Cum proteinele de reparare a membranei celulare reglează transducția semnalului factorului de transcripție pentru a controla fibroza renală

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

Rinichifibroza este asociată cu progresia acutuluirinichileziuni ale bolii cronice de rinichi. S-a demonstrat că MG53, o proteină de reparare a membranei celulare, protejează împotriva leziunilor celulelor epiteliale renale și a leziunilor renale acute. Aici, am evaluat rolul MG53 în modularearinichifibroza la șoarecii în vârstă și la șoarecii cu obstrucție ureterală unilaterală (UUO) un model cunoscut de fibroză renală progresivă. Șoarecii cu ablația MG53 au dezvoltat mai multă fibroză interstițială odată cu vârsta decât șoarecii intacți MG53-de aceeași vârstă. În mod similar, în absența MG53,rinichifibroza a fost exagerată în comparație cu șoarecii cu intactMG53 în rinichiul obstrucționat în comparație cu rinichiul neobstrucționat contralateral sau cu rinichii șoarecilor operați de simulare. Ureterul obstrucționatrinichide la șoarecii cu deficit de MG53 au prezentat, de asemenea, semnificativ mai multă inflamație decât rinichii obstrucționați ureterali de la șoarecii intacți MG53. Experimentele in vitro au demonstrat că MG53 ar putea intra în nucleele celulelor epiteliale tubulare proximale și poate interacționa direct cu componenta p65 a factorului de transcripție NF-kB, oferind o posibilă explicație a inflamației sporite în absența MG53. Pentru a testa acest lucru, s-a administrat șoarecilor supuși UUO expresia îmbunătățită a MG53 prin celule modificate sau livrare directă de proteine ​​recombinate. Acest lucru a redus activarea și inflamația NF-kB și a atenuat fibroza renală. Astfel, MG53 poate avea un rol terapeutic în tratarea inflamației cronice a rinichilor și, prin urmare, oferă protecție împotrivafibrozăcare duce la fenotipul bolii renale cronice.

Cistanche tubulosa previne bolile de rinichi, faceți clic aici pentru a obține mostra

Declarație translațională Inflamația cronică duce la remodelarea fibrotică care poate sta la baza tranziției de la leziunea acută a rinichilor la boala cronică de rinichi. Activarea factorului de transcripție protein-inflamator factor nuclear-kB (NF-kB) este implicată în patogenia inflamației rinichilor. Aici, oferim dovezi că MG53, o proteină de reparare a membranei celulare identificată anterior, interacționează direct cu NF-kB și îi reduce activitatea transcripțională. Concomitent, MG53 administrat exogen poate scădea remodelarea fibrotică a rinichiului inflamat. Aceste descoperiri indică o interacțiune protectoare între MG53 și NF-kB pentru a atenua dezvoltarea fibrozei renale mediată de inflamație. Administrarea farmacologică a MG53 ar putea fi o abordare promițătoare pentru tratamentul fibrozei renale progresive.

Disfuncția renală, care poate fi clasificată ca leziune renală acută (AKI) sau boală renală cronică (CKD), a devenit o epidemie la populațiile mai în vârstă. În 2017, prevalența CKD a ajuns la 14,5% dintre persoanele cu vârsta de 65 de ani și peste, ceea ce a dus la cheltuieli Medicare de peste 84 de miliarde de dolari pentru tratament.^1,2AKI și CKD sunt mai frecvente la persoanele în vârstă, în principal din cauza susceptibilității crescute la răni plus o capacitate diminuată de a repara rinichiul îmbătrânit. Studiile clinice au arătat că CKD este un factor de risc major pentru AKI și, dimpotrivă, episoadele de AKI pot accelera progresia CKD către boala renală în stadiu terminal. În prezent, tratamentul AKI este în principal de susținere, iar tratamentul CKD stabilit este axat pe încetinirea progresiei prin inhibarea sistemului renină-angiotensină-aldosteron și acum posibil prin inhibarea cotransportatorului sodiu-glucoză-2.^3,4

În funcție de severitatea leziunii, celulele tubulare proximale, ținta majoră a leziunii acute, pot suferi modificări în progresia ciclului celular,5,6 metabolism,7 secreție de citokine proteico-inflamatorii și profibrotice sau tranziție parțială epitelial-mezenchimală,8 care va determina dacă remodelarea/repararea va avea succes sau dezadaptare și va duce la fibroză renală, un semn distinctiv al CKD.9,10 Această remodelare are loc în general pe un fundal de inflamație a rinichilor,

aportul vascular diminuat și producerea de proteine ​​din matricea extracelulară (ECM) și include pierderea celulelor epiteliale și acumularea de colagen, actină a mușchilor neted și fibronectină; are, de asemenea, o corelație mare cu deteriorarea funcției renale.

