Inhibarea locală susținută a trombinei păstrează microarhitectura și funcția renală după debutul leziunii renale acute

Contact: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ian Vargas et al

Abstract

Leziuni renale acuteManagementul (AKI) rămâne în principal de susținere, deoarece niciun agenți terapeutici specifici direcționați către căi de semnalizare singulare nu au avut succes în studiile clinice. Aici, raportăm că inhibarea coagulării determinate de trombină și a semnalizării inflamatorii cu utilizarea nanoparticulelor de perfluorocarbon țintite pe trombină cu acțiune locală (PFC NP) protejează vascularizația renală și modulează în linii mari diverse procese inflamatorii care provoacă leziuni renale de ischemie-reperfuzie. Fiecare PFC NP a fost complexat cu ~ 13.650 de copii ale inhibitorului direct de trombină, PPACK (prolină-fenilalanină-arginină-clorometil-cetonă). Șoarecii tratați după debutul AKI cu PPACK PFC NP au prezentat VCAM-1, ICAM-1, prostanoid PGD2, M-CSF, IL{-6 și infiltrate mastocite. Arhitectura microvasculară, membranele bazale tubulare și componentele marginii periei au fost mai bine conservate. Non-reperfuzia a fost redusă așa cum este indicat prin captarea redusă a globulelor roșii și fierul non-hem.Rinichifuncția și necroza tubulară s-au îmbunătățit la 24 de ore față de grupul de control netratat, sugerând un beneficiu pentru inhibarea duală a trombozei și a inflamației de către PPACK PFC NP.

Cuvinte cheie: Leziuni renale acute; Tromboză; Inflamaţie; Nanoparticule de perfluorocarbon; Avarie la vas

Cistanche tubulosa previne bolile de rinichi, faceți clic aici pentru a obține mostra

Leziuni renale acute(AKI) este o problemă clinică frecventă la tineri și bătrâni deopotrivă, cu o incidență în creștere și o rată a mortalității inacceptabil de mare, care nu s-a îmbunătățit substanțial în decenii. celrinichica o consecință a unui număr de insulte, inclusiv hipotensiune arterială, sepsis, toxine etc.3 AKI evocă o panoplie complexă de actori moleculari fiziopatologici și evenimente de semnalizare într-un proces de boală care evoluează în timp în etape.3–6 Medical selectiv și specific țintit molecular. terapiile pentru AKI nu există încă, în ciuda nevoii medicale stringente.7 Într-adevăr, după ani de eforturi de cercetare preclinice și clinice, tratamentele actuale rămân esențial de susținere.

Aici postulăm că intervențiile terapeutice bazate pe nanoparticule care vizează trombina care pot menține integritatea microvasculară și funcția de barieră și pot reduce simultan semnalizarea inflamatorie vor beneficia de rezultatele AKI. Trombina este o moleculă principală aterogenă și de vindecare a rănilor care conduce la multe alte molecule inflamatorii care participă la activarea endotelială după o leziune, cum ar fi NF-κB,8 NADPH oxidaza,⁹

și altele prin receptori activați de protează (PAR-1) atât pe endoteliu, cât și pe macrofage.10,11 Toate tipurile de celule dinrinichia experimentat modificări ale modelului de expresie a genelor, care includ exprimarea crescută a markerilor de leziune și a genelor de dezvoltare, așa cum au arătat Rudman-Melnick și colab. într-un studiu de secvențiere a celulelor unilaterale cu privire la ischemie-reperfuzie unilaterală.rinichiMai mult, un studiu la rozătoare al secvențierii ARN cu un singur nucleu în leziunea renală bilaterală de ischemie-reperfuzie13 a identificat o populație specifică de celule tubulare proximale care supraexprimă gene de proinflamație și profibrotică după leziunea caldă de ischemie-reperfuzie. Aceste rezultate indică faptul că inflamația ar trebui să reprezinte o țintă terapeutică utilă. Deși formarea de cheaguri intravasculare solide pare neobișnuită în AKI, am emis în continuare ipoteza că atenuarea activității procoagulante microvasculare prin antagoniști potenți ai nanoparticulelor anti-trombină cu acțiune locală14–17 ar putea îmbunătăți fluxul sanguin, reduce „fără reflux” și atenuează semnalizarea inflamatorie pentru a menține. functie renala.

Problemele critice care militează împotriva aplicării inhibitorilor direcți ai trombinei pentru a preveni leziunile renale de ischemie-reperfuzie (IRI) includ potențialele efecte secundare toxice și riscul de sângerare sistemică. În ceea ce privește tromboza, terapiile anticoagulante convenționale nu au avut un succes deosebit, deși trombomodulina solubilă poate exercita acțiuni renoprotectoare18,19, deoarece poate activa proteina C,20,21 și antitrombina III,22, deși cu potențiale complicații ale sângerării excesive.21 Mai mult, atât warfarina, cât și dabigatranul a fost asociat cu toxicitate renală.^23,24Cu toate acestea, faptul că aceste abordări anticoagulante nu au reușit încă din punct de vedere clinic nu diminuează valoarea potențială a trombinei ca țintă, datorită funcțiilor sale duale atât în ​​coagulare, cât și în inflamație. Deși nu există un studiu clinic privind tratamentul cu VEGF pentru AKI, un studiu preclinic a demonstrat că VEGF este un mediator important în renoprotecția în timpul AKI,25 care susține în continuare mecanismul terapeutic ipotetic propus de noi de conservare a vaselor renale în protejarea funcției renale în timpul AKI.

