Direcționarea lactat dehidrogenazei A cu catechina resensibilizează celulele canceroase gastrice SNU620/5FU la 5-fluorouracil partea 1

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Abstract:Rezistența la terapiile anticancer apare practic în orice tip de cancer și devine o dificultate majoră în tratamentul cancerului. Deși 5-fluorouracilul (5FU) este alegerea de primă linie a terapiei anticanceroase pentru cancerul gastric, eficacitatea acestuia este limitată din cauza rezistenței la medicamente. Recent, metabolizarea alterată a cancerului, inclusiv efectul Warburg, o preferință pentru glicoliză, mai degrabă decât fosforilarea oxidativă pentru producerea de energie, a fost acceptată ca un mecanism pivot de reglare a rezistenței la chimioterapie. Astfel, am investigat mecanismul detaliat și posibila utilitate a agenților antiglicolitici în ameliorarea rezistenței la 5FU folosind linii de celule de cancer gastric consacrate, SNU620 și SNU620/5FU. deenzime legate de glicoliză, cum ar fi lactat dehidrogenaza A(LDHA), decât cele ale celulelor părinte SNU620. Pentru a limita glicoliza, am examinat catechina și derivații săi, care sunt cunoscuțiantiinflamatorși produse naturale anticanceroase, deoarece galatul de epigalocatechină a fost raportat anterior ca un supresor al expresiei LDHA. Catechina, cel mai simplu compus dintre ele, a avut cel mai mare efect inhibitor asupra producției de lactat și activității LDHA. În plus, combinația de 5FU și catechină a arătat o citotoxicitate suplimentară și a indus apoptoza mediată de specii reactive de oxigen (ROS) în celulele SNU620/5FU. Astfel, pe baza acestor rezultate, sugerăm catechina ca candidat pentru dezvoltarea unui nou medicament adjuvant care reduce chimiorezistența la 5FU prin restricționarea LDHA.

Cuvinte cheie:5-fluorouracil;chimiorezistent; glicoliza; lactat dehidrogenază; catechina

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

1. Introducere

S-au realizat progrese remarcabile în tratamentul cancerului gastric cu rezecția chirurgicală a tumorii primare și chimioterapie combinată pe bază de 5-fluorouracil (5FU), cum ar fi epirubicina, cisplatină și fluorouracil și docetaxel, oxaliplatin și 5FU[1 ,21 Până în prezent, 5FU, un analog al uracilului care blochează sinteza ADN-ului prin inhibarea timidilat sintetazei [3], rămâne un medicament de chimioterapie utilizat în mod obișnuit pentru tratamentul cancerului gastric [1, A4]. Cu toate acestea, eficacitatea clinică a chimioterapiei a fost nesatisfăcătoare din cauza recidivei cancerului primar sau metastatic legat de rezistența la medicamente [1,5].

Cistanche poate îmbunătăți imunitatea

Mai multe procese celulare sunt considerate mecanisme cheie care stau la baza chimiorezistenței, inclusiv activarea sau inactivarea medicamentelor, mașinile de reparare a leziunilor ADN, modificările țintelor medicamentului, inactivarea căilor apoptotice și autofagia crescută [6,7]. Cancerul este eterogen și diverse tipuri de cancer utilizează atât glicoliza, cât și fosforilarea oxidativă pentru metabolismul energetic [8]. Cu toate acestea, reprogramarea metabolică, în special glicoliza aerobă anormală, a fost raportată ca un jucător cheie în dezvoltarea rezistenței la medicamentele chimioterapeutice, inclusiv 5FU, în cancerul gastric [9]. Lactat dehidrogenaza A (LDHA) și piruvat dehidrogenază kinaze (PDK) sunt cunoscuți ca regulatori cheie ai glicolizei aerobe care produc lactat din piruvat [10,11]. Combinația de dicloracetat, un inhibitor stabilit al PDK, restabilește sensibilitatea față de 5FU [12]. În plus, LDHA, o enzimă cheie care catalizează conversia piruvatului în lactat, a fost raportată ca o țintă potențială pentru tratamentul cancerului gastric [13,14]. Reducerea expresiei LDHA în celulele canceroase inhibă tumorigenitatea prin creșterea respirației mitocondriale și reducerea viabilității celulelor [15]. Mai mulți inhibitori LDHA, cum ar fi FX11, PSTMB și GSK 2837808A, diminuează nivelurile de ATP și generează stres oxidativ și, în final, provoacă moartea celulelor apoptotice [16-18]. Deși un studiu a demonstrat că inhibarea LDHA de către microARN-34a a recuperat rezistența la 5FU în cancerul de colon [19], niciun studiu anterior nu a raportat efectele inhibitorilor LDHA genetici sau farmacologici asupra chimiorezistenței.