Inflamația cronică duce la remodelarea fibrotică care poate sta la baza tranziției de la AKI la CKD.11–13 Cercetările cumulate sugerează implicarea factorului de transcripție factor nuclear-kB (NF-kB) în patogeneza inflamației renale cauzate de infecție, leziuni, sau transplant.11,12,14 Activarea căii canonice NF-kB începe cu activarea inhibitorului kinazei NF-kB (IkB), care duce la fosforilarea și degradarea IkBa și la translocarea nucleară a heterodimerilor NF-kB.15 Activarea semnalizării NF-kB în celulele epiteliale renale și celulele imune infiltrate pot fi declanșate de factori declanșatori fiziopatologici, cum ar fi expunerea la lipopolizaharide (LPS) sau leziuni de ischemie-reperfuzie.16 Studiile de profil molecular dezvăluie nfkb1 ca un factor major al fibrozei renale.¹⁷Pe lângă celulele tubulare ale rinichilor, celulele imune înnăscute, cum ar fi macrofagele și celulele dendritice, contribuie, de asemenea, la leziuni renale, inflamații și remodelare fibrotică.^13,18–20

cistanche este eficientă în tratarea disfuncției renale

Dovezile tot mai mari sugerează că factorii secretori derivați din mușchi (adică miokinele) modulează fiziologia sistemică prin diafonia tisulară pentru a influența progresia bolilor renale.²¹MG53 (denumit și TRIM72) este o proteină tripartită îmbogățită cu mușchi (TRIM) cu o funcție critică în repararea membranei celulare.22,23 Proteinele familiei TRIM au diverse funcții, de la reglarea semnalizării imune la repararea țesuturilor.²⁴Repararea membranei mediată de MG53-este implicată în atenuarea leziunilor acute ale mușchilor scheletici,²⁵rinichi,²⁶inima,²⁷ plămâni, 28 creier,^29,30si pielea.³¹Studiile noastre anterioare au identificat un nivel scăzut de expresie a MG53 în rinichi, care este o componentă cheie în protecția AKI, iar șoarecii cu deficit de MG53 (mg53 / ) au fost mai sensibili la AKI indusă de stres.²⁶De asemenea, am demonstrat recent că creșterea susținută a MG53 în circulație îmbunătățește repararea și regenerarea leziunilor tisulare.

Recent, a evoluat un rol emergent al MG53 în modularea protecției țesuturilor prin inhibarea inflamației, în special prin modularea semnalizării NF-kB. De exemplu, MG53 atenuează neurotoxicitatea și neuro-inflamația induse de LPS prin inhibarea căii TLR4/NF-kB33, iar MG53 cardiac reglează expresia KChIP2 pentru a controla remodelarea electrofiziologică în timpul hipertrofiei cardio.34 În plus, am demonstrat o funcție dublă a MG53 în prevenirea unui răspuns hiperinflamator dezadaptativ în timpul unei infecții subletale cu virusul gripal A, caracterizată prin producția excesivă de interferon-b, prin suprimarea activării IRF3/NF-kB și inhibarea semnalizării aberante intracelulare de Ca2+ la macrofage.35 În plus, la o doză letală de gripă A infecția cu virus, s-a demonstrat că MG53 previne mortalitatea și afectarea plămânilor, nu prin afectarea directă a titrurilor virale în sine, ci prin atenuarea furtunii de citokine (interferon-b, interleukina-6 și interleukina-1b) prin reglare negativă a inflamazomului NLRP3 și prevenirea piroptozei pulmonare.36 În plus, tratamentul cronic în doze mari de MG53 exogen a fost legat de suprimarea NF-kB. – inflamația mediată în inima îmbătrânită.37 Aceste studii sugerează că MG53 poate modula semnalizarea aberantă NF-kB în timpul inflamației, dar nu a fost studiat dacă aceasta are loc în contextul inflamației rinichilor.

Am postulat că MG53 reglează inflamația rinichilor prin modularea activității transcripționale a NF-kB și, astfel, poate atenua fibroza renală care apare ca o consecință a inflamației cronice. Acest studiu a fost întreprins pentru a aborda această ipoteză.

cistanche este eficientă în tratarea bolilor de rinichi

METODE

Studii pe animale

Toate experimentele cu animale au aderat la Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și au urmat protocoale aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea de Stat din Ohio. Tip sălbatic potrivit în funcție de vârstă (WT) sau mg53^-/-tulpinii non-littermates ai tulpinii 129S1/SvImJ au fost utilizate22 pentru a stabili rolul MG53 în modularea fibrozei renale dependente de vârstă și obstrucția ureterală unilaterală (UUO). Șoarecii C57B6/J (9-10 săptămâni) au fost achiziționați de la Jackson Labs.