Am dezvoltat o platformă stabilă, biocompatibilă și non-nefrotoxică de nanoparticule de perfluorocarbon (PFC NP) care inhibă activitatea proteazei trombinei fără a provoca o diateză de sângerare. miez și un înveliș exterior de fosfolipide-surfactant și cu diametrul de la ~160-250 nm. În studii preliminare recente AKI, am administrat anti-trombină PFC NP ca pretratament pentru a confirma că trombina este o țintă valoroasă pentru accelerarea recuperării funcției renale, parțial, prin păstrarea integrității microvasculare și reducerea non-reperfuziei în IRI atunci când este administrată înainte de ischemie-reperfuzie. leziuni.16 PFC antitrombină NPS protejează, de asemenea, alogrefele renale de IRI și prezintă o reducere marcată a procentului de necroză tubulară parenchimatoasă asociată cu longevitatea renală crescută după transplant.27 Cu toate acestea, nu este clar dacă această nanoparticulă antitromboză este încă eficientă. după debutul AKI, care reprezintă un set complet diferit de populații de pacienți.

În consecință, în lucrarea de față, am căutat să extindem utilizarea acestei abordări la AKI stabilit după IRI pentru a elucida potențialul său de traducere clinică. Pentru dovada conceptului, folosim PPACK (Phe[D]-Pro-Arg-clorometil cetonă) ca fragment de antitrombină pentru conjugarea cu PFC NP, despre care am arătat că previne semnalizarea trombinei și tromboza microvasculară în modelele de ateroscleroză și leziune renală acută ( AKI).14–17 PPACK însuși este un bine-cunoscut inhibitor direct și ireversibil al trombinei, care este în formă liberă este îndepărtat prea repede de rinichi pentru a fi de valoare ca agent terapeutic.14,15 Aici elucidăm răspunsurile patofiziologice timpurii la Terapia PPACK PFC NP care limitează evenimentele de semnalizare inflamatorie atât la nivelul rinichilor, cât și la nivel sistemic, păstrează microarhitectura renală și atenuează afectarea vasculară. Aceste date implică faptul că această abordare terapeutică bazată pe nanoparticule a AKI în curs de desfășurare ar putea stabili stadiul dezvoltării clinice a unui agent anti-trombină care exercită efecte pleiotrope limitate local și poate fi administrat în siguranță în fazele incipiente ale AKI.

Metode

Formularea de nanoparticule

Nanoparticulele de perfluorcarbon au fost formulate așa cum s-a descris anterior.14 Pe scurt, un amestec de lipide de 98,5% mol de fosfatidilcolină de ou și 1,5% mol de 1,2-distearoil snglicero- 3-fosfoetanolamină-N-[ carboxi(polietilen glicol)-2000] (sare de sodiu) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) a fost preparat în cloroform:metanol (3:1), înainte de a fi uscat pentru a forma film lipidic sub vid. Filmul lipidic (2 procente (gr/vol)) a fost apoi combinat cu PFOB (20 procente (vol/vol)) (Exfluor Research Corp.) (glicerină 1,7 procente (gr/vol)) (Sigma, St. Louis, MO ) și apă MilliQ, înainte de a fi emulsionate (Microfluidics Inc) pe gheață timp de 4 minute la 20,000 psi. Pentru a funcționa nanoparticulei cu conjugarea PPACK, am folosit metoda de cuplare amină-carboxil. Nanoparticulele (1 ml) au fost mai întâi amestecate cu 2 mg de metiodură de EDCI 1-[{3-(Dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimidă (Sigma, St. Louis, MO) timp de 1 oră , înainte de a adăuga 12,5 mg PPACK (BACHEM, Torrance, CA) la temperatura camerei cu agitatorul orbital peste noapte. S-a efectuat dializa cu limita de greutate moleculară 3000-5000 g/mol (Fisher Scientific, Waltham, MA) pentru a elimina excesul de EDCI și PPACK. Metoda de formulare detaliată a fost inclusă în Materialele suplimentare.

