Efecte antiinflamatorii sinergice ale extractului de Laminaria Japonica Fucoidan și Cistanche Tubulosa

Ca răspuns imun împotriva antigenelor străine, macrofagele eliberează citokine proinflamatorii, cum ar fi factorul de necroză tumorală (TNF-), interleukina-1 (IL{- 1), IL-6 și altele. Astfel de citokine induc un aflux chemotactic de granulocite, monocite, limfocite și mastocite către țesutul deteriorat, care promovează îndepărtarea antigenului și recuperarea țesuturilor. Cu toate acestea, infiltrarea și activarea excesivă a celulelor agravează leziunile tisulare, ducând la edem (exsudație vasculară) și durere care sunt fenomene de inflamație binecunoscute.

TNF- este un factor important pentru inducerea expresiei genei de oxid nitric sintaza (iNOS) în mai multe linii celulare. Activarea iNOS duce la producerea de oxid nitric (NO) care nu numai că modulează mai multe funcții fiziologice, cum ar fi bactericidul și vasodilatația, dar provoacă și inflamație. După lezarea țesuturilor, degradarea de către fosfolipaze a fosfolipidelor membranei celulare generează acid arahidonic. Acidul arahidonic este descompus în continuare de ciclooxigenază (COX) în prostaglandine (PG). Cantitatea excesivă de PGE2 formată de COX-II induce mai multe citokine pentru inflamație. Deoarece atât NO cât și PGE2 acționează ca factori majori pentru inflamație și inducerea durerii, căile TNF--NO și COX-II-PGE2 sunt principalele fluxuri ale procesului inflamator, care sunt inhibate de corticosteroizi și nesteroidieni.medicamente antiinflamatoare(AINS), respectiv.

Chiar dacă există mai mulți steroizi și AINS ptterapia bolilor inflamatorii, aceste medicamente pot da naștere la efecte adverse asupra sistemului imunitar, tractului gastrointestinal, rinichi, ficat, sistemul nervos central, tensiunea arterială și sistemul cardiovascular. Prin urmare, este necesar să se minimizeze efectele adverse ale terapiei chimice prin înlocuirea lor sau utilizarea lor în combinație cu produse naturale.

Fucoidan, un complex de polizaharide sulfat din alge marine precum Laminaria japonica și Cladosiphon Okamuranus distribuit pe scară largă în multe țări, a fost utilizat ca terapeutică în medicina orientală de o perioadă lungă de timp. În studiile anterioare, s-a demonstrat că fucoidanul are efecte antioxidante, anticoagulante, anticancerigene șiactivitati antiinflamatorii. În consecință, efectele benefice ale fucoidanului asupra bolilor inflamatorii, ischemiei, disfuncției imune și tumorilor atrag atenția anchetatorilor. Pe de altă parte,Cistanche tubulosa(CT) a fost, de asemenea, utilizat pe scară largă ca medicament tradițional în China. Sa raportat că extractele CT scad producția de TNF-á și IL- 4, care sunt factori majori pentru producția de NO în căile inflamatorii [19].

Astfel de descoperiri anterioare ne-au determinat să investigăm eficacitatea combinațională a extractului de fucoidan și CT pe cele 2 căi majore de inflamație. Pentru a elucida mecanismul de acțiune, am analizat NO și PGE2 în exsudatele din inflamația pungii de aer indusă de caragenan.

TUBULOSA NATURALA DE CISTANCHE PENTRU PREVENIREACTIVITĂȚI INFLAMATORIIPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiale și metode

Materiale

Extractul fucoidan semi-purificat și apă de CT au fost obținute de la Misuba Rtech Co., Ltd. (Asan, Coreea). Fucoidan și extractul CT au fost menținute la 4 grade, amestecate (1:3) dizolvate în apă purificată înainte de utilizare și administrate oral într-un volum de 5 ml/kg.

Cultura celulară și cuantificarea NO

Linia celulară RAW 264.7 de macrofage murină a fost achiziționată de la American Type Culture Collection (Manassas, SUA) și cultivată în mediu Eagle modificat de Dulbecco (Sigma, St. Louis, SUA) care conține 10% ser fetal bovin și antibiotice [100 U/mL penicilină (Sigma) și 100 µg/mL streptomicina (Sigma)]. Celulele au fost incubate într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2 la 37 de grade.