Pentru studiile de afectare a rinichilor, șoarecii (9-12 săptămâni) au fost supuși la UUO pentru a induce fibroza renală. Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran (1,5 la sută -2,0 la sută) pentru a asigura un plan profund de anestezie. Procedura UUO a fost efectuată prin ligatura ureterului stâng cu 5-0 mătase chirurgicală de două ori conform protocoalelor publicate.38 Șoarecii simulați au avut doar o incizie a pielii abdominale. Pentru a evalua efectul rhMG53 asupra leziunii obstructive renale, un grup de șoareci UUO a primit rhMG53 (2 mg/kg) prin injectare în vena cozii începând imediat după intervenția chirurgicală UUO (ziua 0) și apoi zilnic timp de 7 zile, cu 2 doze suplimentare în zilele 9 și 11. Un grup de control de șoareci UUO a primit injecții cu ser fiziologic conform aceluiași program. Șoarecii au fost uciși în ziua 12 după intervenția chirurgicală UUO, rinichii au fost perfuzați in situ cu soluție salină tamponată cu fosfat și au fost colectate probe de țesut din rinichiul UUO și rinichiul contralateral pentru histologie și analiză Western blot.

În studii separate, WT și mg53^-/-șoarecii au suferit o intervenție chirurgicală UUO sau simulată și au fost uciși în ziua 7 după operație. MG53 a fost administrat șoarecilor folosind o abordare de terapie pe bază de celule.39 Macrofagele RAW 264,7 au fost infectate cu particule virale Ad tPA-MG53-cireșe dependente de doxiciclină (DOX) timp de 24 de ore. Celulele infectate (la o concentrație de {{10}} /10{0 ml de soluție salină per șoarece) au fost injectate în vena cozii la șoareci imediat după intervenție chirurgicală (injectarea în ziua 0). Șoarecii au primit 4 injecții cu celule RAW transduse Ad-tPA-MG53 în zilele 0, 1, 3 și 6. Imediat după injectarea cu celule în ziua 0, șoarecii au fost randomizați într-un grup care a primit și un grup care nu a primit DOX (2 mg/ml în soluție de zaharoză 5 procente) în apa lor de băut timp de 7 zile și apoi uciși. Au fost colectate probe de țesut din rinichiul UUO și rinichiul contralateral pentru analize histologice, ARN și proteine.

Analize statistice Datele sunt exprimate ca medii -SD. O comparație în cadrul grupurilor a fost efectuată utilizând testul t Student la compararea a 2 cercetări de bază experimentale H Li și colab.: MG53 modulează NF-kB în fibroza renală 2 Kidney International (2021) -, -–-grupuri și 1-modalitatea de analiză a varianței pentru mai mult de 2 grupuri (Graphpad Prism 8.2; GraphPad), urmată fie de testul de comparație multiplă Bonferroni, fie Holm-Sidak ad-hoc. O valoare de P < 0,05="" a="" fost="" considerată="" semnificativă="">

Metode suplimentare Metode complete, inclusiv evaluarea histologică, măsurători ale creatininei serice, construcții plasmide, culturi celulare și izolarea celulelor epiteliale tubulare primare, prepararea adenovirusului și infecția celulară, testul de translocare nucleară NF kB p65, imunohistochimie și imagini confocale, testul reporter luciferază NF-kB, lucicitokină Testul imunosorbent legat de enzime, fracționarea țesuturilor, imunoblotarea, coimunoprecipitarea, reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (Tabelul suplimentar S1) și producția de rhMG53 sunt în Metodele suplimentare.

extract de cistanche tubulosa: tratarea bolilor de rinichi

REZULTATE

Șoarecii cu ablația MG53 dezvoltă fibroză renală dependentă de vârstă

Am comparat efectul îmbătrânirii asupra funcției renale și a fibrozei în mg53^-/-și șoareci WT. Am confirmat observația noastră anterioară că, deși nivelurile de creatinine serice ale șoarecilor tineri (2 luni) cu și fără MG53 nu au fost semnificativ diferite, mai în vârstă (16-20 luni) mg53-/-Soarecii au prezentat o creatinina serica semnificativ mai mare decat martorii WT potriviti varstei (Figura 1a). Pe baza colorației tricrome, am constatat că mg53-/-șoarecii au avut mai multă fibroză renală în comparație cu șoarecii WT, începând cu vârsta de 5 luni și continuând până la vârsta de 20 de luni (Figura 1b și c). Colorația imunohistochimică a fost utilizată pentru a evalua impactul ablației MG53 asupra infiltrației leucocitelor, monocitelor și macrofagelor în rinichii de șoarece de 2-lună și 5-lună (Figura 1d și e). Rinichii de la șoareci tineri WT și mg53-/- au avut niveluri similare de leucocite intrarenale, dar s-au găsit semnificativ mai multe celule inflamatorii în mg53 / rinichi decât rinichii WT la șoarecii de 5-lună.

