Stx2 induce expresia genică diferențială și perturbă genele ritmului circadian în tubul proximal

Rezumat: Escherichia coli producătoare de toxină Shiga(STEC) provoacă defecte tubulare proximale în rinichi. Cu toate acestea, factorii modificați de toxina Shiga (Stx) în tubii proximali nu au fost încă indicați. Am determinat receptorul Stx Gb3 în rinichii murini și umani și am confirmat expresia receptorului în tubii proximali. Stx2-a injectat țesuturi renale de șoarece șiCelule epiteliale tubulare proximale renale primare umane tratate cu Stx2-(RPTEC) au fost colectate și a fost efectuată analiza microarray. Am comparat matricele de rinichi murini și RPTEC și am selectat 58 de gene comune care sunt exprimate diferențial față de control (0 h, fără tratate cu toxină). Am descoperit că gena cel mai puternic exprimată a fost GDF15, care poate fi implicată în pierderea în greutate indusă de Stx2-. Genele asociate cu activitățile Stx2 raportate anterior, cum ar fi src kinaza, activarea căii de fosforilare, răspunsul proteic desfășurat (UPR) și răspunsul la stres ribotoxic (RSR) au prezentat expresii diferențiate. În plus, genele ceasului circadian au fost exprimate diferențial, sugerând tulburări ale ritmului circadian renal indus de Stx2-. Transportorul de Na+ -glucoză tubular proximal reglat de ritm circadian SGLT1 (SLC5A1) a fost reglat în jos, indicând deteriorarea funcțională a tubularului proximal, iar șoarecii au dezvoltat glucozurie confirmând disfuncția tubulară proximală. Stx2 modifică expresia genelor în tubii proximali murini și umani prin activități cunoscute și tulburări de ritm circadian recent investigate, care pot duce la disfuncții tubulare proximale.

Cuvinte cheie:Toxina Shiga tip 2 (Stx2);tubul proximal renal; mouse; celula epitelială tubulară proximală renală umană (RPTEC); microarray; ritm circadian

Contribuție cheie:Au fost analizate gene exprimate diferențial din rinichii de șoarece tratați cu Stx2-și celulele tubulare proximale umane primare. În plus față de genele afectate Stx2-cunoscute anterior, s-a demonstrat că genele asociate ritmului circadian își modifică expresia și au o influență asupra funcției tubulare proximale.

1. Introducere

Escherichia coli producătoare de toxină Shigainfecția (STEC) cauzează simptome severe ale sindromului hemolitic uremic (SHU), care este definită de triada insuficienței renale acute, trombocitopenie și anemie hemolitică [1]. Se crede că toxinele Shiga (Stxs) joacă un rol major în deteriorarea celulelor din această boală infecțioasă. Histopatologia renală caracteristică a HUS include leziuni glomerulare și tubulare, cum ar fi depunerea de fibrină capilară în glomeruli și respectiv necroza tubulară [1,2]. Apariția precoce a disfuncției în tubii proximali ai pacienților infectați cu STEC a fost raportată prin analiza urinei. Markerii urinari funcționali tubulari proximaliN-acetil glucozaminidaza(NAG) și 2 microglobuline (2MG) din urina în stadiul acut la pacienții cu STEC O{2}} sau O111-asociat cu STEC au fost măsurate ca fiind foarte crescute, sugerând o disfuncție tubulară proximală precoce [3].

Stxs, inclusiv Stx2, constau dintr-o singură subunitate A și cinci subunități B (toxina A1B5), în care subunitatea A posedă activitate enzimatică depurinând adenina 4324 din ARNr 28S a subunității ribozomului 60S, în timp ce subunitățile B sunt necesare pentru a lega celulele gazdă prin globotriaosilceramidă. (Gb3). Există mai multe influențe cunoscute pe care Stx-urile le exercită asupra celulelor. (I) Prin legarea de receptorul său Gb3, toxina provoacă transducția semnalului prin kinaza familiei Src Da [4,5]. După legarea de receptor, Stx-urile se internalizează în celulă prin endocitoză și sunt transportate retrograd în ER. Stxs trec prin endozom și prin aparatul Golgi unde subunitatea A este scindată între fragmentele catalitice A1 și C-terminal A2 de către furină [6], deși fragmentele A1 și A2 sunt încă conectate cu o legătură disulfurică. Toxina ajunge în RE și legătura disulfurică poate fi redusă; apoi, un fragment A1 din holotoxină este eliberat [7,8]. Acesta este momentul în care influența (II) stresul ER are loc cu fragmente de toxine care imită proteinele desfășurate, care induc răspunsul proteic nepliat (UPR). Ambele subunități A și B sunt capabile să lege Bip, ceea ce indică inducerea stresului ER [9,10]. Fragmentul A1 clivat este translocat în citoplasmă și depurează o adenină din ARNr 28S la (III) inhibă sinteza proteinelor. Modificarea Stxs cauzată de ARNr 28S induce (IV) răspuns la stres ribotoxic (RSR), care activează cascada de semnalizare în aval [11]. Se știe că influențele (II) și/sau (IV) induc (V) transcripția genică particulară care duce la secreția de citokine [12]. De asemenea, (II) și (IV) sunt implicate în (VI) apoptoza indusă de Stxs [13–15].