Pentru a evalua efectele extractului de fucoidan și CT asupra secreției de NO, celule RAW 264,7 (1×106 celule/ml) au fost incubate cu fucoidan sau extract CT (1–320 µg/mL) timp de 5 minute , urmat de interferon- (IFN-, 10 U/mL) și lipopolizaharidă (LPS, 10 pg/ml) timp de 24 de ore. În studiile noastre preliminare, s-a confirmat că tratamentul cu IFN-plus LPS pentru activarea celulelor RAW 264.7 nu a afectat viabilitatea celulelor până la 24 de ore și că extractul de fucoidan și CT nu au fost citotoxice până la 1 mg/mL. Concentrația de nitrit (NO2 – ), produsul oxidat al NO, a fost măsurată ca indicator al NO. Mediul de cultură a fost amestecat cu un volum egal de reactiv Griess (1% sulfanilamidă, 0,1% naftil etilendiamină în 2,5% acid fosforic) [21] și incubat la temperatura camerei timp de 10 minute. Concentrația de nitriți a fost analizată la 540 nm, unde NaNO2 a fost utilizat pentru a genera o curbă standard.

Animale și tratament

Șoarecii masculi ICR (în vârstă de 7 săptămâni) au fost achiziționați de la Daehan Biolink (Eumseong, Coreea) și găzduiți într-o cameră cu condiții de mediu constante (22±2ºC; 40-70% umiditate relativă; 12-oră lumină -ciclu de întuneric; 150-300 lux luminozitate). Furajele cu peleți și apa purificată erau disponibile ad libitum. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul Instituțional de Îngrijire și Utilizare a Animalelor (IACUC) al Universității Naționale Chungbuk (CBNU), Coreea și efectuate conform Procedurilor Standard de Operare (SOP) ale Centrului de Cercetare a Animalelor de Laborator, CBNU.

Șoarecii (n{0}}/grup) au fost tratați oral cu fucoidan (18 sau 54 mg/kg), extract CT (54 sau 162 mg/kg) sau amestecul acestora (18+54, {{6 }} sau 90+270 mg/kg) o dată pe zi timp de 7 zile. Dozele mici de fucoidan (18 mg/kg) și extract de CT (54 mg/kg) proveneau din dozele umane estimate de 100 mg/corp (70 kg) și 300 mg/corp după translația suprafeței a greutății corporale (Km{14). }} pentru om/Km=3 pentru mouse), respectiv. Dozele mari de fucoidan și extract de CT au fost stabilite la 3 ori, singur sau în amestec, iar amestecul cu cea mai mare doză a fost fixată la 5 ori pentru a evalua efectele sinergice maxime.

În prima zi de tratament cu fucoidan și extract CT, șoarecii au fost injectați subcutanat cu 10 ml de aer steril în partea din spate pentru a forma o pungă [22,23]. După 2 și 5 zile, punga a fost reinjectată cu 5 ml de aer. La o oră după tratamentul final, 1 mL de caragenan (1% în soluție salină; Sigma) sau vehiculul acestuia (soluție salină) a fost injectat în pungă.

Analiza exsudatelor

Punga de aer a fost spălată cu 1 ml de soluție salină rece la 6 ore după injectarea caragenanului și a fost înregistrat volumul net de lichid de spălare. Numărul total de celule inflamatorii, neutrofile, monocite și limfocite, a fost determinat folosind un contor cu brăzdar. Concentrațiile de NO și PGE2 au fost determinate prin reactiv Griess (Sigma) și imunotest enzimatic (EIA) folosind un kit Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA), respectiv.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCĂ PENTRU ACȚIUNEA DE BLOCARE A CHEMOTAXIEI CELULUI INFLAMATORII PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Examen histopatologic

Țesutul de căptușeală a pungii a fost îndepărtat și fixat într-o soluție neutră de formol. Lamele de țesut încorporate în parafină au fost colorate cu hematoxilină-eozină și examinate la microscop cu lumină pentru leziunile inflamatorii.

Analiza statistica

Rezultatele sunt prezentate ca medie±SE. Comparațiile experimentale de grup au fost făcute prin analiză unidirecțională a varianței, urmată de o corecție a testului Tukey. Valoarea AP<0.05 was considered statistically significant.

Rezultate

In vitro, cultura celulară RAW 264.7, tratamentul cu IFN- și LPS au crescut foarte mult producția de NO (Figura 1). Pretratamentul cu fucoidan (1-320 µg/mL) nu a afectat eliberarea de NO din linia celulară de macrofage (Figura 1A). În comparație, extractul CT (32-320 µg/mL) a suprimat semnificativ producția de NO, ceea ce indică o activitate antiinflamatoare (Figura 1B).

Injectarea caragenanului în punga de aer de șoarece a crescut semnificativ volumul exudatului din pungă (Figura 2). O astfel de exsudație crescută a fost atenuată prin tratamentul cu fucoidan (18 mg/kg) și extract CT (54 și 162 mg/kg). În special, tratamentul combinat cu fucoidan și extract de CT a scăzut și mai mult volumul exsudatului, în comparație cu efectele individuale, deși combinațiile de doze mai mari (54+162 mg/kg și 90+270 mg/kg) nu au prezentat o eficacitate suplimentară. până la cea mai mică combinație de doză (18+54 mg/kg) (Figura 2A). De asemenea, conținutul de grad N din pungă a crescut drastic după injectarea caragenanului (Figura 2B). În comparație cu efectul ușor al fucoidanului, extractul CT a scăzut semnificativ concentrația de gradul N. Tratamentul combinat cu extract de fucoidan și CT a scăzut și mai mult nivelul NO într-o manieră dependentă de doză. În mod similar, conținutul crescut de PGE2 a fost suprimat sinergic prin terapia combinată cu extract de fucoidan și CT (Figura 2C).

În paralel cu mediatorii inflamatori din pungă, numărul de celule inflamatorii a crescut drastic prin injectarea caragenanului: 37,8, 4,8 și 24,1 ori niveluri de control pentru neutrofile, monocite și, respectiv, limfocite (Tabelul 1). Cu toate acestea, fucoidanul și extractul CT au redus semnificativ infiltrarea celulelor inflamatorii, în care fucoidanul a fost oarecum superior extractului CT. În mod neașteptat, niciun efect sinergic în infiltrarea celulelor inflamatorii a fost obținut prin administrarea de administrare a extractului fucoidan și CT.

După cum se deduce din infiltrarea celulelor inflamatorii în exsudate, țesutul subcutanat din jurul pungilor de aer a prezentat leziuni inflamatorii severe (Figura 3). Au fost observate enorm de multe celule din țesutul subcutanat îngroșat expuse la Carrageenan (Figura 3B), în comparație cu caracteristicile aproape normale la animalele de control (Figura 3A). Astfel de leziuni inflamatorii au fost atenuate remarcabil prin tratamentul cu fucoidan (Figurile 3C și 3D) sau extract CT (Figurile 3E și 3F).

În special, efecte antiinflamatorii mai mari au fost obținute prin terapia combinată cu fucoidan și extract CT (Figurile 3G-3I).

Discuţie

Folosind un model de inflamație a pungii de aer indusă de arrageenan în gradul de viață, injectarea de aer în spatele rozătoarelor induce proliferarea celulelor care se stratifică pe suprafața cavității pentru a forma o structură similară cu sinoviale. În acest model, injectarea infiltrației celulelor inflamatorii induse de caragenan a crescut exudatul, ceea ce indică scurgerea vasculară. Punga de aer servește ca un rezervor de celule inflamatorii și mediatori care pot fi măsurați cu ușurință în lichidul care se acumulează local.

Dintre diverșii mediatori inflamatori care pot induce permeabilitatea vasculară, este bine cunoscut faptul că NO și PGE2 sunt factori majori implicați în patogeneza multor boli inflamatorii. Sunt cunoscuți și ca mediatori ai inducerii și percepției durerii. iNOS, care este exprimat și activat în diverse tipuri de celule prin stimularea cu TNF- și/sau LPS în timpul inflamației, produce concentrații mari, persistente de NO. NO este o moleculă de reglare importantă în diverse funcții fiziologice, cum ar fi vasodilatația care duce la scurgeri vasculare. PGE2, care este generat din acidul arahidonic prin COX, contribuie la dezvoltarea multor boli inflamatorii, iar supraproducția de PGE2 ca răspuns la diferite stimulări inflamatorii este asociată cu reglarea în sus a nivelurilor COX-II și progresia inflamației. Prin urmare, căile TNF- - NO și COX-II-PGE2 au fost considerate ca două fluxuri principale de procese inflamatorii, care sunt blocate de inhibitorii iNOS (corticosteroizi) și, respectiv, COX (AINS).

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU INTERZIZEA BOLILOR INFLAMATORIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

In the present study, co-administration of fucoidan and CT extract reduced the exudate volume in the pouch, suggesting that they possess suppressive activity against vascular leakage (Figure 2A). In comparison with the individual effects of each fucoidan and CT extract, the combinational treatment further increased, implying that the tw degree ompounds action synergistically. Such synergistic effects between fucoidan and CT extract were supported by their activities on the NO and PGE2 levels in the exudates (Figures 3B and 2C).

Interesant, totuși, s-a confirmat că fucoidanul nu inhibă direct activarea macrofagelor testul in vitro (Figura 1A). În mod similar, potențialul inhibitor al fucoidanului asupra testului NO și PGE2 de acumulare in vivo a fost relativ mai mic decât cel al extractului de CT (Figurile 2B și 2C). Un astfel de mecanism de acțiune al fucoidanului este diferit de o inactivare directă a celulelor prin extractul CT (Figura 1B). Prin comparație, fucoidanul a exercitat o eficacitate ridicată asupra inhibării infiltrației celulelor inflamatorii în pungi (Tabelul 1). Fucoidan a fost superior extractului de CT în blocarea migrației de neutrofile, monocite și limfocite la locurile de leziune a țesuturilor induse de carrageenan. Interesant este că nu a existat un efect anti-migrator sinergic, indicând diferite mecanisme de acțiune între extractul fucoidan și CT: adică, fucoidan blochează infiltrarea celulelor inflamatorii, în timp ce extractul de CT inhibă activarea celulelor.

Celulele polimorfonucleare, în special neutrofilele, sunt principalele componente celulare recrutate în situsurile inflamatorii acute induse de caragenan. În plus, rezultatele celulelor inflamatorii, cum ar fi macrofagele și limfocitele, joacă, de asemenea, roluri centrale în procesul inflamator prin secretarea citokinelor. Când a fost pre-tratat cu extract Fucoidan sau CT, numărul de globule albe care au migrat în pungile de aer injectate de carrageenan a fost semnificativ suprimat. Acest rezultat a fost în concordanță cu un efect care ar fi obținut de corticosteroizi precum dexametazona, dar nu de AINS, inclusiv indometacină. Prin urmare, se presupune că extractul fucoidan și CT au parțial o proprietate a steroizilor.

Pe lângă acțiunea de blocare a chimiotaxiei celulelor inflamatorii, extractul CT pare să suprime activarea macrofagelor. Acest lucru a fost confirmat de acțiunile sale inhibitorii asupra NO in vitro și in vivo, care este mediatorul inflamator major produs de macrofage. Astfel, efectul extractului CT asupra macrofagelor s-ar putea datora unei suprimări a exprimării ARNm și/sau unei inhibari directe a activității iNOS în aceste celule.

PGE2 este, de asemenea, unul dintre principalii mediatori inflamatori. Crește în paralel cu edemul tisular, care este suprimat de AINS, inhibitori ai COX. Caragenanul poate crește producția de PGE2 prin inducerea mARN-ului COX-II și a proteinei COX-II în exudatul pungii. În acest model, caragenanul a crescut semnificativ cantitatea de PGE2 și a fost suprimat substanțial de extractul CT. Este interesant de observat că acest rezultat a fost în concordanță cu un efect care ar fi obținut de un indometacin AINS. Prin urmare, din rezultate se deduce că extractul CT are proprietăți suplimentare ale AINS. Luat împreună, se crede că extractul CT a exercitat atât efecte corticosteroizi, cât și efecte asemănătoare AINS în modelul de inflamație indusă de caragenan și că fucoidanul a îmbunătățitefectele antiinflamatorii ale extractului CTprin blocarea infiltrației celulelor inflamatorii.

Deși definirea mecanismului exact de acțiune necesită studii suplimentare, un amestec de fucoidan și extract de CT a atenuat semnificativ semnele inflamatorii prin blocarea căilor TNF--NO și COX-II-PGE2 în inflamația pungii de aer indusă de caragenan. Aceste descoperiri oferă dovezi că tratamentul combinat al fucoidanului și al extractului CT ar putea fi un candidat promițător pentru ameliorarea diferitelor tipuri de inflamație care răspund la corticosteroizi sau AINS.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU INTERZIZEA BOLILOR INFLAMATORIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%