Polifenolii din ceaiul verde, inclusiv catechina (CA), epicatechina (EC), galocatechina (GC), epigalocatechina (EGC), epicatechina-3-galatul (ECG) și epigalocatechina-3-galatul (EGCG), promovează umanitatea sănătate prin prevenirea și tratarea mai multor boli, inclusiv inflamația, diabetul, bolile cardiovasculare și cancerul malign [20,21]. Dintre polifenoli, EGCG mărește chemosensibilitatea la 5FU în celulele cancerului colorectal și a carcinomului hepatocelular prin activarea căilor AMPK și restricționarea stării cancerului [22,23]. În plus, s-a raportat că EGCG inhibă LDHA prin reprimarea expresiilor sale în celulele canceroase de sân și pancreas [24,25].

În acest studiu, am emis ipoteza că CA ar putea fi un candidat pentru un medicament adjuvant pentru reducerea rezistenței la 5FU în celulele canceroase gastrice. S-a examinat că efectul inhibitor al CA și/sau combinația sa cu 5FU asupra activității LDHA a indus astfel speciile reactive de oxigen mitocondriale (ROS) și moartea celulelor apoptotice în celulele rezistente la 5FU.

2. Rezultate

2.1. Caracteristicile glicolitice ale celulelor rezistente la 5FU

Proliferarea sporită este o caracteristică a chimiorezistenței, inclusiv a celulelor canceroase rezistente la 5FU [26,27]. În primul rând, am confirmat rezistența la 5FU și ratele de creștere pe termen lung ale celulelor SNU620 și SNU620/5FU. Când aceste celule au fost cultivate cu concentrațiile indicate de 5FU timp de 48 de ore, doza estimată care provoacă inhibarea creșterii de 50% (Gl50) în celulele SNU620/5FU (100,63 uM) a fost mult mai mare decât cea care a cauzat GIso în celulele parentale SNU620 （28 μM. ）（Figura 1A și Figura suplimentară S1）. În plus, ratele de creștere ale celulelor SNU620/5FU au fost mai rapide decât cele ale celulelor SNU620 (Figura 1B și Figura suplimentară S2). Deoarece chimiorezistența și caracteristicile de creștere rapidă ar putea fi legate de proprietățile glicolitice crescute în celulele canceroase gastrice [28], ratele de acidificare extracelulară (ECAR) și ratele de consum de oxigen (OCR) au fost măsurate în ambele celule în prezența oxamatului, un bine-cunoscut. inhibitor de glicoliză sau nu. Rezultatele au demonstrat că celulele SNU620/5FU au secretat semnificativ mai mult lactat decât cel secretat de celulele SNU620 și, ulterior, au acidulat mediul de cultură (Figura 1C și Figura suplimentară S3). Cu toate acestea, nu a fost observată nicio schimbare semnificativă a OCR între aceste celule (Figura 1D). Au fost măsurate nivelurile de exprimare a mARN și proteine ​​ale LDHA. Expresia LDHA a fost mai mare în celulele SNU620/5FU decât în ​​celulele SNU620 (Figura 1E, F). În plus, am examinat nivelurile de expresie a ARNm și a proteinei ale izotipurilor PDK și am constatat că cele ale PDK2 și PDK3 au fost mai mari în celulele SNU620/5FU decât în ​​celulele SNU620 (Figura suplimentară S4A, B). Fosforilarea subunității E1 a piruvat dehidrogenazei (PDHA1), care a fost crescută de PDK, a fost, de asemenea, evaluată și sa constatat că este mai mare în celulele SNU620/5FU decât în ​​celulele SNU620 (Figura suplimentară S4C). În plus, am folosit oxamat ca inhibitor LDHA pentru a depăși rezistența la 5FU în celulele SNU620/5FU. Acest compus a inhibat creșterea celulelor atât în ​​celulele SNU620, cât și în celulele SNU620/5FU (Figura suplimentară S5). În plus, cotratamentul cu oxamat și 5FU a suprimat creșterea celulelor, în comparație cu tratamentul individual cu oxamat sau celule 5FUin SNU620/5FU (Figura 1G). Aceste date sugerează că celulele SNU620/5FU exprimă foarte mult LDHA, iar inhibarea activității LDHA poate depăși rezistența celulelor SNU/5FU la 5FU.