Experimentele in vitro care utilizează tubuli proximali umani și modele de șoareci in vivo conectează puternic leziunile tubulare proximale la Stxs. Atât culturile primare, cât și liniile celulare ale tubilor proximali umani sunt foarte susceptibile la Stxs și prezintă eliberare de citokine și moarte celulară, inclusiv apoptoză [16-20]. Celulele epiteliale tubulare proximale renale primare umane (RPTEC) exprimă receptorul Gb3, sunt foarte sensibile la toxinele Shiga și au fost folosite în multe articole pentru a analiza reacții biologice, cum ar fi inhibarea sintezei proteinelor, producția de citokine și inducerea apoptozei [17,20] . Șoarecii injectați cu toxină Shiga de tip 1 (Stx1) au prezentat glucozurie, ceea ce indică o reabsorbție scăzută a glucozei de către tubul proximal [21]. Acestea sugerează toxicitatea Stxs pentru tubii proximali atât in vitro, cât și in vivo. În modelele de șoareci infectați cu STEC, constatările frecvente în histopatologie sunt necroza celulelor epiteliale tubulare și celulele deformate în lumenul tubilor proximali [22-24]. Șoarecii injectați cu Stx purificat (fie Stx1, fie Stx2) prezintă, de asemenea, desprinderea tubilor proximali cu nuclee relativ intacte [25-27].

Deși leziunile tubilor proximali asociate cu injecția cu Stx sau infecția cu STEC au fost descrise funcțional și histologic, țintele genelor implicate în leziunea tubilor proximali nu au fost încă prezentate.

Aici am analizat expresiile genelor în rinichii de șoarece injectați cu Stx2-și în cultura de celule epiteliale tubulare proximale renale umane primare (RPTEC) tratate cu Stx2-pentru a arăta modificări ale genelor asociate tubului proximal induse de Stx2.

2. Rezultate

2.1. Stx2-Patologia rinichilor de șoarece injectat

Pentru a identifica patologia renală murină asociată cu Stx{{{0}}, secțiunile de țesut renal de la șoarecii injectați cu Stx{2-au fost colorate cu Periodic Acid-Schiff (PAS). O pată roz puternică clară pe partea luminală a celulelor epiteliale tubulare indică glicocalixul marginii periei, care este caracteristic celulelor tubulare proximale. Am determinat celulele/nucleii din afara glicocalixului (în spațiul luminal) ca fiind detașați de celulele învecinate și membranele bazale (adică, celulele sloughed). În Figura 1B (8 ore după Stx2), C și D (48 ore după Stx2), celulele slăbite cu nuclee relativ intacte sunt prezentate cu săgeți. Am observat, de asemenea, resturi celulare în lumenul tubular proximal (Figura 1 vârfuri de săgeți). După administrarea Stx2, aceste leziuni au apărut destul de clar, în timp ce la 0 h (Figura 1A, fără Stx2), au fost neglijabile.

Figura 1. Stx2 induce desprinderea celulelor tubulare proximale în rinichiul murin. Sunt prezentate petele de acid periodic Schiff (PAS) ale secțiunilor de rinichi murin injectate cu Stx2-. (A) 0 h (naiv), (B) 8 h și (C) 48 h după injectarea Stx2. Săgețile indică desprinderea celulelor tubulare proximale. Vârfurile de săgeată indică resturile celulare. Un câmp mărit în interiorul (C) este afișat în (D) cu celule de desprindere îndreptate cu săgeți. Barele în (A–C) indică 50 µm. Bara de scară din (D) indică 10 µ

