Abstract
Să investigheze efectele inhibitoare sinergice aleCistanche DeserticolaGlicozide feniletanoide (PHG) și glabridină (GLA) Pe pigmentarea pielii, raportul optim de masă dintre PHGS și GLA a fost preliminar ecranizat prin intermediulin vitroTeste de inhibare a activității tirozinazei, 1, 1- difenil -2- picrylhydrazyl (dpph) radical de epurare și 2,2'-azino-bis (3- Etilbenzotiazolină {{8} acid sulfonic) (abts⁺). Au fost efectuate evaluări suplimentare folosind trei modele celulare:

Un model de melanogeneză B16F10 indus de UVB pentru a evalua inhibarea sintezei melaninei prin activitatea tirozinazei și conținutul de melanină;

Un model inflamator HACAT indus de lipopolizaharide (LPS) pentru a evalua efectele antiinflamatorii prin măsurarea interleukinei -6 (IL -6) și a suprimării factorului de necroză tumorală- (TNF-);

Un AAPH (2,2'-Azobis (2- Amidinopropan) Model de stres oxidativ HACAT indus de dihidroclorură pentru a determina activitatea antioxidantă prin superoxid dismutază (SOD) și îmbunătățirea catalazei (CAT).

Raportul optim de masă PHG/GLA a fost identificat prin aceste modele. Rezultatele au demonstrat că soluțiile PHG/GLA (preparate în soluție salină tamponată cu fosfat, PBS, pH 6,8) la raporturi de masă de 1: 1, 5: 1 și 10: 1 au prezentat o inhibare semnificativă a tirozinazei și efecte antioxidante sinergice. Ratele de inhibare a tirozinazei au fost de 94,37%, 92,93%și, respectiv, 88,06%; Ratele de epurare radicală DPPH au atins 89,44%, 88,72%și 88,10%; Ratele de epurare ABTS⁺ au fost de 100,13%, 100,01%și 99,87%. La 25 ug/ml în DMEM, PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) nu a arătat citotoxicitate față de celulele B16F10 sau Hacat. PHGS/GLA (1: 1) Soluție DMEM afișatăInhibarea superioară a tirozinazei(23,80% activitate reziduală), în mod semnificativReducerea conținutului de melanină(30,90%) și au depășit alte raporturi și monoterapii în suprimarea IL -6/TNF- Eliberarea și îmbunătățirea activității SOD/CAT. Combinația sinergică de PHG și GLA a atenuat efectiv SHiperpigmentarea kin prin inhibarea melanogenezei, reducerea inflamației șiÎmbunătățirea capacității antioxidante.

Cuvinte cheie
CistancheDeserticola Glicozide feniletanoide; Glabridin; efect sinergic; anti-melanogeneză; antioxidant; antiinflamator; Materii prime farmaceutice

 

 

 

CistancheDeserticola extras cuNivel înaltGlicozide feniletanoide pentru albirea pielii

WhatsApp ne pentru mai multe detalii

 

Secțiune experimentală

1.1 Materiale, reactivi și instrumente

Celule de melanom de șoareceB16f10 (catalog nr.: STCC20013G -1), Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.

Keratinocite imortalizate umaneHacat (catalogul nr.: Icell-H066), Icell Bioscience Inc., Shanghai, China.

Glicozide feniletanoide cistanche (PHG)şiGLABRIDIN (GLA), Shaanxi Tianxingjian Biological Chemical Technology Co., Ltd.

Tirozinază, Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)şiL-tirozină, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China.

1, 1- difenil -2- picrylhydrazyl (dpph), Tokyo Chemical Industry Co., Japonia.

2, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Acid ascorbic (VC), Fabrica de reactivi chimici Tianjin Damao.

Persulfat de potasiuşiEtanol anhidru, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

Hidroxid de sodiu, Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipient Manufacturing Co., Ltd.