Figura 1. Conform rezultatelor,5-celulele rezistente la fluorouracil (5FU) au o caracteristică glicolitică crescută: celulele (A)SNU620 și SNU620/5FU au fost tratate cu concentrațiile indicate de 5FU timp de 48 de ore. Viabilitatea acestor celule a fost evaluată prin test MTT; (B) nivelurile de creștere ale celulelor SNU620 și SNU620/5FU au fost măsurate în fiecare zi timp de 4 zile cu test MTT; Celulele (C,D)SNU620 și SNU620/5FU au fost tratate cu oxamat ( 5mM) sau nu timp de 24 de ore, iar valorile ECAR și OCR au fost evaluate cu analizorul Seahorse XF; (E, F) expresiile LDHA în celulele SNU620 și SNU620/5FU au fost detectate prin qRT-PCR și analiză Western blot; (G) Celulele SNU620 și SNU620/5FU au fost tratate cu oxamat (25 mM) și/sau 5FU（10μM） timp de 48 de ore. Rezultatele sunt afișate ca medie ± SEM.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA suprimă activitatea LDHA

Producția de lactat a fost analizată cu CA și derivații săi, inclusiv EC, GC, EGC și EGCG, în celulele SNU620/5FU. În comparație cu acești derivați, CA a redus producția de lactat mai eficient (Figura 2A). În plus, in vitro, activitatea LDHA, așa cum se spune, a fost confirmată, iar CA a arătat un efect inhibitor mai puternic asupra activității LDHA decât cele ale derivaților săi (Figura 2B). Efectele inhibitoare ale CA asupra activităților LDHA și LDHB in vitro au fost măsurate într-o manieră dependentă de doză. CA a inhibat activitatea LDHA fără a afecta activitatea LDHB (Figura 2C, D). În plus, activitățile LDHA și LDHB au fost măsurate cu EGCG, despre care se știe că inhibă activitatea LDHA și s-a constatat că au scăzut în funcție de doză (Figura suplimentară S6A, B). Mai mult, activitățile intracelulare LDHA și LDHB au fost evaluate cu concentrațiile indicate de CA în celulele SNU620/5FU. CA a inhibat activitatea LDHA într-o manieră dependentă de doză, rezultatele in vitro, dar nu și activitatea LDHB (Figura 2E, F). Nivelurile de expresie a proteinelor p-PDHA1, PDK2, PDK3 și LDHA au fost, de asemenea, măsurate în celulele SNU620/5FU după tratamentul CA (Figura suplimentară S7) și am observat că acestea nu au fost afectate de acest tratament. Aceste rezultate sugerează că CA reglează activitatea LDHA fără a-i afecta expresia.

2.3. Modul de acțiune al inhibiției LDHA de către CA

Pentru a analiza mecanismul de inhibare a activității LDHA asupra CA și derivații săi, am efectuat modelarea moleculară a interacțiunii de legare dintre LDHA recombinant uman și CA (Figura 3A, B). Rezultatele au arătat că CA poate interacționa cu reziduurile de T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 și T247 ale LDHA. Printre acestea, R105, S136 și R168 sunt critice pentru legarea substratului (piruvatului). Astfel, am presupus că CA ar putea interfera cu situsurile de legare a substratului. Dimpotrivă, EGCG este legat de LDHA printr-un alt site. Pentru a verifica în continuare modul de acțiune al inhibării LDHA de către CA, diagramele Michaelis-Menten și Lineweaver-Burk au fost confirmate cu diferite concentrații de piruvat și CA. Activitatea LDHA a fost crescută într-o manieră dependentă de doză de piruvat. Cu toate acestea, aceasta a fost inversată de creșterea CA. Astfel, rezultatele diagramelor Michaelis-Menten și Lineweaver-Burk au arătat că CA este un inhibitor necompetitiv al LDHA (Figura 3C, D). În plus, datele calorimetriei de titrare izotermă (ITC) au demonstrat că CA se leagă fizic de LDHA printr-un Kd. valoare de 197 uM (Figura suplimentară S8). Aceste rezultate oferă informații că CA suprimă activitatea LDHA prin legarea situsului de legare a substratului al LDHA.