2.2. Expresia Gb3 la șoarece și rinichi umani

2.2.1. Mouse Renal Cortex Gb3 Expressie

Deoarece celulele tubulare proximale au prezentat leziuni histologice de la insulta Stx2, am testat expresia globotriaosilceramidei receptorului Stx2 (Gb3) în cortexul renal murin împreună cu un marker tubular proximal acvaporin-1 (AQP1). După cum se arată în Figura 2, celulele AQP1-pozitive au prezentat pozitivitate Gb3 mai ales în partea luminală a celulelor (celulele sunt marcate cu vârfuri de săgeți închise, în timp ce lumina sunt marcate cu asteriscuri). Am observat, de asemenea, că petele tubulare negative AQP1 Gb3 probabil colectează celule de conducte (Figura 2 vârf de săgeată deschis), așa cum s-a raportat [28]. Intensitatea colorării Gb3 a fost mai puternică în celulele AQP1 (-), cu toate acestea, numărul acestui tip de tubuli a fost mai mic în comparație cu tubulii proximali dublu pozitivi Gb3/AQP1 din cortex. Celulele endoteliale CD31-pozitive sunt Gb3 negative în rinichiul de șoarece. Un control de anticorpi potriviți cu izotip pentru Gb3 (IgM de șobolan) a fost utilizat ca martor negativ. IgM de șobolan nu a reacționat cu țesutul de rinichi de șoarece (Figura S1)

2.2.2. Expresia Gb3 a cortexului renal uman

În țesutul renal uman, Gb3 a fost, de asemenea, pozitiv în tubii proximali AQP1-pozitivi (Figura 3, vârfuri de săgeți închise). Localizarea Gb3 în celulele tubulare proximale a fost mai puternică pe partea luminală. Am observat, de asemenea, celule AQP1(-)Gb3(+) (Figura 3, vârfuri de săgeți deschise) așa cum am făcut în țesutul murin. Celulele endoteliale umane exprimă Gb3 (CD31/Gb3 dublu pozitiv, Figura 3, asterisc). Secțiunile de control izotip cu IgM de șobolan nu au prezentat o reacție pozitivă în țesutul renal uman (Figura S2).

2.3. Analiza Microarray

Deoarece atât celulele epiteliale tubulare proximale de șoarece, cât și cele umane sunt pozitive pentru Gb3, sugerează că acest tip de celulă este afectat direct de Stx2. Pentru a determina genele afectate Stx2-în celulele tubulare proximale murine și umane, am extras ARN total din rinichii șoarecilor injectați cu Stx2-și RPTEC-urile primare umane tratate cu Stx{2-și am analizat expresia genelor prin microarray

2.3.1. Gene exprimate diferențiat atât în ​​rinichiul de șoarece, cât și în RPTEC

Au fost selectate gene exprimate diferențial (DEG), care sunt comune atât rinichilor de șoarece, cât și RPTEC. Baza selectării DEG-urilor comune este aceea că (1) gene cu modificare log2-fold (față de 0 h) mai mult de 1 sau mai puțin de -1 atât în ​​rinichiul de șoarece, cât și în micromatrice RPTEC, cel puțin într-un singur punct de timp și (2) distribuția log2-modificării unei gene se potrivește mai degrabă cu curbele cubice decât cu curbele pătratice pentru a se adapta mai bine la vârfurile de expresie a genelor la mijlocul cursului de timp în microarrayul de rinichi. Cu cele două criterii de mai sus, am selectat 58 de gene comune între rinichiul de șoarece tratat cu Stx2-și RPTEC uman (Figura 4A). Modelele de expresie ale acestor 58 de gene în rinichiul de șoarece sunt prezentate într-o hartă termică (Figura 4B). Cele mai multe gene au fost upregulated la ore mai târziu după injectarea Stx2; cu toate acestea, unele gene au avut modele de expresie anterioare. Genele care au avut mai mult de 1 schimbare în log2-fold au fost enumerate pentru fiecare punct de timp (Tabelul 1).