Fosfat de dipotasiu, Shanghai Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-dopa, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Kit de numărare a celulelor -8 (cck8), Beijing Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, sulfoxid de dimetil (DMSO), 2,2′-azobis (2- metilpropionamidină) dihidroclorură (aaph), șilipopolizaharide (LPS), Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

Mediu de glucoză ridicat DMEM, Thermo Fisher Scientific (China).

Ser bovin fetal (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Soluție penicilină-streptomicină, Shanghai Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Uman il -6 elisa kit, kit uman tnf- elisa, șiKit Human Cat ELISA, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Kit de analiză superoxid total (SOD), Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Toți reactivii au fost de grad analitic.

Instrumente utilizate:

Cititor de microplați cu lungime de undă multiskan FCşiHeracell 371 CO2 Incubator, Thermo Fisher Scientific, SUA.

KQ -200 VDB Cleaner ultrasonic, Kunshan Ultrasonicon Instruments Co., Ltd.

DVKW-D -2 baie de apă termostatică digitală, Fabrica de instrumente medicale Yongguangming din Beijing.

DHG -9246 Un cuptor de uscare cu explozie termostatică electrică, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.

Instrument de radiații ultraviolete KN4006B UVB(Intensitatea iradierii: 8 MW/cm²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Equipment Co., Ltd.

1.2 Metode

În primul rând, PHG-urile și GLA au fost dizolvate fie în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS, pH =6. 8) sau 50% soluție de etanol pentru a pregăti soluții cu concentrații de masă de{{0}}. 0 0 1, 0. {{1 0}} 05, 0,025, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 și 2,0 g/l. Apoi, PHG -urile și GLA au fost amestecate în raporturi dem (phgs): m (gla)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20 și 1:40, pentru a pregăti soluții PHG/GLA cu o concentrație totală de masă de0.4 g/L, etichetat caPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), respectiv.

 

1,3 Experimente biochimice

1.3.1 Test de inhibare a activității tirozinazei

Într -o placă de puț 96-,50 µl din soluția de probă de testare, 50 µl de PBS (ph =6. 8), și50 µL de soluție de L-tirozină (1 g/L)au fost adăugate secvențial. Placa a fost incubată într -o baie de apă de 37 de grade timp de 10 minute. Apoi,5 0 µl de soluție de tirozinază (0,4 g/L, echivalent cu 200 U/ml)S -a adăugat și farfuria a fost incubată din nou în baia de apă de 37 de grade pentru încă 10 minute.

Arbutin (ARB)a fost folosit ca control pozitiv șiPBS (pH =6. 8)a fost folosit ca control gol.

Absorbția soluției la490 nma fost măsurată folosind un cititor de microplate, iar rata de inhibare in vitro tirozinază (%) a fost calculată folosind ecuația (1).

 

 

În formula:

A _ reacțieeste absorbția soluției de probă care conține soluție de L-tirozină, PBS și soluție de tirozinază.

A _ Control de reacțieeste absorbția soluției de probă care conține soluție de L-tirozină și PBS fără soluție de tirozinază.

A _ goleste absorbția soluției care conține soluție de L-tirozină, PBS și soluție de tirozinază fără probă.

A _ Control goleste absorbția soluției care conține soluție de L-tirozină și PBS fără soluție de probă și tirozinază.

1.3.2 Determinarea activității de epurare a radicalilor liberi DPPH

În primul rând, {{0}}. 0197 g (0,05 mmol) de DPPH a fost cântărit cu exactitate și dizolvat în 250 ml de etanol anhidru pentru a pregăti o soluție de lucru DPPH cu o concentrație de concentrație de concentrație de concentrație0. 2 mmol/l.

Apoi, PHG -urile și GLA au fost dizolvate în 50% etanol pentru a pregăti soluții de etanol de PHG și GLA cu concentrații în masă de{{0}}. 0 0 1, 0. 0 1, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 și 2,0 g/l. Soluțiile de etanol ale VC au fost preparate în același mod.

Ulterior, soluțiile de etanol ale PHG -urilor și GLA au fost amestecate în raporturi dem (soluție PHGS): m (soluție GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40pentru a obține 9 soluții de etanol de PHG/GLA cu diferite raporturi de masă, etichetate caPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

În cele din urmă,100 µl din fiecare soluție de probăşi100 µl din soluția de lucru DPPHau fost adăugate la o placă de puț 96-, amestecată uniform și incubată la temperatura camerei în întuneric timp de 30 de minute. Absorbanța la517 nma fost măsurat folosind un cititor de microplate. VC a fost utilizat ca control pozitiv și fiecare experiment a fost repetat de trei ori.

Rata de epurare a radicalilor liberi DPPH (%) a fost calculată folosind ecuația (2).

 

În formula:

A1este absorbția soluției de probă + soluția de lucru DPPH.

A2este absorbția soluției de lucru de 50% etanol + DPPH.

A3este absorbția soluției de probă + 50% etanol.

 

1.3.3 Determinarea activității de epurare a radicalilor liberi ABTS

Primul,1 g (1,82 mmol) de abtsa fost dizolvat în apă deionizată pentru a pregăti o soluție de lucru ABTS cu o concentrare finală de7,4 mmol/L.. 0. 5 g de persulfat de potasiua fost dizolvat în apă deionizată pentru a pregăti o soluție de lucru cu persulfat de potasiu cu o concentrație finală de2,6 mmol/L.. Volumele egale ale soluției de lucru ABTS și soluția de lucru a persulfatului de potasiu au fost amestecate și au fost lăsate să reacționeze la întuneric timp de 12 ore pentru a pregăti soluția de lucru ABTS⁺.

Apoi, soluții de etanol de PHG, GLA și VC, precum și soluții de etanol PHG/GLA cu raporturi de raporturi dePHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), au fost preparate conform metodei descrise în secțiunea 1.3.2.

În cele din urmă,40 µl din fiecare soluție de probăşi160 µl din soluția de lucru ABTS⁺au fost adăugate la o placă de puț 96-, amestecată uniform și au reacționat în întuneric la temperatura camerei timp de 6 minute. Absorbția soluției la734 nma fost măsurat folosind un cititor de microplate.

Rata de epurare a radicalilor liberi ABTS⁺ (%) a fost calculată folosind ecuația (3).

 

 

În formula:

A1este absorbția soluției de probă + soluția de lucru ABTS⁺.

A2este absorbția apei deionizate + soluție de lucru ABTS⁺.

A3este absorbția soluției de probă + apa deionizată.

1,4 Experimente celulare

1.4.1 Cultura celulară

După reînvierea celulelor B16F10 și Hacat, acestea au fost însămânțate în mediu DMEM ridicat de glucoză (conținând 10% ser bovin fetal și 1% soluție de penicilină-streptomicină) și cultivate la37 de grade, 5% CO2, și70% umiditateîntr -un incubator timp de 24 de ore. Starea de creștere a celulelor a fost observată la microscop, iar modificările medii sau pasajele au fost efectuate după cum este necesar pe baza condiției de creștere a celulelor.

1.4.2 Grupare experimentală

Celulele logaritmice în faza B16F10 și HACAT au fost însămânțate în plăci de puț 96- la o densitate celulară adecvată și cultivate timp de 24 de ore pentru a permite aderența celulelor. Soluțiile de probe cu concentrații diferite au fost preparate folosind mediu DMEM.

Grupurile experimentale au fost următoarele:

Grup normal

Grup de model

PHGS Grup cu doze mici(125 ug/ml)

PHGS Grup cu doze medii(250 ug/ml)

PHGS Grup cu doze mari(500 ug/ml)

GLA GRUPE GRASS DOSIDE(6,25 ug/ml)

GLA Grup cu doze medii(12,5 ug/ml)

GLA GRUPE cu doze mari(25 ug/ml)

Grup PHGS/GLA (1: 1)(25 ug/ml)

Grup PHGS/GLA (5: 1)

Grup PHGS/GLA (10: 1)

PentruModel de pigmentare indus de UVB în celulele B16F10, celulele grupului model au fost tratate cu30 µl de PBS (pH =7. 4)și iradiat sub un instrument de radiații ultraviolete UVB laCu 3 cm sub dispozitivpentru110 secunde. Grupurile experimentale au fost pretratate cu100 µl din diferite soluții de probătimp de 1 oră înainte de a adăuga30 µl de PBSși iradierea sub dispozitivul UVB timp de 110 secunde. Grupul normal a fost tratat continuu cu mediu DMEM cu glucoză mare, iar grupul gol nu conținea celule, dar a fost înlocuit cu o cantitate egală de mediu.

PentruModelul de inflamație indus de LPS în celulele HACAT, grupul model a fost tratat cu20 UG/ML Soluție PBS LPStimp de 24 de ore. Grupurile experimentale au fost pretratate cu100 µl din diferite soluții de probătimp de 24 de ore înainte de a adăuga20 UG/ML Soluție LPSîncă 24 de ore. Grupul normal a fost tratat continuu cu mediu DMEM cu glucoză mare, iar grupul gol nu conținea celule, dar a fost înlocuit cu o cantitate egală de mediu.

PentruModel de stres oxidativ indus de AAPH în celulele HACAT, grupul model a fost tratat cu25 mmol/l aaph Soluțietimp de 24 de ore. Grupurile experimentale au fost pretratate cu100 µl din diferite soluții de probătimp de 24 de ore înainte de a adăuga25 mmol/l aaph Soluțieîncă 24 de ore. Grupul normal a fost tratat continuu cu mediu DMEM cu glucoză mare, iar grupul gol nu conținea celule, dar a fost înlocuit cu o cantitate egală de mediu.

Fiecare grup a fost înființat cu3 replică puțurileși cultivat la37 de grade, 5% CO2, și70% umiditateÎntr -un incubator.

1.4.3 Test de citotoxicitate

Citotoxicitatea a fost măsurată folosindMetoda CCK8. Celulele logaritmice în fază B16F10 și HACAT au fost digerate cu0. 25% Trypsintimp de 3 minute. După ce digestia a fost oprită cu mediul, celulele au fost pipetate în mod repetat pentru a pregăti o suspensie de celule cu o densitate de1 × 10⁴ celule/ml. Celulele au fost însămânțate uniform în plăci de puț 96- la100 µl pe godeuși PBS a fost adăugat la puțurile periferice. După aderarea celulară, s -au adăugat diferite concentrații de soluții de probă, cu3 replică puțuri pe grupși celulele au fost cultivate la37 de grade, 5% CO2, și70% umiditatepentru24, 48 și 72 de oreÎnainte de a arunca mediul.

Pentru toate grupurile,100 µL de mediu CCK8 DMEM cu glucoză mare (conținând 10% CCK8)a fost adăugat și incubat pentru60 de minute. Absorbția soluției la450 nma fost măsurat folosind un cititor de microplate.

Viabilitatea celulară (%) a fost calculată folosind ecuația (4).

 

În formula:

A _ tratateste absorbția celulelor care conține bine, soluția CCK8 și soluția de probă.

A _ goleste absorbția soluției de mediu și CCK8 care conține bine, dar fără celule.

A0este absorbția celulelor care conține bine și soluția CCK8, dar fără soluția de probă.

1.4.4 Test de activitate tirozinazei

Metoda L-DOPA a fost utilizată pentru a măsura activitatea tirozinazei. După tratarea celulelor pentru48 de oreAșa cum este descris în secțiunea 1.4.2, supernatantul a fost aruncat, iar puțurile au fost spălate de două ori cu PBS (pH =7. 4). Apoi,50 µl de 1% Triton x -100 soluțiea fost adăugat la fiecare fântână și a fost plasat imediat într -un congelator de –80 grade pentru30 de minute. Celulele au fost dezghețate la temperatura camerei pentru a induce liza.

După pre-încălzire la37 de gradepentru5 minute, 10 µl de soluție de 10 mmol/L-DOPAa fost adăugat la fiecare fântână și incubat la37 de grade, 5% CO2 și 70% umiditatepentru1 oră. Absorbanța la475 nma fost măsurat folosind un cititor de microplate. Fiecare experiment a fost repetatde trei ori, iar activitatea tirozinazei (%) a fost calculată folosind ecuația (5).

În formula:

A _ experimenteste absorbția celulelor care conține bine și soluția de probă sub iradierea UVB.

A _ normaleste absorbția celulelor care conține bine și soluția de probă fără iradierea UVB.

A _ goleste absorbția fântânii care conține mediu, dar fără celule.

 

1.4.5 Măsurarea conținutului de melanină

Metoda de liză NaOH a fost utilizată pentru a măsura conținutul de melanină. După tratarea celulelor pentru72 de oreDupă cum este descris în secțiunea 1.4.2, supernatantul a fost aruncat, iar puțurile au fost spălate de două ori cu PBS.100 µl de soluție apoasă NaOH conținând 10% DMSO (1 mol/L)a fost adăugat la fiecare fântână, iar placa a fost plasată într -unCuptor de 90 de gradepentru1 oră. Absorbanța la490 nma fost măsurat folosind un cititor de microplate. Fiecare experiment a fost repetatde trei ori, iar conținutul de melanină (%) a fost calculat folosind ecuația (5).

 

1,5 Măsurarea factorilor inflamatori și a indicatorilor de stres oxidativ

După tratarea celulelor pentru48 de oreașa cum este descris în secțiunea 1.4.2,Celulele hacatDin fiecare grup au fost colectate folosind un raclet de celule, centrifugat, iar supernatantul a fost colectat. Concentrațiile IL -6 și TNF- au fost măsurate conform instrucțiunilor kiturilor ELISA.

După tratarea celulelor pentru48 de ore, Celulele hacat au fost colectate folosind un racper de celule, supuse unor cicluri repetate de îngheț-dezgheț pentru a induce liza celulară și centrifugate la12, 000 rpm pentru 10 minute la 4 grade. Supernatantul a fost colectat și activitățileGAZONși concentrații dePISICĂau fost măsurate folosind instrucțiunile ELISA Kit.

 

1,6 Măsurarea indicelui combinate

Metoda Indexului Combinației (CI)[20] a fost utilizat pentru a evalua dacă combinația de PHG -uri și GLA la diferite raporturi de masă au prezentat efecte sinergice în inhibarea activității tirozinazei și a antioxidației. Indicele de combinație a fost calculat folosind ecuația (6).

 

În formula:

D1şiD2reprezintă concentrațiile respective (g/l) ale celor două medicamente în tratamentul combinat necesar pentru realizareX% Activitate.

DXreprezintă concentrația (g/l) a fiecărei substanțe individuale atunci când este folosită singură pentru a realizaX% Activitate.

Software Compusyna fost utilizat pentru calcule:

CI> 1indică un efect antagonist.

CI=1indică un efect aditiv.

CI <1indică un efect sinergic.

 

1.7 Analiza datelor

Toate datele au fost exprimate ca"Media ± abaterea standard (X̄ ± S)"și discuțiile s -au bazat pe valorile medii.

Analiza statistică a fost efectuată folosindGraphPad Prism 9.5. 0. ANOVA unidirecțional (analiza varianței) a fost utilizată pentru comparații între mai multe grupuri. OP-valoare <0. 05a fost considerat semnificativ statistic.