Mai mult decât atât, imunohistochimia pentru actina musculară netedă și fibronectina, 2 proteine ​​ale matricei extracelulare întâlnite în mod obișnuit în zonele cu fibroză renală, a arătat o colorare îmbunătățită (de 3- până la 8-ori) în glomeruli și tubulointerstitiul rinichilor din { {4}}șoarecii de o lună mg53-/- în comparație cu șoarecii WT de 10-lună (Figura suplimentară S1).

UUO induce inflamație agravată a rinichilor și fibroză la șoareci mg53-/- Nivelurile de rinichi MG53 detectate prin imunoblot au crescut semnificativ la 7 zile după UUO (Figura 2a). Rinichii mg53- /- UUO au prezentat fibroză exagerată, cu o zonă suplimentară colorată cu tricrom cu 30% față de rinichii WT UUO (Figura 2b).

MG53 modulează activarea NF-kB și localizarea nucleară p65

Activitatea NF-kB (p65) a fost evaluată în modelul UUO. Numărul total de p65 (t-p65) a crescut semnificativ în rinichii UUO de la WT și mg53 / șoareci, dar activarea NF-kB, evaluată ca fosforilarea p65, a fost mai mare (16-ori) în mg53 / UUO rinichi decât rinichiul WT UUO (2-ori) în comparație cu animalele operate de simulare (Figura 3a). Am analizat nivelurile relative de ARN ale factorului de creștere transformant b1 (TGF-b1), inhibitorului activatorului de plasminogen-1 (PAI{-1) și colagenului de tip I alfa 1 (Col1a1) în rinichiul obstrucționat.40 au detectat niveluri scăzute de expresie a genelor la animale simulate și inducție similară (TGF-b1, w10 ori; PAI-1, w40 ori; Col1a1, w40 ori) în rinichiul UUO de la WT și mg53 / (Figura 3b). Pentru a examina distribuția spațială a MG53 în cortexul renal în condiții normale, au fost analizate fracții de țesut renal. Am obținut în mod regulat de 10-ori mai multă proteină totală din citosol decât proteina nucleară totală extrasă. Nivelurile de t-p65 au fost comparabile în fracția citosolică între șoareci WT și mg53-/-, dar au fost mai mari în fracția nucleară de șoareci mg{53-/- (Figura 3c). MG53 a fost detectat în fracția de citosol (cu tubulină ca marker de citosol). În mod neașteptat, o cantitate semnificativă de MG53 a fost detectată la fracția nucleară (cu histona H3 ca marker al fracțiunii nucleare).

Pentru a confirma această constatare, am examinat și localizarea MG53 în fracțiile musculare scheletice (Figura suplimentară S2). Am reprodus studiile noastre anterioare în care MG53 s-a localizat în citosol și membrana sarcolemală (adenozin trifosfataza sodiu-potasiu ca marker al fracțiunii membranei)22,23,25, dar a detectat și MG53 nuclear îmbogățit din mușchiul scheletic.

MG53 interacționează cu p65 pentru a controla activitatea transcripțională indusă de factorul de necroză tumorală a Pentru a confirma rezultatele noastre de fracționare a țesuturilor, am efectuat următoarele studii imunohistochimice. În celulele epiteliale tubulare proximale WT cultivate, p65 a fost găsit în principal în citosol, dar localizat în nuclee în absența MG53 (Figura 4a). Când aceste celule au fost tratate cu LPS (5 mg) timp de 8 ore, secreția de citokine proinflamatorii a fost semnificativ mai mare în mg53 / celule decât celulele WT (Figura 4b).

Deoarece aceste date sugerează că MG53 poate interacționa cu p65 pentru a regla expresia citokinei inflamatorii, o interacțiune directă între p65 și MG53 a fost evaluată prin teste de coimunoprecipitare folosind celule HEK293 cotransfectate cu Flag-p65 și HA-MG53. Am demonstrat o interacțiune slabă (Figura 4c). Cotransfecția plasmidelor GFP-p65 și RFP-MG53 și analiza confocală au confirmat colocalizarea p65 și MG53 (Figura 4d). Apoi am cuantificat dacă MG53 afectează activitatea transcripțională NF-kB (p65) după stimularea TNF prin măsurarea activității luciferazei dintr-o linie celulară reporter transcripțional NF-kB/293-GFP-Luc stabilă care a fost transfectată tranzitoriu cu oricare vector pHM6 sau HA-MG53. Celulele reporter conțin un reporter de luciferază de licurici cu expresie transdusă de lentivirus condus de un promotor minim de citomegalovirus în combinație cu 4 copii ale elementelor de răspuns transcripțional consens NF-kB (situs kB) în amonte. În absența TNF-a, a fost detectată o activitate intrinsecă a luciferazei foarte scăzută în celulele reporter care exprimă proteinele MG53. MG53 a suprimat activitatea transcripțională NF-kB (p65) determinată de TNF-a cu aproximativ 40% (Figura 4e).

Supraexprimarea MG53 a prevenit translocarea nucleară NF-kB p65 la tratamentul cu TNF-a. NF-kB p65 a fost translocat în nucleu după tratamentul cu TNF-a în epiteliul tubului proximal al rinichiului.41 Pentru a explora dacă tratamentul cu MG53 ar putea atenua translocarea nucleară NF-kB p65. la stimularea TNF-a, am supraexprimat MG53 în celulele HKC-8 fie prin transducția virală Ad-tPA-MG53 dependentă de DOX, fie prin tratament cu MG53 uman recombinant (rhMG53). Utilizând un anticorp monoclonal specific MG53-, după inducția dependentă de DOX, MG53 a fost detectat prin imunoblot. MG53 a fost prezent la un nivel foarte ridicat în celulele HKC-8 transduse Ad-tPA-MG53,

echivalent cu 1 ng rhMG53/mg lizat celular. În schimb, HKC-8 a preluat și a exprimat o cantitate mult mai mică de rhMG53 (Figura 5a). Absorbția rhMG53 marcată cu fluorescent FL de către HKC -8 a fost confirmată prin microscopie confocală (Figura suplimentară S3). După tratamentul cu TNF-a, timpul până la activarea maximă a p65 a fost de 15 până la 30 de minute (Figura 5b). În condiții bazale, NF-kB p65 a locuit în principal în citosol, iar supraexprimarea MG53 nu a schimbat acest lucru (Figura 5c și d). Cu toate acestea, după stimularea TNF-a, p65 s-a translocat în nucleele celulelor HKC-8 care nu supraexprimă MG53. În comparație, translocarea nucleară a p65 a scăzut cu 33% (celule cărora li s-a administrat rhMG53) la 50% (celule transduse cărora li s-a administrat DOX) în celulele care supraexprimă MG53 (Figura 5c și d).

Transferul adoptiv al celulelor RAW proiectate în modelul UUOmouse a fost efectuat cu celule 1 - 106 administrate prin injectare în vena cozii imediat după intervenția chirurgicală UUO. Șoarecii au fost împărțiți aleatoriu într-un grup care a primit apă de băut normală (-DOX) și un grup care a primit DOX (2 mg/ml) în apă de băut. Șoarecii UUO au primit RAW la fiecare altă zi pentru un total de 4 injecții. Rinichii au fost recoltați la 7 zile după operație.

Șoarecii cărora li s-a administrat RAW proiectat urmat de inducția DOX au prezentat o fibroză renală semnificativ redusă (cu 30 la sută) în comparație cu cei care nu au primit celule sau cu cei infuzați cu celule RAW modificate, dar fără inducție Dox (66 la sută zonă fibrotică; Figura 6a și b).

Doar o mică populație RAW/Ad-tPA-MG53 a supraviețuit supravegherii sistemului reticuloendotelial până la sfârșitul experimentelor. Colorația imunohistochimică a confirmat că expresia MG53 mediată de RAW indusă de tratamentul cu DOX în rinichi (Figura 6c). Interesant, rinichii UUO de la șoareci infuzați cu RAW și MG53 indus de DOX au prezentat un raport p-65/t-p65 mai mic (cu aproximativ 40 la sută) decât cei care fie nu au primit RAW, fie cei care au primit RAW fără DOX (Figura 6d și e). Nivelul redus de p-p65 a fost confirmat cu colorarea imunohistochimică p-p65 (S536) a rinichilor UUO (Figura 6f). Credem că MG53 circulant eliberat de Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX și absorbția de către celulele tubulare proximale ale rinichilor ar putea participa la reducerea p-p65 (S536) și la scăderea inflamației rinichilor UUO. În comparație cu rinichii numai UUO, expresia TGF-b1, PAI- 1 și Col1a1 a fost crescută semnificativ în rinichii UUO de la șoareci perfuzați cu RAW fără DOX (fără inducție MG53). Creșterea acestor gene profibrotice ar putea fi atribuită inducerii unei reacții puternice de alogrefă de la celulele perfuzate la șoarecii imunocompetenți. Cu toate acestea, rinichii UUO de la șoarecii cărora li s-a administrat RAW și li s-a administrat DOX (inducție MG53) au exprimat PAI-1 semnificativ mai scăzut (reducere cu 60% -72%) și niveluri relativ mai mici de TGF-b1 și Col1a1 decât șoarecii fără tratament cu DOX (Figura 6g).

Administrarea sistemică a rhMG53 atenuează activarea NF-kB și dezvoltarea fibrozei la șoarecii supuși la UUO

Am testat dacă rhMG53 a afișat un efect antifibrotic similar cu terapia celulară RAW proiectată descrisă mai devreme. Datele noastre farmacocinetice anterioare au indicat timpul scurt de înjumătățire circulant (aproximativ 90 de minute la rozătoare) al rhMG53.42. Șoarecii au tolerat administrarea cronică de 2 până la 6 mg/kg.

rhMG5326,37 bine, așa că a fost utilizată strategia de administrare prezentată în Figura 7a. Șoarecilor UUO li s-a administrat aleatoriu fie vehicul (soluție salină) fie rhMG53 (2 mg/kg) zilnic în primele 7 zile după operație și apoi o dată la două zile până când au fost uciși în ziua 12. Rinichii simulați și contralaterali au prezentat aproximativ echivalentul t-p65. și nivelurile de expresie a fibronectinei, cu nivelurile p-p65 ușor crescute în rinichii contralaterali în comparație cu rinichii simulați. După UUO, rinichi t-p65 a crescut. Comparativ cu animalele tratate cu soluție salină, raportul p-65/t-p65 în rinichii UUO ai animalelor tratate cu rhMG{53-a fost redus cu aproximativ 37%, în timp ce IkBa a crescut cu aproximativ 27% (Figura 7b și c). În plus, fibronectina a scăzut cu aproximativ 33 la sută (Figura 7b și c). Imunohistochimia a confirmat că rhMG53 a fost prezent în rinichii UUO după tratament (Figura 7d). Fibroza totală a fost redusă în rinichii UUO tratați cu rhMG53-(Figura 7e). Cu toate acestea, expresia ARN a TGF-b1, PAI-1 și Col1a1 a fost similară la șoarecii tratați fie cu ser fiziologic, fie cu rhMG53 (Figura 7f).

cistanche este eficientă în tratarea disfuncției renale

DISCUŢIE

MG53 este o proteină TRIM îmbogățită cu mușchi, identificată inițial ca o componentă proeminentă a mașinilor de reparare a membranei plasmatice.22,26,42,43 Cu toate acestea, acțiunile MG53 nu se limitează la mușchii scheletici, iar MG53 poate fi eliberat în circulație ca un myokine.32 Am arătat anterior că MG53 poate controla inflamația în timpul leziunilor tisulare în organe îndepărtate.27,29,33,35–37. Prezenta investigație extinde domeniul de aplicare a protecției organelor mediate de MG53-la rinichi. Concluzionăm că MG53 poate atenua inflamația intrarenală și fibroza renală prin blocarea activării induse de citokine a factorului de transcripție proinflamator și profibrotic NF-kB. Această concluzie se bazează pe următoarele observații: (i) ștergerea genetică a MG53 la șoarecii normali.

a dus la o scădere a funcției renale pe măsură ce șoarecii îmbătrânesc, care a fost însoțită de o creștere a fibrozei renale și de infiltrarea rinichilor de către leucocite și macrofage; (ii) într-un model de leziune renală UUO murină, rinichii obstrucționați ai șoarecilor cu deficit de MG53-au prezentat mai multă fibroză și inflamație decât șoarecii cu MG53-săi; (iii) producția de TNF-a și interleukină-6de către celulele epiteliale tubulare proximale tratate cu LPS au fost atenuate în prezența MG53; (iv) tratamentul cu sau supraexprimarea MG53 într-o linie de celule epiteliale tubulare proximale a diminuat activarea NF-kB indusă de TNFa prin blocarea translocației nucleare a componentei p65 a kB (s-a descoperit că MG53 se leagă direct la p65, deși slab); și (v) fosforilarea p65, o etapă necesară în activarea NF-kB, a fost scăzută în rinichii obstrucționați ai șoarecilor UUO tratați cu MG53 recombinant indus să supraexprima MG53 în macrofage. În plus, inhibitorul activării NF-kB, IkBa, a fost crescut în rinichii obstrucționați ai șoarecilor UUO injectați cu recombinant MG53.

Deleția genetică a MG53 la șoarecii normali a fost permisivă pentru efectele adverse ale îmbătrânirii asupra rinichilor. Acest lucru sugerează că prezența MG53 endogen oferă un nivel de bază de protecție în timpul îmbătrânirii. În mod similar, pierderea MG53 endogenă a agravat AKI din cauza obstrucției. Rinichiul UUO a acumulat MG53, reflectând posibil activitatea miokinelor de la distanță din mușchiul scheletic. Rămâne neclar modul în care mușchiul MG53 poate fi recrutat la rinichi în timpul leziunii; cu toate acestea, un rinichi deteriorat dezvoltă adesea hipoxie și suferă stres oxidativ,^44,45semnale care ar putea servi la recrutarea MG53. Dacă da, această axă „mușchi-rinichi-celulă imună” ar putea fi folosită pentru a atenua afectarea rinichilor.46 Alternativ, celulele renale exprimă niveluri scăzute de MG53 la momentul inițial,²⁶și, în timpul leziunilor acute sau cronice, producția de MG53 ar putea fi reglată.

NF-kB este un motor transcripțional proeminent al inflamației și fibrozei în leziunile renale și îmbătrânirea.^14,17,47,48Am fost solicitați să investigăm dacă efectele MG53 ar putea fi mediate prin NF-kB, deoarece prezența MG53 în compartimentul nuclear al omogenaților renali a sugerat potențialul de interferență transcripțională. Localizarea nucleară a MG53 nu este fără precedent. Într-un model transgenic care supraexprima MG53 miocardic, MG53 nuclear a reglat expresia receptorului alfa activat de proliferatorul peroxizomului la nivel transcripțional și a afectat metabolismul lipidelor cardiace.49 Mai mult, recent am demonstrat că rhMG53 a suprimat activarea NF-kB pentru a atenua insuficiența cardiacă legată de vârstă. prin reducerea citokinelor proinflamatorii, a apoptozei și a stresului oxidativ în cardiomiocitele îmbătrânite.³⁷

Mecanismul molecular al modului în care MG53 modulează mobilizarea nucleară/citoplasmatică p65 rămâne neclar. MG53 nu conține niciun semnal de localizare nucleară, dar conține 3 semnale presupuse de export nuclear bogat în leucină N-terminal, un motiv recunoscut de exportina proteinelor de export nucleare.⁵⁰Interacțiunea directă dintre MG53 și p65 a fost destul de slabă ca singurul sau principal efect perturbator al MG53 asupra activării NF-kB. Deși MG53 pare să afecteze deplasarea dinamică nucleocitoplasmatică a componentelor critice NF-kB, mecanismele exacte rămân de determinat.

Rezultatul critic al renoprotecției mediată de MG53-pare a fi scăderea remodelării fibrotice prin atenuarea inflamației mediate de NF-kB. Fibroza renală este un proces complex care implică depunerea patologică a diferitelor proteine ​​ECM.51 MG53 părea să aibă efecte clare asupra fibronectinei proteinei ECM. Fibronectina a crescut la rinichii UUO cu deficit de MG53 și a scăzut la șoarecii UUO tratați cu MG53. Expresia altor proteine ​​ECM în prezența și absența MG53 este mai dificil de înțeles. Am demonstrat anterior că rhMG53 reglează negativ semnalizarea TGF-b1/Smad și suprimă sinteza proteinelor ECM într-un studiu in vitro.31 Transcriptele in vivo, TGF b1, PAI-1 și Col1a1 nu au crescut în rinichii UUO din mg53 / animale deficitare. Aceste transcrieri au scăzut la animalele UUO induse să supraexprima MG53 prin administrarea de șoarece indus viral.

macrofage, dar când s-a administrat MG53 recombinant, nu s-a observat niciun efect. Acesta poate fi pur și simplu un caz de dozare suficientă, deoarece nivelurile intrarenale de MG53 atinse au fost mult mai mari la animale având în vedere vectorul macrofag, spre deosebire de MG53 recombinant. În plus, nivelurile de proteine ​​nu au fost măsurate, iar evenimentele post-transcripționale ar putea modifica ECM în UUO. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru a elucida rolul emergent al MG53 în modularea proteinelor specifice ECM. În concluzie, acest studiu a demonstrat că o miokină poate ajuta la reglarea inflamației inițiale într-un organ îndepărtat precum rinichiul și, în cazul leziunilor renale, poate ajuta la atenuarea și controlul inflamației. Figura 8 prezintă un model de lucru al rolului MG53 în renoprotecție. În timpul stimulării modelelor moleculare asociate leziunii (DAMP, cum ar fi TNF-a) și modelelor moleculare asociate patogenului (PAMP, cum ar fi LPS) și stresului ischemic, semnalozomul NF-kB este activat în rinichi. MG53 protejează rinichiul prin inhibarea fosforilării și activării semnalizării NF-kB, stabilizând IkBa și reducând mobilizarea nucleară p65, blocând activarea programelor proinflamatorii. Deși MG53 endogen poate media aceste efecte, sugerăm că se poate oferi o protecție mai robustă folosind MG53 terapeutic, ceea ce este fezabil pe baza capacității MG53 exogen de a reduce leziunile în UUO. Investigații suplimentare sunt justificate pentru a înțelege modul în care această miokină poate fi exploatată clinic.

beneficiul cistanchei: protejează ficatul și anti-fibroză

DEZVĂLUIRE

JM are o participație în TRIM-edicine, Inc., care dezvoltă rhMG53 pentru tratamentul bolilor umane. Patentele privind utilizarea MG53 sunt deținute de Universitatea Rutgers și Universitatea de Stat din Ohio. Toți ceilalți autori au declarat că nu există interese concurente.

MULȚUMIRI

Această activitate a fost susținută de National Institutes of Health (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR și P-HL) și NIH R01-AG062896 (P-HL și BHR). Acest proiect a fost, de asemenea, susținut parțial de un fond intramural Lockwood de la Universitatea de Stat din Ohio (P-HL) și un premiu de la Centrul Național pentru Avansarea Științelor Translaționale (NCATS; P-HL, numărul de premiu UL1TR002733). Conținutul este responsabilitatea exclusivă a autorilor și nu reprezintă neapărat opiniile oficiale ale NCATS sau NIH.

CONTRIBUȚII AUTORULUI,

PD, P-HL, JM și BHR au conceput și/sau proiectat studiile; HL, PD, P-HL, ZL și XZ au condus experimentele, au obținut date și au efectuat analiza datelor; PD, P-HL și BHR au interpretat rezultatele; și P-HL și BHR au redactat, revizuit și aprobat manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat versiunea finală.

MATERIAL SUPLIMENTAR

Fișier suplimentar (PDF) Metode suplimentare.

Tabelul S1.Secvențe de primer. Figura S1. mg53-/- șoarecii prezintă o depunere îmbunătățită a proteinei ECM. Țesuturile de rinichi de tip sălbatic (WT) și mg53-/- corelate în funcție de vârstă (10 luni) au fost colorate cu 40 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; albastru, panouri din stânga), a- actină musculară netedă (SMA; verde, panouri secunde), fibronectină (panouri roșii, treilea) și îmbinate (panourile din dreapta). Bară ¼ 25 mm. Cuantificarea zonei de fibroză renală (n ¼ 3 per grup). Datele sunt prezentate ca mijloc -SD. Testul t al elevului. ***P <>

Figura S2.Distribuția mușchilor scheletici MG53 între nucleu și citoplasmă. Derivați din mușchiul scheletic de la șoareci ormg53-/- de tip sălbatic (WT) au fost fracționați și imunoblotați cu un anticorp anti-MG53 personalizat (3 mg lizate) și markeri de compartiment celular (20 mg lizate). Adenozin trifosfatazele de sodiu-potasiu sunt utilizate ca marker al membranei celulare, histona H3 ca marker nuclear și tubulina ca marker al citosolului.

Figura S3.Celulele tubulare proximale ale rinichilor HKC-8 preiau în mod specific rhMG53 marcat cu AlexaFluor 647. rhMG53 (Trimedicine) și albumina serică bovină (BSA; ThermoFisher Scientific) au fost etichetate cu kituri Alexa Fluor(AF) Antibody Labeling (Life Technologies) conform protocolului producătorului. Celulele HKC-8 au fost cultivate pe un vas cu fund de sticlă Delta TPG (Bioptechs Inc.) în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) cu 10% ser fetal bovin (FBS) în prezența proteinelor marcate, BSA-AF647 (stânga). ) și rhMG53-AF647 (dreapta), timp de 24 de ore. Imaginile Z-stack au fost luate de la un microscop confocal LSM780 (Zeiss). Imaginile arată celule în partea de jos a vaselor. Bară ¼ 25 mm.

Figura S4.Proiectarea celulelor RAW pentru a media secreția inductibilă de MG53. (A) Celulele RAW au fost infectate cu Ad-tPA-MG53 timp de 24 de ore și tratate fără (doxiciclină [Dox]) sau cu Dox (þDox, 1 mg/ml) timp de încă 24 de ore pentru a induce expresia tPA-MG53. Imaginile confocale au arătat inducerea exprimării MG53 (anticorp anti-MG53 personalizat, roșu, panouri inferioare) din celulele RAW asemănătoare macrofagelor (colorare F4/80, verde, panouri superioare). Bare ¼ 25 mm. (B, C) Analiza Western blot a lizatelor celulare (în cantitate de 0.6, 3 și 6 mg) pentru expresia indusă a tPA-MG53 și MG53 din celulele RAW infectate (B) și cultura corespunzătoare concentrate de mediu (în volume de 2, 5 și 10ml) (C). Au fost încărcate ca standarde diferite cantități de rhMG53 (în cantitate de 0.2, 1, 0,05 și 0,025 ng). Mw, markeri de greutate moleculară.