Figura 4. Analiza microarray. (A) Printre genele analizate prin microarray, 147 de gene (cercuate cu verde) și 4013 gene (cercuite cu roșu) de la rinichi de șoarece tratat cu Stx2-și, respectiv, RPTEC, au fost detectate ca având log{ {4}}modificarea ori mai mică de -1 sau mai mult de 1. Genele care au fost modificate prin tratamentul Stx2 împotriva 0 h în ambele micromatrice (gene comune exprimate diferențial/DEG) au totalizat 58 (zonă suprapusă roșu și verde). (B) Harta termică a celor 58 de gene comune este afișată în cronologia de prelevare a rinichilor de șoarece. Z este egal cu 0 reprezintă o medie a valorilor log2-modificării unei gene și reflectă o tendință a expresiei genei. Astfel, o culoare verzuie reprezintă o valoare mai mică decât media unei anumite gene într-un rând, în timp ce o culoare roșiatică reprezintă o schimbare peste medie. Datele log2-fold ale celor 58 de gene din setul de date de 72 de ore injectat cu PBS în comparație cu 0 h sunt prezentate ca tabel S3 pentru referință. (C) Este afișat graficul cu bare de îmbogățire Metascape GO. Axa X arată valorile -log10 p ale termenilor GO îmbogățiți în 58 DEG-uri comune că un număr mai mare de termeni GO îmbogățiți este mai probabil relevant pentru sistem. Sunt afișați primii 20 de termeni GO îmbogățiți. (D) Analiza STRING a 58 de DEG-uri comune este afișată în cele șase grupuri cele mai conectate/înrudite. Culorile sferice denotă gene aparținând aceluiași grup. Relațiile dintre acțiunile dintre gene sunt prezentate într-o manieră codificată de culoare și formă de capăt. ENSG00000279576 a fost acum codificat ca ENSP00000485396, care denotă ID-ul uman al genei MALAT1.

Pentru a analiza funcționalitatea DEG-urilor comune, am folosit platforma Metascape. Acesta atribuie genelor selectate termeni de Ontologie genetică (GO), care constau în funcție moleculară, componentă celulară și proces biologic. Am depus cei 58 DEG obișnuiți în Metascape și am obținut primii 20 de termeni GO cărora le aparțin aceste DEG (Figura 4C). Termenii GO sunt enumerați cu genele corespunzătoare în Tabelul S1. Pentru a vedea o listă de gene în fiecare termen GO prezentat în Figura 4C, vă rugăm să consultați Tabelul S2 Îmbogățirea Metascape. Termenii GO asociați cu moartea celulelor, inflamația și cascadele de semnalizare au fost clasați în primele 20 așa cum era de așteptat; cu toate acestea, ritmul circadian a atras atenția ca un nou termen GO. Conexiunile cunoscute ale genelor comune au fost arătate cu analiza STRING (Figura 4D). În această analiză, genele au fost grupate în șase grupuri diferite care au fost luate în considerare cu o asociere puternică de legare, influențe (cataliza, activare sau inhibare), precum și co-exprimarea genelor.

2.3.2. Tendința expresiei genelor

Urmele mai multor expresii genice sunt prezentate în grafice cu axa x pentru timpul (h) după injectarea Stx2 și axa y pentru schimbarea log2-ori față de 0 h (Figura 5). Astfel, valoarea axei y este egală cu 1 înseamnă o 2-schimbare de ori față de expresia 0 h.

Figura 5. Gene exprimate diferențial cu cronologie de eșantionare la șoarece. (A) Sunt prezentate modelele de expresie ARNm PDK4 și CEBPB. (B) gene imediate timpurii. (C) Expresiile proteinelor matricelulare CYR61 (CCN1) și CTGF (CCN2). (D) Sunt prezentate genele legate de UPR DDIT3 (CHOP, GADD153), partenerul de legare DDIT3 CEBPB și factorul de feedback negativ PPP1R15A (GADD34). (E) Sunt prezentați factorii de transcripție DDIT3 (CHOP, GADD153) și ATF3 și GDF15, care sunt reglați transcripțional de acești factori. (F) Sunt prezentate genele asociate UPR și RSR. (G) EDN1 în raport cu genele UPR sunt reprezentate grafic. (H) Picurile timpurii ale EDN1 și EGR1 și următorul vârf al PER1 sunt prezentate cu o creștere treptată ulterioară a tuturor celor trei gene. (I) Genele din clusterul violet din figura 4D sunt gene legate de ritmul circadian. (J) Sunt prezentate genele centrale circadiene PER1, Arntl (BMAL1), Cry1 și Clock. (K) PER1 și genele renale reglate de ceasul circadian sunt prezentate. (L) Sunt prezentate genele inflamatorii cu gene legate de calea NF-kB. Pentru a vedea punctele individuale de date log2, consultați Figura suplimentară S4. Figura S5, care arată log2 mediu cu bare de abatere standard, este prezentată ca referință.

Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

OBȚINEȚI EXTRACT DE CISTANCHE ORGANIC NATURAL CU 25% ECHINACOSIDE ȘI 9% ACTEOSIDE PENTRU INFECȚIA RINCHILOR