Modelul de leziune renală acută

Șoarecii adulți C57BL/6 (n=22) au suferit ischemie-reperfuzie renală caldă bilaterală pentru a induce leziuni renale acute. Animalele au fost anesteziate cu cocktail de ketamina (85 mg/kg) și xilazină (13 mg/kg) înainte de a fi supuse unei laparotomii pentru a produce 17 minute de ischemie caldă. A fost introdusă o incizie abdominală pe linia mediană pentru a expune atât artera cât și vena renală. Ischemia renală a fost indusă de cleme ocluzive atât pe arteră, cât și pe venă pentru a restricționa fluxul sanguin către rinichi. Oprirea cu succes a fluxului sanguin la rinichi a fost confirmată vizual printr-o schimbare a culorii rinichilor de la roz la violet închis. Temperatura corpului șoarecilor a fost menținută la 37 de grade prin utilizarea unui sistem de încălzire pentru animale mici. Clemele au fost eliberate după 17 minute pentru a permite restabilirea fluxului sanguin la rinichi, ceea ce a fost confirmat prin schimbarea culorii rinichilor în roz. Rana chirurgicală a fost apoi închisă în straturi și animalele au fost monitorizate și returnate în cușcă după mișcare liberă. După reperfuzie timp de 2 ore, o singură doză de PPACK

PFC NP ({{0}},5 ml/kg PFC NP; 0,05 mg/kg PPACK) sau PFC NP simplu (de control) a fost administrat intravenos prin injectare în vena cozii. Deoarece studiul nostru anterior a demonstrat că o singură doză preventivă de PPACK PFC NP a prezentat efecte de protecție renală,16 aici am aplicat un tratament cu doză unică după debutul AKI pentru a evalua efectul său protector renal. Procedurile și protocoalele au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Florida de Sud.

Colectarea și conservarea țesuturilor La 24 de ore după administrarea nanoparticulelor, șoarecii au fost eutanasiați și rinichii extrași pentru analiză. Înainte de îndepărtarea rinichilor pentru evaluări histologice și moleculare, sângele a fost colectat prin puncție cardiacă pentru analiza serului în aval, iar apoi fiecare șoarece a fost perfuzat sistemic cu soluție salină normală (Cat#: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA) până la reziduuri. sângele a fost scos din rinichi. Pentru a colecta ser, sângele integral a fost coagulat la temperatura camerei timp de 30 de minute, înainte de a fi centrifugat la 2000 xg timp de 10 minute la 4 grade. Serul colectat a fost stocat la -80 de grade înainte de evaluarea azotului ureic din sânge și a citokinelor. Pentru analiza histologică, rinichii excizat au fost fixați în formol 10%, înainte de prelucrarea țesuturilor, încorporarea în parafină și secționarea. Pentru evaluările eicosanoidelor, rinichii excizați au fost disecați în continuare pentru a separa cortexul și medularul, înainte de a fi congelați în azot lichid și depozitați la -80 de grade pentru analiză.

Histologie

Metodele detaliate de colorare a histologiei și analiză a datelor au fost incluse în materialele suplimentare. Lamele au fost deparafinate și rehidratate înainte de colorarea cu hematoxilină și eozină, colorare periodică cu acid Schiff (PAS) (Cat#: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), colorare cu fier albastru de Prusia, colorare imunohistochimică pentru a vizualiza CD31, VCAM-1, și expresia ICAM-1 și colorarea mastocitelor-eozinofile (Cat#: 150665, Abcam, Cambridge, MA). Datele de colorare a controlului izotipului IgG de iepure sunt prezentate în figurile suplimentare 2 și 3 pentru a demonstra specificitatea rezultatelor colorării imunohistochimice. Toate imaginile microscopice au fost obținute la aceleași setări de putere și parametri de digitizare. Evaluările microscopice au fost efectuate cu un microscop cu câmp luminos Olympus echipat cu o cameră digitală DP27 pentru a înregistra imagini ale secțiunilor patologice la mărire de 20× sau 40×. Analiza datelor dublu-orb a fost efectuată pe toate imaginile.

Azot ureic din sânge (BUN)

Măsurătorile BUN au fost efectuate cu un kit de detecție colorimetrică cu azot ureic (BUN) (Cat#: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) urmând instrucțiunile producătorului.

Prepararea și analiza eicosanoidelor

Eicosanoizii au fost extrași folosind un proces de extracție modificat și analizați prin UPLC ESI-MS/MS așa cum s-a descris anterior.28 Metodele detaliate utilizate pentru acest studiu au fost incluse în Materiale suplimentare.

Evaluarea citokinelor serice

O matrice de citokine personalizată a fost achiziționată de la R&D Systems (Minneapolis, MN) și evaluată cu Luminex 200 (Northbrook, IL) urmând instrucțiunile din manualul de utilizare.

Statistici

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± eroarea standard a mediei (SEM). Analiza statistică pentru fiecare experiment este rezumată în Tabelul suplimentar 1. S-a folosit testarea t pe două fețe sau ANOVA unidirecțională cu testul Scheffe. Au fost efectuate analize de corelație pentru perechile selectate de metrici pentru a calcula o valoare r pearsoniană. Semnificația statistică a diferențelor a fost atribuită la P <>

Rezultate

Tratamentul PPACK PFC NP îmbunătățește funcția rinichilor după debutulleziuni renale acute.

Examinarea microscopică a aspectului general al rinichilor la 24 de ore după tratamentul post-reperfuzie cu anti-trombină (PPACK) PFC NP a indicat ameliorarea leziunii în AKI stabilită (Figura 1, AB). Leziunea la 24 de ore a fost localizată predominant la joncțiunea corticomedulară a rinichiului, iar tubii proximali au fost afectați de preferință. Modelul de leziune a fost cel al necrozei de tip coagulativ. A existat un infiltrat inflamator minor la momentul de 24-ore. Cuantificarea daunelor tubulare în secțiunile colorate cu H&E (Figura 1, C) a arătat că șoarecii tratați cu PPACK PFC NP au manifestat o reducere globală cu 33,95% a necrozei tubulare acute (ATN) față de șoarecii tratați cu NP de control (24,44 ± 1,76 la sută față de 37).{{ 16}} ± 4,96 la sută respectiv; P=0.035). Figura 1, D arată că șoarecii care au primit tratament au manifestat o reducere de 44,03% a BUN cu 24 de ore (110,96 ± 6,21 mg/dL față de 62,10 ± 8,71 mg/dL pentru control NP vs PPACK PFC NP; P=0.0002) . Aceste rezultate benefice timpurii reflectă protecția pe care am observat-o anterior cu regimurile anti-trombină pre-tratament la 24 de ore,16 sugerând că trombina continuă să joace un rol critic în evoluția AKI dincolo de insulta ischemică inițială.

Figura 2 ilustrează răspunsurile regionale ale membranei bazale și ale structurilor de margine a periei la tratamentul anti-trombină bazat pe semi-cuantificarea colorării PAS. Figura 2, AC arată că tratamentul a sporit procentul de glomeruli cu membrane bazale intacte de la 51,43 la sută ± 2,61 la sută la 70,00 la sută ± 3,09 la sută (P=0,00033). Figura 2, DF ilustrează daunele mai profunde suferite de marginile periei tubulare, unde doar o minoritate a păstrat marginile periei complet intacte la 24 de ore. Cu toate acestea, tratamentul a îmbunătățit integritatea marginii periei cu 50,79 la sută (P=0,015). Tratamentul a redus extinderea totală a agregatelor de proteine ​​cu 54,09 la sută (P=0.032) (Figura 2, GI), ceea ce ar putea fi de așteptat să prevină congestia tubulară pentru a menține funcția renală.

Tratamentul PPACK PFC NP a păstrat integritatea vasculară după debutul IRI

Pentru a cuantifica potențialul PPACK PFC NP de a proteja elementele vasculare, secțiunile de rinichi au fost colorate pentru CD31.

Figura 3 ilustrează prevalența mai mare a colorării CD31 la 24 de ore în cortexul și medularul șoarecilor tratați cu PPACK NP față de NP de control (Figura 3, A și D față de B și E). În regiunile corticale, colorarea CD31 a cuprins 4,28 la sută ± 0,62 la sută din cele tratate față de 1,75 la sută ± 0,34 la sută pentru animalele de control (P=0.0{{ 25}}18), sau o creștere relativă de 144,57 la sută (Figura 3, C). În regiunile medulare, colorarea cu CD31 a cuprins 3,24% ± 0,38% pentru PPACK NP tratat față de 1,91% ± 0,29% pentru animalele martor tratate cu NP (P=0.0073) sau o creștere relativă de 88,81% (Figura 3, F) . Evaluarea microscopică a integrității vasculare nu a evidențiat nicio necroză arteriolară apreciabilă la momentul de 24-ore.

Aspectul globulelor roșii (RBC) în imaginile microscopice a fost diferit între șoarecii tratați cu PPACK NP și control NP la 24 de ore (Figura 4). Deoarece șoarecii au fost perfuzați sistemic pentru a spăla sângele în teritoriile renale perfuzabile, prezența eritrocitare a indicat fie agregare în conductele microvasculare slab perfuzate, fie extravazare interstițială, sau posibil ambele. În glomeruli (Figura 4, AB), RBC au fost observate în smocuri vasculare, dar rareori în capsula Bowman la 24 de ore. Tratamentul a redus prevalența eritrocitară glomerulară cu 40,78% (P=0,007) (Figura 3, C). În medular (Figura 4, DE), nu a fost posibilă atribuirea unei locații definitive pentru RBC pe baza colorațiilor H&E, dar tratamentul a redus prevalența globală a RBC cu 34,92% (P=0.049) (Figura 4, F) .

Pentru a delimita în continuare consecințele depunerii și captării RBC, a fost efectuată colorarea cu fier non-hem cu albastru prusac. Petele de fier au fost pozitive atât în ​​structurile celulare glomerulare, cât și tubulare. Tratamentul a redus prevalența fierului atât în ​​cortex (reducere de 44,23 la sută; P=0,022) (Figura 5, AC) cât și în medular (reducere de 50,50 la sută; P=0,006) (Figura 5, DF) ) la 24 de ore, în concordanță cu efectul tratamentului anti-trombină asupra captării RBC.

Tratamentul cu PPACK PFC NP a redus inflamația locală și sistemică după debutul AKI

Pentru a elucida rolul trombinei în susținerea activării endoteliale și a inflamației locale în rinichi, am cuantificat atât ICAM-1, cât și VCAM-1. Expresia VCAM-1 în cortex nu a fost modificată prin tratamentul PPACK (Figura 6, AC). Cu toate acestea, expresia VCAM- 1 în medulară a fost redusă substanțial cu 65,25 la sută (P=0.011) după tratament (Figura 6, DF). Expresia îmbunătățită a ICAM-1 endotelială a fost observată atât în ​​cortex, cât și în medulară la șoarecii de control tratați cu NP (Figura 7, B și E). ICAM-1 a fost reglată în jos prin tratament cu 36,89% (P=0.0083) în cortex (Figura 7, AC) și cu 31,17% (P=0.030) în medulară (Figura 7) , DF).

Pentru a delimita rolul trombinei în reglarea lipidelor bioactive inflamatorii în evoluția timpurie a AKI, am efectuat teste lipidomice pe țesuturi extrase separat din cortex și medulare la 24 de ore. Tabelele suplimentare 2 și 3 listează testele moleculare specifice, regiunea rinichilor și tipurile de subiecte (AKI tratată, AKI netratată sau normală fără AKI). Tabelul suplimentar 4 listează modificarea procentuală medie față de valoarea de bază normală sănătoasă pentru fiecare lipidă din cortex și medulară. În general, atât regiunile corticale, cât și cele medulare au manifestat o expresie deviată a aproape tuturor lipidelor bioactive evaluate în comparație cu rinichii normali (Tabelele suplimentare 2 și 3), iar aproape toate lipidele de semnalizare au avut tendința de a se deplasa către niveluri normale după terapia anti-trombină. Ca măsură simplificată pentru inflamația regională (Tabelul suplimentar 4), modificarea procentuală medie pentru toate lipidele a fost de 65,13 la sută și 38,60 la sută pentru cortex și 136,42 la sută și 90,76 la sută pentru medulara în grupurile de control NP și PPACK NP, indicând faptul că inflamația în medulara a depășit-o pe cea pentru cortex conform analizelor lipidomice.

Deși tendințele de rezolvare au fost evidente după tratament pentru aproape toate speciile de lipide, majoritatea nu au îndeplinit semnificația statistică. Cu toate acestea, notabil în aceste teste a fost răspunsul semnificativ al PDG2, care a scăzut cu 47,62% în cortex (Figura 8, A) (P=0.012) și 50,21% în medulară (Figura 8, B) ( P=0.0249), respectiv. Pe baza acestei observații, am cuantificat prevalența mastocitelor infiltrate, care sunt o sursă proeminentă cunoscută de PGD2 inflamator. Figura 8, CE indică tratamentul cu antitrombină a redus conținutul de mastocite în întreaga secțiune de rinichi cu 54,27 la sută (P=0,002) la 24 de ore. Acest lucru este în concordanță cu reducerile observate ale VCAM-1 și ICAM-1 (Figurile 6 și 7) ca mastocite activate care exprimă LFA-1 (antigenul 1 asociat funcției limfocitelor) și VLA (foarte târziu antigen) ligate moleculele de adeziune specifice țesutului pentru transmigrarea în țesuturile inflamate.29,30 Mai mult, chemokinele/citokinele asociate mastocitelor, cum ar fi M-CSF și IL{31}}, au fost reglate concomitent de către nanoparticulele anti-trombină. După tratamentul cu PPACK NP, M-CSF și IL-6 seric au fost reduse cu 36,60 la sută (P=0,0448) și, respectiv, 27,44 la sută (P=0,0454), în comparație cu grupul martor netratat (Figura 8, F).

Mai multe corelații interesante au apărut din setul de date legate de infiltrarea mastocitelor, leziunile vasculare și funcția renală pentru totalul grupurilor combinate de animale tratate și netratate în ambele regiuni ale cortexului și medular. O relație indirectă a avut loc între BUN și CD31 (r=0.75, P=0.000009), indicând faptul că agravarea insuficienței renale a fost asociată cu un compromis vascular mai mare (Figura suplimentară 1, A). A existat o relație directă între numerele mastocitelor și BUN (r=0.71, P=0.004), indicând o scădere progresivă

a funcției renale în asociere cu infiltrarea mastocitelor (Figura suplimentară 1, B). S-a observat o relație indirectă între numărul de mastocite și CD31 (r=0.59, P=0.002), indicând faptul că leziunile vasculare s-au agravat odată cu creșterea infiltrației mastocitelor (Figura suplimentară 1, C). În cele din urmă, a fost observată o relație directă între numărul mastocitelor și expresia globală ICAM-1 (r=0.54, P=0.008), în concordanță cu așteptarea ca moleculele de adeziune vasculară reglate în sus promovează orientarea mastocitelor către țesuturile rănite (Figura suplimentară 1, D). O relație directă și mai strânsă se referă la expresia VCAM medulară și numărul de mastocite (r=0.69, P=0.009; datele nu sunt afișate).

Discuţie

În ciuda deceniilor de eforturi în căutarea unui management eficient alleziuni renale acute, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 fragmente anti-trombină la locurile de tromboză microvasculară și activarea PAR-1 (descriere suplimentară în Materiale suplimentare), o strategie de amplificare care nu poate fi realizată prin stochiometria 1:1 a agenților liberi convenționali care inhibă trombina, inclusiv PPACK.

Prezentul set de date arată că leziunea acută de ischemie-reperfuzie renală nu este completă cu 2 ore post-reperfuzie, iar trombina rămâne o țintă de mare valoare în țesuturile afectate după reperfuzie. Eforturile anterioare ale asociaților Molitoris și al altora susțin efortul continuu de a proiecta metode sigure pentru inhibarea directă a trombinei în AKI.^18,31–33Din munca noastră anterioară de pretratare a AKI cu PPACK PFC NP, știm că nanoparticulele anti-trombină asigură o supraveghere susținută împotriva trombinei activate local care menține integritatea vasculară, atenuând semnificativ fenomenul de nereflux cu ~ 50% și inversează rapid disfuncția renală cu 24%. hrs.16 Luat împreună cu datele prezente, este clar că nanoparticulele anti-trombină continuă să aibă acces la țesuturile renale deteriorate, dar viabile, mult după reperfuzie, pentru a preveni deteriorarea suplimentară vasculară și tubulară. Rapoartele anterioare conform cărora șoarecii knockout PAR-1 suferă leziuni reduse de ischemie-reperfuzie renală, de asemenea, sunt în concordanță cu strategia noastră de inhibare farmacologică puternică și persistentă a activării PAR-1 în AKI prin inhibarea trombinei.³⁴

Protecția structurilor vasculare renale (Figura 3), a marginii periei și a membranei bazale (Figura 2) oferită de antitrombină PFC NP, în concordanță cu datele noastre anterioare care arată că terapia anti-trombină determină o îmbunătățire de 2 ori a perfuziei în regiunile corticomedulare în AKI,16 confirmă un beneficiu emergent al ameliorării microangiopatiei renale. Deși natura exactă a leziunii capilarelor și venulelor peritubulare nu a fost pe deplin elucidată în aceste momente timpurii după reperfuzie, sunt descrise permeabilitatea vaselor îmbunătățite și activarea caspazei proapoptotice endoteliale-3, precum și diminuarea semnalului. pentru CD31 (PECAM),35 care reglează integritatea joncțiunii endoteliale.36 Sinteza și expresia CD31 la joncțiunile celulare sunt reglate în jos de citokinele inflamatorii care sunt exprimate de mastocite activate (TNF- și IFN-), care sporesc permeabilitatea vasculară.^37,38Mai mult, inducerea factorului tisular de către trombină prin activarea PAR-1 este reglată de CD31, iar șoarecii knockout CD31 prezintă apoptoză epitelială și endotelială tubulară crescută, depunere crescută de fibrină și expresie a factorului tisular.³⁹În consecință, capacitatea PPACK PFC NP de a păstra expresia CD31 poate fi vitală pentru limitarea activării continue a cascadei de coagulare și pentru susținerea integrității endoteliale.

Există o legătură locală între inflamație și coagulare în faza de extensie a AKI, care restricționează perfuzia capilară medulară exterioară, provocând ischemie/hipoxie regională prelungită, care afectează apoi repararea și regenerarea celulelor tubulare.4 O scădere susținută a numărului de microvase din banda interioară. a medularei exterioare în AKI indică faptul că deteriorarea vasului continuă și semnalizarea VEGF este suprimată.^40–42Mai mult, există dovezi abundente că rarefacția vasculară determină hipoxie cronică care duce la fibroză tubulointerstițială progresivă.⁴³În modelul de ischemie acută/leziune a șobolanului, tubii proximali sunt deosebit de sensibili la hipoxia manifestată prin desprinderea celulelor tubulare și chiar prin dezintegrarea totală, care produce o mortalitate excesivă. boală cronică de rinichi.⁴⁶

Datele noastre confirmă, de asemenea, că leziunile vasculare promovează captarea RBC și depunerea non-hemului (Figurile 4 și 5), care pot exacerba boala cronică de rinichi,⁴⁷dar care este susceptibilă de terapie cu antitrombină. Sursa tisulară de fier atât în ​​celulele glomerulare, cât și în cele tubulare (Figura 5) provine fără îndoială din defalcarea RBC în acele teritorii, ca o consecință a hemoragiei și/sau a trombozei microvasculare, în concordanță cu o imagine a compromisului vascular care este atenuat de terapia anti-trombină. În consecință, abordările care păstrează integritatea vasculară pot reprezenta un prim pas critic către menținerea liniilor de alimentare pentru substraturi nutritive care facilitează vindecarea mai rapidă a structurilor tubulare deteriorate.

Interesant, PPACK PFC NP pare să ofere protecție timpurie a structurilor vasculare și să atenueze diverși markeri ai inflamației (Figurile 6 și 7; Tabelele suplimentare 2-4) atât în ​​cortex, cât și în medular. În studiile experimentale tradiționale ale AKI, se presupune că cortexul este mai rezistent la leziuni decât medularul datorită cererii metabolice mai scăzute, totuși activarea endotelială și inflamația patofiziologică par răspândite, așa cum demonstrează testele noastre lipidomice și histochimice. Mai mult decât atât, depunerea largă de fier non-hem ca produs secundar al defalcării eritrocitelor prinse atât în ​​cortex, cât și în medulară – și atenuarea acestuia prin nanoparticule anti-trombină – este în acord cu un model generalizat de inflamație și deteriorare, chiar dacă cortexul se poate dovedi mai mult. afectată tranzitoriu și ușor decât este medulara pe parcursul bolii.

Răspunsul timpuriu surprinzător al infiltrării mastocitelor în 24 de ore (Figura 8) sugerează un rol important pentru celulele inflamatorii, altele decât jucătorii tradiționali, cum ar fi neutrofilele și macrofagele. Mastocitele sunt considerate în mod obișnuit ca mediatori ai răspunsurilor alergice, dar există un corp de literatură cu privire la implicațiile lor patofiziologice în leziunea renală acută și cronică.^48–52 Deși neutrofilele sunt răspunsuri timpurii la leziunile tisulare, macrofagele nu intră în imagine decât mai târziu în procesul inflamator, sugerând că mastocitele joacă un rol important în faza timpurie a AKI. Într-adevăr, Danelli și colab. au arătat că degranularea mastocitelor apare devreme în AKI și că epuizarea mastocitelor în momentul inducerii AKI, dar nu 48 de ore mai târziu, conferă un efect benefic pe termen lung asupra funcției renale, atrofiei și fibrozei.⁵³Concluzii similare au ajuns de către Tong și colab. în procedurile mastocitelor stabilizate cu cromolin efectuate înainte de reperfuzie.54 Summers a arătat că șoarecii cu deficit de mastocite (KitW-sh/W-sh) suferă mai puține leziuni ischemice decât tipurile sălbatice și că ei elaborează niveluri reduse de chemoatractanți leucocitari.⁵⁵

Mastocitele exprimă receptori activați de protează. Mastocitele exprimă receptori activați de protează (PAR) care pot fi activați de trombină pentru a degranula și a descărca o serie de chemokine, citokine și lipide bioactive preformate.56–58 Trombina provoacă, de asemenea, aderența mastocitelor la matrice. proteine ​​(de exemplu, fibronectină) și expresia interleukinei (de exemplu, IL-6) prin interacțiunile PAR{- 1.⁵⁹După inhibarea trombinei, am observat niveluri reduse de PGD2 care sunt în concordanță cu o depleție relativă a mastocitelor, deoarece PGD2 este un eicosanoid bioactiv principal secretat de mastocite în reacțiile de tip alergic.60 În plus, reglarea în jos a ICAM-1 și VCAM-1 după tratamentul cu nanoparticule cu antitrombină este în concordanță cu infiltrarea redusă a mastocitelor, deoarece exprimă LFA-1 și VLA și utilizează molecule de adeziune pentru a obține intrarea în țesut.^29,30

Un rol patogen specific pentru PGD2 în sine în evoluția IRI renală nu a fost descris până acum din cunoștințele noastre, dar servește ca un biomarker clar pentru activarea mastocitelor.⁵²În inflamația pulmonară, s-a demonstrat că PDG2 îmbunătățește expresia citokinelor proinflamatorii macrofagelor prin receptorii săi (DP1 și DP2), care activează apoi influxul de neutrofile.61 Observația noastră a crescut M-CSF și IL-6 (Figura 8) în AKI care sunt reglați în jos de PPACK PFC NP prin suprimarea mastocitelor ar fi în concordanță cu un astfel de mecanism presupus. Cu toate acestea, deoarece mastocitele sunt cunoscute că eliberează o mulțime de factori potențial dăunători pentru funcția renală,51,52 orice număr de determinanți responsabili ar putea fi subiect de studiu viitor pentru controlul prin inhibarea trombinei sau alți agenți țintiți molecular. În consecință, intervențiile care întârzie atracția și degranularea mastocitelor precoce ar putea fi foarte protectoare pentru integritatea vasculară și funcția rinichilor, așa cum se manifestă prin inhibarea locală a trombinei în datele prezente.

Limitări

Aceste studii nu au fost concepute pentru a elucida beneficiile susținute ale inhibării trombinei, deoarece modelul AKI este axat pe protecția timpurie împotriva IRI și a mecanismelor conexe. Dacă beneficiile pe termen lung ale unei singure doze de nanoparticule anti-trombină ar putea limita progresia către boala cronică de rinichi depășește domeniul de aplicare al prezentului raport și ar necesita un model experimental și o ipoteză diferită. Mai mult, fereastra temporală de oportunitate pentru obținerea recuperării funcționale prin inhibarea trombinei în faza de extensie a AKI nu este abordată aici, dar este un subiect de interes pentru studii viitoare. În ce măsură principalele efecte benefice ale inhibării locale a trombinei în AKI se datorează suprimării activării mastocitelor rămâne conjecturală, dar ar putea fi testată în studii mecanice detaliate ulterioare. Cu toate acestea, deși corelațiile liniare semnificative între numerele mastocitelor, CD31 și BUN nu stabilesc neapărat cauza și efectul, concordanța lor susține o relație puternică între mastocite și afectarea vasculară în stadiile incipiente ale IRI renale. În cele din urmă, utilizarea PPACK ca fragment anti-trombină este doar un exemplu de ingredient terapeutic conjugabil care poate fi administrat în siguranță și local pe o nanostructură pentru a submina semnalizarea trombinei. Referințe

1. Benoit SW, Devarajan P. Acute kidney injury: emergente pharmacotherapies in current clinical trials. Pediatr Nephrol 2018;33:779-87.

2. Chen H, Busse LW. Terapii noi pentru leziuni renale acute. Kidney Int Rep 2017;2:785-99.

3. Bonventre JV, Yang L. Fiziopatologia celulară a leziunii renale acute ischemice. J Clin Invest 2011;121:4210-21.

4. Sharfuddin AA, Molitoris BA. Fiziopatologia leziunii renale acute ischemice. Nat Rev Nephrol 2011;7:189-200.

5. Bonventre JV. Fiziopatologia AKI: leziune și reparare normală și anormală. Contrib Nephrol 2010;165:9-17.

6. Zuk A, Palevsky PM, Fried L, Harrell Jr FE, Khan S, McKay DB, et al. Depășirea barierelor translaționale în leziunea renală acută: un raport de la un atelier NIDDK. Clin J Am Soc Nephrol 2018;13:1113-23.

7. Zuk A, Bonventre JV. Progrese recente în leziunea renală acută și consecințele și impactul acesteia asupra bolii renale cronice. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019;28:397-405.

8. Rahman A, Fazal F. Blocarea NF-kappaB: o problemă inflamatorie. Proc Am Thorac Soc 2011;8:497-503.

9. Jagadeesha DK, Takapoo M, Banfi B, Bhalla RC, Miller Jr FJ. Transactivarea Nox1 a receptorului factorului de creștere epidermic promovează eliminarea N-caderinei și migrarea celulelor musculare netede. Cardiovasc Res 2012;93:406-13.

10. Lopez ML, Bruges G, Crespo G, Salazar V, Deglesne PA, Schneider H, et al. Trombina induce selectiv transcrierea genelor în monocitele umane implicate în inflamație și vindecarea rănilor. Thromb Haemost 2014;112:992-1001.

11. Borissoff JI, Spronk HM, Heeneman S, ten Cate H. Este trombina un jucător cheie în labirintul „coagulare-aterogeneză”? Cardiovasc Res 2009;82:392-403.

12. Rudman-Melnick V, Adam M, Potter A, Chokshi SM, Ma Q, Drake KA și colab. Profilul unicelular al AKI într-un model murin dezvăluie semnături transcripționale noi, fenotip profibrotic și diafonie epitelial-stromală. Jurnalul Societății Americane de Nefrologie: JASN 2020;31:2793-814.

13. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Profilul celular al leziunii renale acute la șoarece dezvăluie răspunsuri celulare conservate la leziuni. Proc Natl Acad Sci USA 2020;117:15874-83.

14. Myerson J, He L, Lanza G, Tollefsen D, Wickline S. Nanoparticulele de perfluorocarbon care inhibă trombina oferă o strategie nouă pentru tratamentul și imagistica prin rezonanță magnetică a trombozei acute. Jurnalul de tromboză și hemostază: JTH 2011;9:1292-300.

15. Myerson JW, He L, Allen JS, Williams T, Lanza G, Tollefsen D și colab. Nanoparticulele care inhibă trombina constituie rapid suprafețe de anticoagulare versatile și detectabile. Nanotehnologie 2014;25:395101.

16. Chen J, Vemuri C, Palekar RU, Gaut JP, Goette M, Hu L, et al. Nanoparticulele de antitrombină îmbunătățesc reperfuzia renală și protejează funcția rinichilor după leziuni de ischemie-reperfuzie. Am J Physiol Renal Physiol 2015;308:F765-73