2.4. CA resensibilizează rezistența la 5FU prin reducerea activității LDHA

Am evaluat efectele citotoxice ale CA asupra celulelor SNU620 și SNU620/5FU și am constatat că CA a suprimat creșterea în ambele grupuri de celule (Figura 4A). Pentru a verifica dacă inhibarea creșterii a fost legată de suprimarea activității LDHA, expresia LDHA a fost abolită de acidul ribonucleic în ac de păr scurt (shRNA) pentru LDHA (shLDHA) și expresia sa a fost recuperată prin transfecția plasmidei care exprimă LDHA (Figura suplimentară S9A, B). ). În celulele SNU620/5FU transfectate cu shLDHA, producția de lactat și viabilitatea celulelor nu au fost modificate semnificativ de tratamentul cu CA, în comparație cu cele ale celulelor simulate transfectate (Figura 4B, C). În plus, efectul inhibitor al creșterii al CA a fost crescută de recuperarea exprimării LDHA în celulele SNU620/5FU cu LDHA-knockdown (Figura 4D). În plus, celulele SNU620 și SNU620/5FU au fost examinate în urma tratamentului cu CA și 5FU în mod individual sau o combinație a ambelor. Cotratamentul cu CA și 5FU a inhibat semnificativ creșterea celulelor SNU620/5FU (Figura 4E). În plus, efectele combinate ale CA și 5FU au fost examinate în mai multe alte linii celulare, cum ar fi cancerul gastric uman AGS, cancerul pancreatic Panic-1, MIA PaCa-2 și celulele cancerului de colon LS174T și RKO, în comparație cu SNU620 și SNU620/5FUcells. Producția de lactat și expresia LDHA au arătat o corelație bună între ele, iar aceste proprietăți glicolitice sunt relativ ridicate în SNU620/5FU, AGS și RKO (Figura suplimentară S10A, B). Mai mult, tratamentul combinat cu CA și 5FU a redus semnificativ viabilitatea celulelor, în comparație cu un singur tratament cu 5FU în celulele glicolitice, inclusiv AGS și RKO (Figura suplimentară S10C). Cu toate acestea, cotratamentul cu CA și 5FU nu a inhibat semnificativ creșterea celulelor SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2 și LS174T, care au prezentat expresii scăzute de LDHA. Aceste rezultate au sugerat că efectul de sensibilizare al CA la celulele rezistente la 5FU ar putea fi legat de efectul său inhibitor asupra activității LDHA.

Figura 2. Catechina (CA) inhibă activitatea LDHA, dar nu și expresia acesteia: (A) producția de lactat de SNU620/5FU a fost măsurată după tratamentul cu derivați CA (10 μM) timp de 24 de ore; (B) activitatea LDHA in vitro a fost evaluată după tratament cu derivați de CA (10 uM) și oxamat (20 mM); (C, D) in vitro, activitățile LDHA și LDHB au fost estimate cu concentrațiile indicate de CA; (E, F) celulele au fost tratate cu concentrațiile indicate de CA timp de 24 de ore. Activitățile intracelulare LDHA și LDHB au fost măsurate folosind lizatele celulare ca sursă de enzime. Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SEM. **p<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Figura 4. Viabilitatea celulară a fost inhibată prin cotratament cu catechină (CA) și 5-fluorouracil (5FU) în celulele rezistente la 5FU: (A) viabilitatea celulelor SNU620 și SNU620/5FU a fost evaluată după tratamentul cu concentrațiile indicate de CA timp de 48 de ore; (B) Celulele SNU620/5FU-pLKO.1 și SNU620/5FU-shLDHA au fost tratate cu CA (10 μM) timp de 24 de ore. Producția de lactat a fost măsurată în mediile de cultură ale celulelor SNU620/5FU-pLKO.1 și SNU620/5FU-shLDHA; (C, D) SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA plus EV și celulele SNU620/5FU-shLDHA plus LDHA#2 au fost tratate cu concentrațiile indicate de CA timp de 48 de ore. Viabilitatea celulei a fost măsurată folosind un test MTT; (E) Celulele SNU620 și SNU620/5FU au fost tratate cu CA (10 μM) și/sau 5FU (10 μM) timp de 48 de ore. Viabilitatea acestor celule a fost măsurată prin testul MTT. Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Acest articol este extras din Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms