Rolul central al transformării factorului de creștere (TGF-) în dezvoltarea fibrozei renale
Mar 26, 2022
Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
PARTEA Ⅰ: Rolul fibroblastului renal primar uman în dispozitivele care imita fibroza mediată de TGF- 1-
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee și colab.
1. Introducere
Fibroza renala, calea comună finală a nenumăratelor boli renale progresive, este caracterizată printr-o creștere a producției de proteine din matricea extracelulară (ECM), o scădere a degradării matricei, disfuncția interacțiunii celulă-matrice, transformarea celulelor rezidente și infiltrarea celulelor inflamatorii.factor de creștere transformator-(TGF-) este o peptidă dimerică multifuncțională care reglează procesele biologice, cum ar fi proliferarea celulară, diferențierea și răspunsurile imunologice [1]. Dintre numeroșii factori fibrogeni, TGF- (factor de creștere transformator-) joacă un rol central și are efect antiinflamator. TGF- 1(factor de creștere transformator-)-șoarecii cu deficit mor de inflamație masivă. Șoareci transgenici care supraexprimă TGF- 1(factor de creștere transformator-)sunt practic protejate de dezvoltarea patologiei fibrotice renale, în principal prin activitatea sa antiinflamatoare [2]. Proprietățile profibrotice și antiinflamatorii ale TGF-(factor de creștere transformator-)sunt săbii cu două tăișuri în ceea ce privește aplicarea terapeutică a TGF-(factor de creștere transformator-)inhibitie. S-au făcut eforturi remarcabile pentru a obstrucționa TGF-(factor de creștere transformator-)acţiune pentru a împiedica progresulrenalfibroză[3]. Deși multe abordări au fost utilizate pentru a combaterenalfibroză, un model experimental pentru a evalua medicamentele disponibile în prezent nu este ideal.
cistanche plant preventboli renale
În general, studiile pe animale joacă un rol esențial în testele preclinice în prezicerea farmacocineticii și eficacității medicamentelor. Cu toate acestea, există diferite diferențe între animale și oameni, ceea ce ne determină să punem la îndoială acuratețea testelor de eficacitate și siguranță pe bază de animale 4. Rapoartele anterioare au depins de studiile preclinice pe animale în timpul dezvoltării medicamentelor pentru a evalua nefrotoxicitatea și siguranța medicamentelor. Funcția renală a animalelor este de peste două ori mai mare decât cea a rinichilor umani. Prin urmare, medicamentele sunt metabolizate mai repede la animale decât la oameni, ceea ce face dificilă elucidarea rezultatelor testelor de toxicitate a medicamentelor folosind studii pe animale. În plus, rezultatele experimentelor pe animale nu pot fi utilizate pentru a prezice răspunsurile la medicamente la oameni, deoarece animalele au funcții fiziologice diferite. Pe bază de animalefibroza renalamodelele au dificultăți în reproducerea umanăfibroza renala; prin urmare, cercetările sunt în desfășurare pentru a depăși obstacolele actuale și pentru a optimiza platformele de descoperire a medicamentelor [5].
Tehnologia organ-on-a-chip (OoC) a apărut ca un concept nou pentru a rezolva aceste probleme. Această platformă a fost concepută ținând cont de deficiențele actuale și s-a arătat foarte promițătoare în domeniul nefrologiei [6]. În plus, modelele OoC dețin un potențial mare ca înlocuitor pentru modelele animale experimentale, oferă o soluție pentru diferențele dintre specii și pot ajuta la stoparea cruzimii față de animale și a dezbaterilor etice [7]. Există puține modele in vitro care utilizează simultan fibroblaste renale primare cu celule endoteliale și epiteliale, care sunt celule importante înrinichifibroză. Rolul fiecărei celule înfibrozăeste studiat separat; cu toate acestea, există cunoștințe limitate cu privire la interacțiunea celulelor.
În studiul de față am dezvoltatfibroză-dispozitive de imitare folosind fibroblaste umane primare. Am confirmat că TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratamentul are efecte variate asuprafibroza renalamodel. În special, fibroblastele joacă un rol esențial ca celule efectoare, promovează formarea unui micromediu pro-fibrotic și secretă factori de creștere și citokine. Prin urmare, pe baza acestei noi metode, fibroblastele pot oferi un sistem de model celular ideal pentru studiul bolii renale. Am evaluat dacă fibroblastele derivate din boala renală fibrotică afectează integritatea celulelor cultivate în trei dimensiuni (3D). În cele din urmă, prezentăm un studiu de dovadă a principiului care demonstrează potențialul umanfibroza renala-imitarea dispozitivelor ca model pentru prezicerea răspunsului la omfibroza renala.
efectele cistanche: tratați infecția rinichilor
2. Rezultate
2.1.Identificarea actinei (a-SMA) și a keratinei-8(KRT-8) al mușchilor netezi alfa de către TGF- 1(factor de creștere transformator-)în celule HK-2
În faza incipientă, am examinat markerii cunoscuți aifibrozăși citoscheletul în culturi bidimensionale (2D). Au fost efectuate teste de colorare imunofluorescente pentru a estima expresia -SMA a fibrozei și a markerului de tranziție epitelial la mezenchimal tubular (EMT) și a nivelurilor KRT8 ca marker de citoschelet. Colorarea prin imunofluorescență a arătat că expresia -SMA a fost inițial slabă și nivelurile de KRT8 au fost ridicate în celulele epiteliale HK-2 monostrat. Nu a existat nicio modificare semnificativă a intensității fluorescenței de către TGF- 1(factor de creștere transformator-)(5 ng/mL) sau tratamentul cu inhibitor specific al celulelor epiteliale HK-2 timp de 24 de ore (Figura 1).
Figura 1. Imunofluorescența arată că expresia alfa-SMA și a keratinei-8(KRT8) a fost menținută prin tratamentul TGF- 1(factor de creștere transformator-)sau inhibitorul din celulele HK-2.(A) Expresia alfa-SMA și (B)CCK-8 nu a avut niciun efect asupra celulelor HK-2de către TGF- 1(factor de creștere transformator-)(5ng/mL) sau inhibitorul. Celulele au fost inițial placate la o densitate de 1×10 grade per godeu (ac) martor netratat și （df）stimulate cu 5ng/mL TGF- 1(factor de creștere transformator-) sau (gi) inhibitor 10 μM (SB431542) timp de 24 de ore și fixat cu paraformaldehidă 4%. Celulele au fost apoi colorate cu anti- -SMA și anti-citokeratină-8 timp de 20 de minute. S-a efectuat co-colorarea cu colorant Hoechst H33342 pentru a identifica nucleele celulare. Barele de scară din micrografii indică 200 um.
Pudra de cistanche îmbunătățește funcția rinichilor
2.2. Expresia KRT8 a scăzut cu TGF- 1(factor de creștere transformator-)pe un cip
Apoi, am evaluat nivelurile de expresie ale -SMA și KRT8 în HK-2 cultivat în 3D și lungimea totală a celulelor endoteliale ale venei ombilicale umane GFP (HUVEC) tratate cu TGF- 1(factor de creștere transformator-)și un inhibitor specific. Pentru a realiza acest lucru, am stabilit mai întâi un model de cip de țesut care cuprinde două tipuri de celule, celule epiteliale HK-2 și GFP-HUVEC. După confirmarea construcției, am expus cipul de țesut cu TGF- 1(factor de creștere transformator-)(5 ng/mL) sau un inhibitor specific (10 um SB431542) timp de 24 de ore.
După cum se arată în Figura 2A-C, expresia -SMA nu a fost modificată în mod specific de TGF- 1(factor de creștere transformator-)sau tratamentul cu inhibitor specific. Cu toate acestea, expresia KRT8 a fost redusă în cip co-cultivat de tip cu două celule. Mai mult, adăugarea unui inhibitor de TGF-ß1 a crescut expresia KRT8.
Am examinat formarea unei rețele tubulare de tip capilar 3D de către TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratament în HUVEC, deoarece celulele endoteliale pot forma spontan o rețea tubulară 3D asemănătoare capilarelor. În conformitate cu condițiile noastre culturale, formarea liniilor groase a fost semnificativ scăzută. Cu toate acestea, liniile subțiri asemănătoare capilare au fost crescute în TGF- 1(factor de creștere transformator-)GFP-HUVEC tratate. În cazul TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratament cu inhibitor pe cip cultivat 3D, lungimea totală a liniilor groase și groase a arătat o tendință inversă la TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratament. S-a observat o creștere a lungimii liniei groase în comparație cu grupul martor netratat. Un model similar a fost observat în diametrul liniei groase în GFP-HUVEC după TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratament și tratament cu inhibitori. Diametrul GFP-HUVEC a fost suprimat de TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratament, dar a crescut indiferent de grosimea liniei de către inhibitor în comparație atât cu martorii, cât și cu TGF- 1(factor de creștere transformator-). Lungimea totală și diametrul liniei groase au crescut dramatic prin tratamentul cu inhibitor de TGF- 1 comparativ cu controlul netratat și tratamentul cu TGF- 1. În special, rezultatele obținute au indicat o densitate crescută a vaselor mici în TGF-(factor de creștere transformator-)-grupul tratat comparativ cu omologii lor netratati. În schimb, densitatea vaselor groase din TGF- 1(factor de creștere transformator-)grupul de tratament a fost mai mic decât cel din grupul de control netratat (Figura 2D, E).
Figura 2. Expresia KRT8 în HK-2 și lungimea și diametrul total al HUVEC-urilor.(A) Imunofluorescența arată că expresia -SMA a fost menținută și expresia KRT8 a fost redusă dramatic prin tratamentul TGF- 1(factor de creștere transformator-)în HK-2. Celulele au fost placate și stimulate cu 5 ng/mL TGF- 1(factor de creștere transformator-)sau inhibitor de 10 μm （SB 431542） timp de 24 de ore și fixat cu paraformaldehidă 4%. Celulele au fost colorate cu anti- -SMA și anti-citokeratină-8 timp de 20 de minute. S-a efectuat co-colorarea cu colorant Hoechst H33342 pentru a identifica nucleele celulare. Expresia -SMA(ac) nu a avut nicio modificare, dar KRT8(df) în celulele HK-2 și GFP în expresia HUVEC (gi) au fost modificate semnificativ de TGF- 1(factor de creștere transformator-)(5 ng/mL) și inhibitorul (B, C). În lungimea totală a HUVEC-urilor, vasul subțire a fost crescut, dar vasul gros a fost scăzut de TGF- 1(factor de creștere transformator-). Diametrul a fost crescut atât în vasele subțiri, cât și în cele groase. Aceste rezultate au fost inversate de inhibitorul SB431542 (D, E). Barele de scară din micrografii indică 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
la ce se foloseste cistanche: tratarea bolilor cronice de rinichi
2.3. TGF- 1(factor de creștere transformator-)Afectează trei tipuri de celule ale cipului cu o structură cu mai multe compartimente
Pentru a studia TGF- 1(factor de creștere transformator-)răspunsurile cipului 3D propus, am efectuat imunocolorarea pe fiecare compartiment separat (Figura 3). Fibroblastele renale umane primare au fost utilizate în această analiză. Probele au fost analizate folosind FACS și s-au confirmat a fi pozitive pentru anticorpul marker de fibroblast. După incubarea celor trei tipuri de celule cu TGF- 1(factor de creștere transformator-)timp de 24 de ore, a fost efectuată imunocolorarea pentru a evalua expresia -SMA și KRT8. Expresia a-SMA a fost suprareglată prin tratamentul cu TGF-1 și s-au observat rezultate opuse cu TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratament inhibitor. În schimb, expresia KRT8 a fost reglată în jos de TGF- 1(factor de creștere transformator-)și a arătat un răspuns opus față de TGF-(factor de creștere transformator-)inhibitor (Figura 4A-C).
Figura 3. Imagine de probă cu demonstrația schematică a dispozitivului a fabricării și a programului experimental.(A) Cele două imagini de sus arată aspectul. Imaginea din stânga arată o fotografie generală de sus în jos a dispozitivului. Imaginile de jos arată secțiunea transversală. Vedere schematică care detaliază dimensiunile ghidajelor de lichid. (B) Această figură descrie programele experimentale pentrufibroză-dispozitive de imitare. Procesul de încărcare în patru etape pentru fiecare sondă. Locația fiecărei zone de modelare a hidrogelului, precum și plasarea mediului în secțiune transversală de sus în jos și izometrică. (1) Un total de 1,5 uL de hidrogel 1 este ghidat spontan în canalul central. (2) Canalul central este umplut cu 5 uL de hidrogel. (3) Un total de 10 uL de hidrogel 3 sunt modelate pe podeaua rezervorului. （4）Se distribuie un total de 200μL de mediu. Bară roșie=9 mm.
După cum este descris în Figura 4D-G, lungimea liniei subțiri de tip capilar a fost semnificativ crescută de TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratament în GFP-HUVEC. Cu toate acestea, grosimea liniei groase a fost scăzută în TGF- 1(factor de creștere transformator-)HUVEC tratate. Diametrul a fost redus în medie pentru vasele subțiri și groase din HUVEC. În cazul TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratament cu inhibitor pe cip cultivat 3D, lungimea totală a liniilor groase și groase a arătat o tendință opusă tratamentului TGF- 1. Mai mult, lungimea liniei groase a fost crescută în comparație cu grupul de control netratat.
