoptoza asociată Stxs [13]. Implicarea JNK în apoptoza indusă de UPR a fost, de asemenea, raportată [64]. În setul nostru de date, mai multe DEG, cum ar fi CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN și JUNB sunt implicate în RSR și UPR (Figura 5B, F).

3.3. Dereglarea circadiană de către Stx2

O creștere a endotelinei serice-1 (ET-1, EDN1) apare la pacienții cu STEC-HUS [65]. De asemenea, experimental, Stx2 induce expresia EDN1 prin activarea cascadelor de transducție a semnalului care implică MAPK-uri [66], în timp ce UPR este cunoscut că induce transcripția EDN1 [67]. În setul nostru de date, expresia EDN1 indusă de tratament Stx2 atât în ​​rinichiul de șoarece, cât și în celulele tubulare proximale umane (Figura 5G). Deoarece expresia genei EDN1 a fost un numitor comun al rinichilor de șoarece și al celulelor epiteliale tubulare proximale umane, arată că expresia EDN1 are loc, cel puțin parțial, în celulele epiteliale tubulare proximale in vivo în plus față de celulele endoteliale. De asemenea, ET-1 secretat induce expresia EGR1 prin activarea MAPK [68]. Datele noastre confirmă reglarea în sus a EGR1 în sincronizare atunci când EDN1 este reglată (Figura 5H). EGR1 induce expresia PER1 a factorului cheie al ritmului circadian [69], ajustând astfel amplitudinea altor factori circadieni (Figura 5H).

În reglarea circadiană, heterodimerul CLOCK-BAML1 (ARNTL) reglează pozitiv PER1 și CRY1. În schimb, heterodimerul PER1-CRY1 se leagă de CLOCK-BAML1 (ARNTL) pentru a suprima transcripția ulterioară proprie, făcând astfel o buclă negativă a ritmului circadian. Astfel, vârfurile de expresie ale genelor regulatoare pozitive (CLOCK și BAML1 (ARNTL)) și ale genelor regulatoare negative (PER1 și CRY1) au loc într-o oră alternativă, când CLOCK și BAML1 (ARNTL) au o creștere a expresiei, PER1 și CRY1 sunt scăzute, iar modelul se schimbă în următoarele ore. Când am adăugat valorile de modificare a log2-foldului CLOCK și BAML1 (ARNTL) la grafic (Figura 5J), în perioadele de timp anterioare, PER1 și BAML1 (ARNTL) au prezentat un model ritmic opus, cu vârfuri ascuțite/înguste, totuși, după 24 de ore vârfurile au început să devină plictisitoare și să crească continuu fără ritm. Acest lucru implică faptul că Stx2 a influențat ritmul circadian renal, inclusiv în interiorul tubilor proximali. Deși este nevoie de un alt experiment de confirmare, datele noastre combinate cu literatura publicată care descrie efectul PER1 asupra reglării circadiane renale asupra stimulilor [70,71], sugerează o posibilă implicare a Stx2 în tulburările de ritm circadian și efectele asupra funcțiilor tubulare proximale prin reducerea genelor ceasului renal. factori reglați, cum ar fi SGLT1 (SLC5A1) (Figura 5K). Într-adevăr, am observat glucozurie la șoareci injectați cu Stx2-care se reproduc într-un alt studiu cu șoareci injectați cu Stx1-[21] indicând disfuncția SGLT1 (SLC5A1) în tubii proximali (Tabelul 3). Din câte știm, acesta este primul raport care indică implicarea Stx2 în tulburarea ritmului circadian renal.

4. Concluzii

Am determinat gene importante referitoare la expresiile asociate tubilor proximali care au fost modificate de Stx2. Se presupune că expresia diferențială a acestor gene este rezultatul activităților Stx2, cum ar fi inducția UPR, RSR asociată depurinării ARNr și transducția semnalului indusă de legarea receptorului Gb3 de membrană plasmatică. Gena cel mai puternic exprimată, GDF15, poate influența pierderea în greutate cauzată de Stx2 prin receptorii restricționați de trunchiul creierului prin reducerea aportului de alimente. Matricea extracelulară și aderența celulară pot fi influențate de PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 și CTGF care provoacă histopatologie specifică Stx2-și deformare. Mai mult, perturbarea ritmului circadian renal de către Stx2 poate duce la defecte funcționale tubulare proximale, cum ar fi reabsorbția glucozei.

5. Materiale și Metode

5.1. Animale Soareci

(C57BL/6, bărbat, 19–22 g, fără agent patogen specific) au fost achiziționate de la Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japonia). Mâncarea și apa au fost date ad libitum. Șoarecii au fost menținuți cu un ciclu standard de 12 h: 12 h lumină-întuneric în care lumina este aprinsă la ora 7 dimineața și stinsă la ora 19. Temperatura camerei animalelor a fost menținută în jur de 24 °C. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul de îngrijire a animalelor universitar.

5.2. Țesut renal uman

În acest studiu a fost folosit țesut cadavru fără niciun identificator personal și este considerat scutit de ghidurile de investigație umană ale Universității.

5.3. Cultură de celule

Cultura primară de celule epiteliale tubulare proximale renale umane (RPTEC) a fost achiziționată de la Clonetics (Walkersville, MD, SUA) și menținută la 37 ◦ C, atmosferă de 5% CO2. Celulele au fost cultivate într-un mediu de creștere a celulelor epiteliale renale suplimentat cu factor de creștere epidermică uman, hidrocortizon, epinefrină, insulină, tri-iodotironină, transferină, GA-1000 și FBS.

5.4. Purificarea Stx2 fără LPS Îndepărtarea LPS din Stx2 a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [72]. Pe scurt, coloana conjugată cu anticorpi anti-Stx2 11E1{0 a fost utilizată pentru a obține fracția Stx2, iar fracțiunea a fost trecută ulterior prin Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, SUA) pentru a elimina LPS. Fracția Stx2 a fost filtrată cu un filtru 0.2 µm și nivelul LPS a fost testat cu testul de lizat de amebocite Limulus (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, SUA). Fracția Stx2 a fost determinată ca având mai puțin de 0,03 unități de endotoxină (EU)/mL. Tipul de variantă Stx2 a fost Stx2a.

5.5. Administrarea Stx2 la șoareci O doză de 2LD50 (5 ng Stx2/20 g greutate corporală), care ucide șoarecii în patru zile (Figura S3A), a fost injectată la șoareci intraperitoneal într-un volum de 0,1 ml în soluție salină fără LPS (Otsuka pharmaceutical, Japonia). Injectarea de toxină a fost făcută între orele 7 și 9 dimineața, în care șoarecii cu un curs mai lung au primit Stx2 la ora 7 dimineața și urmat de prelevarea de probe la 24, 48 și 72 de ore la ora 7 dimineața.

5.6. Colectarea urinei și măsurarea glucozei în urină După 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60 și 84 de ore de injectare cu Stx2, s-a prelevat urină și s-au aruncat 10 µL pe lama chimică uscată Fuji GLU- P III (FUJIFILM, Kanagawa, Japonia) și glucoza din urină au fost măsurate cu Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) la unitatea administrată de. Urina de la injectarea pre-Stx2 a fost folosită ca probă de 0 h. Colectarea urinei a fost efectuată cu doi șoareci

5.7. Procesarea țesuturilor După 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 și 72 de ore de injectare cu Stx2, trei șoareci pe moment au fost eutanasiați de CO2 și rinichii au fost colectați. Jumătate dintr-un rinichi a fost fixat cu soluție salină tamponată cu paraformaldehidă/fosfat 4% timp de 7 zile la 4 °C și prelucrat pentru secțiunea de parafină. O altă jumătate din rinichi a fost folosită pentru extragerea ARN-ului pentru analiza microarray. Trei șoareci fără niciun tratament au fost utilizați ca martor normal (naiv sau 0 h). Trei șoareci au fost injectați cu PBS (vehicul) și sacrificați la 72 de ore și au servit drept vehicul de control pentru a arăta că există modificări neglijabile în expresiile genelor în comparație cu controlul normal.

5.8. Colorarea periodică cu acid Schiff (PAS) Secțiunile de parafină au fost hidratate și colorate cu soluție de acid periodic 0,5%, urmată de o clătire cu apă distilată. Secțiunile au fost transferate în reactiv Schiff. După ce secțiunile au fost spălate bine cu soluție de bisulfit de sodiu 0,6%, acestea au fost contracolorate cu hematoxilină.

5.9. Tratamentul Stx2 în celulele RPTEC umane RPTEC au fost tratate cu 10 ng/mL de Stx2 timp de 6, 13 și 19 ore la 37 °C, 5% CO2. RPTEC fără tratament Stx2 a fost utilizat ca martor. Două replici biologice au fost efectuate pe punct de timp. După spălarea cu PBS, celulele au fost utilizate pentru extracția ARN.

5.10. Colorarea prin imunofluorescență cu plutire liberă Pentru prelucrarea secțiunii cu plutire liberă, un șoarece normal a fost fixat prin perfuzie așa cum este descris în Obata și colab. [69]. Rinichii murini au fost apoi disecați și scufundați în 4% PFA/PBS timp de 3 ore la 4 ◦ C cu agitare ușoară. Țesuturile au fost spălate cu PBS și crioprotejate cu 30% zaharoză/PBS la 4 ◦ C peste noapte sau până la scufundarea în fund. Secțiunile groase congelate (50 µm) au fost tăiate cu microtom glisant cu setări înghețate. Secțiunile au fost blocate cu anticorp IgM de capră anti-șobolan 1:50 în PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, SUA) timp de 1 oră și incubate cu anticorp anti-Gb3/CD77 1:100 în blocarea soluție sau izotip de control (IgM de șobolan) într-o concentrație egală ca anticorp primar pentru peste noapte la 4 ◦C. După spălare, secțiunile au fost incubate cu un anticorp secundar (IgM anti-șobolan Alexa Fluor 488, diluție 1:2000 în PBS) timp de 2 ore la 4 °C. Secțiunile au fost colorate pentru alte sonde AQP1 (diluție 1:1000, Sigma-Aldrich Japonia, Tokyo, Japonia) și CD31 (550274, diluție 1:50, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SUA) cu anticorpi secundari anti-iepure IgG Alexa Fluor 546 (diluție 1:2000 în PBS) și respectiv IgG anti-șoarece Alexa Fluor 647 (diluție 1:2000 în PBS). După spălarea cu PBS, colorarea cu 40 ,6-Diamidino{-2-fenilindol (DAPI, D21490, Thermo Fisher) a fost făcută timp de 15 minute la 4 ◦C. Secțiunile au fost scufundate în fluide într-un godeu al plăcii de 96-puțuri (în formă de U) cu un fard mic de pictură de fiecare dată când soluția a fost schimbată. Etapa de spălare a fost efectuată în godeuri mai mari, cum ar fi în plăci de godeuri 12- sau 6-. S-a folosit mediu de montare apos pentru acoperirea lamelelor. Pentru prepararea țesutului uman, rinichiul post-mortem a fost fixat în formol 20% timp de 2 săptămâni și s-a procesat pentru prepararea liberă, așa cum s-a făcut pentru țesutul de șoarece, cu o excepție, anticorpul anti-uman CD31 (CBL468, diluție 1:20, Merck KGaA, Darmstadt). , Germania) a fost folosit.

5.11. Analiza Microarray

Jumătate din rinichi este scufundat în 2 mL de RNALater (Ambion, Austin, TX, SUA) la 4 ◦C și ARN total a fost extras cu kitul Rneasy Midi (Qiagen, Santa Clarita, CA, SUA). Au fost utilizate matrice Mouse Genome 430A 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, SUA). Fișierele CEL au fost obținute și normalizate cu o medie robustă cu mai multe cipuri (RMA), calculul numerelor de copii ARN și modificările de ori față de 0 h au fost efectuate în R (v.3.6.0) cu pachetul său affy [73] și RankProd 2.0 [74]. Datele sunt afișate în valorile modificării jurnal2-fold. Setul de date este depus în Gene Expression Omnibus (GEO) (număr de acces GSE172465). Din celulele RPTEC, ARN-ul total a fost extras cu RNAgents Total ARN Isolation System (Promega, Tokyo, Japonia). Microarray de oligonucleotide a genomului uman întreg (microarray de oligonucleotide 44K, Agilent Technologies, Tokyo, Japonia) a fost utilizat pentru experimente cu microarray. Probele totale de ARN au fost utilizate pentru prepararea sondelor de ADNc marcate Cy5- și Cy3-. Probele marcate cu fluorofor au fost hibridizate pe fiecare lamă de sticlă și spălate, apoi scanate cu un scaner cu microarray ADN (model G2505A; Agilent Technologies). Software-ul Extracție și analiză a imaginilor (Agilent Technologies) a fost folosit pentru a localiza și delimita fiecare punct din matrice și pentru a integra intensitățile, care au fost apoi filtrate și normalizate prin utilizarea metodei de netezire a graficului de dispersie ponderat local. Reproductibilitatea analizei microarray a fost evaluată prin două repetări de schimb de colorant în fiecare experiment. Au fost comparate diferențele în expresia ARNm între control și RPTEC tratat cu Stx2-recoltat la 6, 10 sau 19 ore. Datele în format TXT din software-ul GeneSpring au fost folosite pentru a determina numele genelor din ID-ul sondei și pentru a converti modificările de ori în jurnal2-modificări. Setul de date este depus la GEO (Număr de acces GSE172466).