Figura 4. Alterarea HK-2 și HUVEC cultivate în 3D cu fibroblaste renale primare.Celulele totale au fost placate la o densitate de 5×10 grade per cip 3D și stimulate cu 5 ng/mL TGF- 1(factor de creștere transformator-)sau inhibitor de 10 μm （SB 431542） timp de 24 de ore și fixat cu paraformaldehidă 4%. (A) Celulele din cipul 3D au fost colorate cu anti-o-SMA și anti-citokeratină-8. Expresia -SMA (ac) a fost crescută și expresia KRT8(df) a fost scăzută semnificativ de TGF- 1(5 ng/mL). Lungimea totală a HUVEC-urilor; vasele subțiri au fost crescute dramatic și vasele groase au fost scăzute de TGF-ß1(factor de creștere transformator-)(D, E). Diametrul a fost redus pentru vasele subțiri și groase (F, G). Aceste rezultate au fost inversate de inhibitorul SB431542. Barele de scară din micrografii indică 100 μm.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Modulează mediatorii inflamatori și factorii de creștere
Apoi, am investigat citokinele inflamatorii și factorii de creștere din supernatant; IL-1 , FGF-2, TGF- 2(factor de creștere transformator-)și TGF- 3(factor de creștere transformator-)secreția de proteine a fost dramatic mai mare în cipurile cultivate în 3D decât în fibroblastele 2D cultivate bine, chiar dacă au avut același număr total de celule. Cu toate acestea, TGF- 1(factor de creștere transformator-) nivelurile au fost similare, deoarece modelele cultivate 2D sau 3D au fost tratate cu concentrații similare de TGF- 1(factor de creștere transformator-)(Figura 5A-E). În special, eliberarea de FGF-2 din fibroblastele renale primare umane a fost de 20,9 ± 0,4 pg/zi/5 × 10 grade celule ale culturii monostratificate 2D și 3094,8 ± 0,2 pg/zi/5 × celule de 10 grade, inclusiv HUVEC-urile și HK-2 ale cipului cultivat în 3D în controlul netratat. Secreția de FGF-2 de către TGF- 1(factor de creștere transformator-)stimularea a fost de 31,0±0.2pg/zi/5×10 celule de grade pentru cultura 2D și 3683,9± 0,8 pg/zi/5×10 celule de grade pentru 3D -cip de cultură. Această creștere a producției de proteine FGF-2 în cultura monostrat 2D a fost paralelă cu o creștere a modelului de cip cultivat în 3D de către TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratament (Figura 5B).
Figura 5. Comparația modelelor cultivate 2D și 3D ca platforme de imitare a fibrozei renale.Celulele au fost placate la o densitate de 5×10 grade per godeu 2D sau cip 3D și stimulate cu 5ng/mL TGF- 1(factor de creștere transformator-)sau 10 um inhibitor (SB 431542) timp de 24 de ore. Fibroblastele renale umane primare au fost utilizate în modelul cultivat în 2D și în modelul cultivat în 3D. Fibroblastele au fost utilizate la o densitate de 8 × 10* cultivate cu HUVEC și HK-2. Raportul primar dintre fibroblasti renali umani și HUVEC, sau raportul F:H, a fost de 1:5 pentru evaluarefibrozăCelulele .HK-2 au fost utilizate la o densitate de 2×104. Detectarea factorului (A)IL-1, (B)de bază de creștere a fibroblastelor (FGF-2) și (CE)TGF-beta 1, 2 și 3 în supernatant a fost efectuată prin analiza multiplex a citokine și imunotest multiplex. Fiecare bară reprezintă media± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(factor de creștere transformator-).
beneficii cistanche tubolosa: tratarea bolilor de rinichi
În plus, am estimat expresia ARNm a citokinelor proinflamatorii, cum ar fi IL-1, IL-6, IL-8 și TNF-. Rezultatele au fost reduse semnificativ de TGF uman recombinant- 1(factor de creștere transformator-)tratament în cip cultivat 3D ca proprietate antiinflamatoare a TGF-(factor de creștere transformator-). Am descoperit că expresia ARNm a fost reglată în sus de TGF- 1(factor de creștere transformator-)inhibitor (SB431542). În plus, expresia mediată de inhibitor a IL-6, IL-8 și TNF-a fost în mod specific reglată în jos în comparație cu controlul netratat (Figura 6A-D). Nivelul ARNm al VEGF, un factor fibrotic, a fost crescut semnificativ de TGF- 1(factor de creștere transformator-)tratament. Nivelul ARNm al VEGF a fost scăzut de inhibitorul TGF- 1 (Figura 6E), în timp ce expresia ARNm a IL-10 cu efect anti-fibrotic a fost scăzută în condițiile fibrotice induse de TGF- 1 . În schimb, expresia I-10mARN a fost crescută prin tratamentul cu inhibitor de TGF{- 1(Figura 6F).
Figura 6. PCR în timp real arată expresia globală a ARNm a cipului 3D.Celulele au fost placate la o densitate de 5×10 grade per cip 3D și stimulate cu 5ng/mL TGF- 1(factor de creștere transformator-)sau 10 um inhibitor (SB431542) timp de 24 ore. ARN total extras din cip cultivat 3D. Expresia ARNm a (A)IL-1, (B)TNF-, (C)IL-6 și (D)IL{-8 reprezintă efectul antiinflamator al TGF{ {10}}(factor de creștere transformator-)tratament. Expresia (E)VEGF ca factor angiogenic a fost crescută. Expresia (F)IL-10 ca factor anti-fibrotic a fost redusă semnificativ de TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(factor de creștere transformator-).