5.12. Analiza bioinformatică a datelor de micromatrice și vizualizare Atât în ​​datele de rinichi de șoarece, cât și în datele de micromatrice RPTEC, genele care sunt comune ambelor și în care modificarea expresiei a fost mai mare de 2-ori scădere sau creștere (sau log2-modificare este fie mai mic decât -1 sau mai mare decât 1) în orice moment au fost selectate de R. Mai mult, în datele de microarray de rinichi de șoarece. Modificările genelor care se potrivesc cu curbele cubice au fost alese utilizând pachetul R maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/maSigPro.html (ultima accesare pe 4 ianuarie 2022)] [75]. Curba cubică este potrivită pentru a găzdui creșterea sau scăderea acelor gene pe parcursul unui curs de timp. Un grad polinom mai mare, cum ar fi o curbă cubică, permite selectarea genelor cu modificări multiple în timpul cursului mai bine decât o curbă pătratică. Genele care s-au comportat după o traiectorie similară au fost grupate, iar modelele lor de scădere/creștere au fost vizualizate printr-o hartă termică folosind pachetul R gplots [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (accesat ultima dată pe 4 ianuarie). 2022)] [76]. A fost atribuită ontologiei genelor (GO) și funcțiile GO dintre genele comune au fost îmbogățite folosind Metascape [http://metascape.org (ultima accesare la 4 ianuarie 2022)] [77]. Conexiunea/relația genelor comune au fost analizate folosind STRING [https://string-db.org/ (ultima accesare la 4 ianuarie 2022)] [78]. Asocierea dintre genele comune a fost căutată manual, precum și folosind funcția de extragere a textului STRING.

Referințe

1. Gianantonio, C.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Rutty, A.; Mendilaharzu, J. Sindromul hemolitic-uremic.J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. Vitsky, BH; Suzuki, Y.; Strauss, L.; Churg, J. Sindromul hemolitic-uremic: Un studiu al modificărilor patologice renale.A.m. J. Pathol.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T.; Dohi, S.; Igarashi, T.; Yamanaka, T.; Yoshiya, K.; Kobayashi, N. Deteriorarea de către verotoxină a funcției tubulare contribuie la afectarea renală observată în sindromul hemolitic uremic.J. Infectează.1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. Katagiri, YU; Mori, T.; Nakajima, H.; Katagiri, C.; Taguchi, T.; Takeda, T.; Kiyokawa, N.; Fujimoto, J. Activarea kinazei familiei Src da indusă de legarea toxinei Shiga la globotriaosil ceramida (Gb3/CD77) în microdomenii de densitate scăzută, insolubile în detergent.J. Biol. Chim.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. Takenouchi, H.; Kiyokawa, N.; Taguchi, T.; Matsui, J.; Katagiri, YU; Okita, H.; Okuda, K.; Legarea toxinei Fujimoto, J. Shiga la globotriaosyl ceramida induce semnale intracelulare care mediază remodelarea citoscheletului în celulele derivate din carcinomul renal uman.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [PubMed] 

6. Garred, O.; van Deurs, B.; Sandvig, K. scindarea indusă de furin și activarea toxinei Shiga.J. Biol. Chim.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. Majoul, I.; Ferrari, D.; Söling, HD Reducerea legăturilor disulfurice proteice într-un mediu oxidant. Puntea disulfurică a subunității A a toxinei holerice este redusă în reticulul endoplasmatic.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. Spooner, RA; Watson, PD; Marsden, CJ; Smith, DC; Moore, KAH; Cook, JP; Doamne, JM; Roberts, LM Izomeraza disulfură proteică reduce ricina la lanțurile sale A și B din reticulul endoplasmatic.Biochim. J.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. Yu, M.; Toxina Haslam, DB Shiga este transportată din reticulul endoplasmatic după interacțiunea cu chaperonul luminos HEDJ/ERdj3.Infecta. Imun.2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. Falguieres, T.; Johannes, L. Subunitatea B toxina Shiga se leagă de chaperona BiP și de proteina nucleolară B23.Biol. Celulă2006, 98, 125–134. [CrossRef]