Rolurile cruciale ale TRPM6 în reglarea circadiană a tensiunii arteriale

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Importanța canalului ionic renal TRPM6 în secreția circadiană de renină pentru creșterea tensiunii arteriale

Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto și Hiroaki Miki

Tensiune arterialaare un tipar zilnic, cu valori mai mari în perioada activă. Creșterea acesteia la debutul perioadei active crește substanțial riscul de evenimente cardiovasculare fatale. Secreția de renină stimulată de neuronii simpatici renali este considerată esențială pentru acest proces; cu toate acestea, mecanismul său de reglementare rămâne în mare parte necunoscut. Aici, arătăm importanțapotențial de receptor tranzitoriu legat de melastatină 6 (TRPM6), un canal cationic Mg2 plus -permeabil, în creșterea secreției de renină în perioada activă.TRPM6expresia este redusă semnificativ în tubul contort distal al șoarecilor hipotensivi cu deficit de Cnnm2-. Noi generăm specifice rinichilorTRPM6-soareci cu deficit si observa o scadere atensiune arterialași o dispariție a variației sale circadiene. În mod constant, secreția de renină nu este crescută în perioada activă. Mai mult, secreția de renină după activarea farmacologică a -adrenoreceptorului, ținta stimulării neuronale, este abrogată, iar expresia receptorului este scăzută în celulele secretoare de renină. Aceste rezultate indică rolurile cruciale aleTRPM6 în reglarea circadiană atensiune arteriala.

Se estimează că aproximativ un miliard de oameni din întreaga lume au hipertensiune arterială, ceea ce crește semnificativ riscul de apariție a diferitelor boli, inclusiv boli potențial fatale, cum ar fi boala cardiacă ischemică și accidentul vascular cerebral. Se știe că aceste incidente fatale legate de hipertensiune arterială apar frecvent dimineața devreme, la începutul perioadei active cândsângepresiunese ridică brusc. Secreția de renină declanșată de neuronii simpatici renali este considerată a juca un rol crucial în acest senstensiune arterialaelevație, dar mecanismul său de reglare nu este bine înțeles².

culturism cistanche

Este larg acceptat că unele minerale dietetice, în special sodiul și potasiul, joacă un rol important în controlulsângepresiune. Magneziul este un element esențial major implicat într-o varietate de activități biologice. Studiile epidemiologice au arătat o relație inversă semnificativă între nivelurile de magneziu din dietă și riscul de hipertensiune arterială3-6. Mai mult, excreția urinară de magneziu, care se presupune a fi în echilibru aproximativ cu absorbția intestinală a magneziului, este invers corelată cu riscul de hipertensiune arterială. Aceste descoperiri sugerează o asociere strânsă între homeostazia magneziului organismului șitensiune arterialareglementare, evidențiind importanța canalelor și/sau transportatorilor Mg2 plus în reglementareatensiune arteriala.

O cantitate mare de magneziu este în mod constant reabsorbită în rinichi. Majoritatea magneziului din filtratul glomerular este reabsorbit în membrul gros ascendent al ansei Henle, dar etapa finală de reabsorbție are loc la tubul contort distal (DCT)8. Ultimul proces este strâns reglementat pentru a ajusta cantitatea de reabsorbție la un nivel adecvat pentru menținerea homeostaziei magneziului. Analizele genomice ale bolilor congenitale cu simptome de hipomagneziemie au scos la iveală câteva molecule cheie implicate în acest procesTRPM6, codificarepotențial de receptor tranzitoriu legat de melastatină 6(TRPM6), care prezintă mutații la pacienții cu hipomagneziemie recesivă cu hipocalcemie secundară2,10.TRPM6formează un canal ionic permeabil Mg2 plus localizat pe membrana apicală a celulelor DCT și mediază aportul de Mg2 plus din lumenul tubular1. O altă moleculă cheie este ciclina M2 (CNNM2) și transportorul Mg2 plus localizat pe membrana bazolaterală a celulelor DCT12,13. Mutațiile Cnnm2 provoacă hipomagneziemie dominantă familială, care se caracterizează prin defecte în reabsorbția magneziului în rinichil2. Șoarecii cu deficit de Cnmm2-prezintă simptome similare de hipomagneziemie cu pierdere de magneziu în rinichil4. Rolul molecular precis al CNNM2 este încă controversat, dar mai multe linii de dovezi sugerează că acesta mediază Mg2 plus efluxul din celulele DCT prin membrana bazolaterală5, contribuind astfel la reabsorbția magneziului. Analize ulterioare ale șoarecilor cu deficit de Cnnm2-au arătat că acești șoareci au, de asemenea, semnificativ mai micisângepresiunedecât șoarecii de control4. Cu toate acestea, detaliile mecaniciste și implicarea altor canale/transportatori Mg2 plus în astasângepresiunereglementările rămân necunoscute.

DCT renal este, de asemenea, cunoscut că joacă un rol critic însângepresiunereglare deoarece reabsoarbe semnificativ sodiul și reglează volumul lichidului corporal6. Un număr de canale/transportatori de cationi, cum ar fi co-transportatorul Na-Cl (NCC), canalul epitelial de sodiu (ENaC) și schimbătorul Na plus/H plus 2 (NHE2), sunt exprimate la nivelul membranei apicale DCT și unele dintre ele. aceste proteine ​​mediază Na plus aportul în celulele DCT din lumenul tubular. Na plus intracelular este apoi extrudat din celule prin membrana bazolaterală de către Na plus /K plus -ATPaza pentru a realiza reabsorbția sa. Pe lângă implicarea directă în reglarea volumului lichidului corporal, DCT este situat în apropierea maculei dense, care controlează secreția de renina, un hormon cu rol principal în orchestrare.tensiune arterialaregulamentul17,18. Prin detectarea nivelului urinar de Cl-, celulele maculei densa stimulează celulele juxta-glomerulare (JG) din apropiere să secrete renina.

În această lucrare, efectuăm analize transcriptomului cu rinichi de șoareci hipotensivi cu deficit de Cnnm2-. Constatăm o scădere semnificativă aTrpm6, determinându-ne să generăm specifice rinichilorTrpm6-soareci cu deficit. În mod neașteptat, analizele acestei tulpini de șoarece dezvăluie un fenotip calitativ diferit de cel al deficitului de Cnnm2-: pierderea variației circadiene asângepresiune. De asemenea, constatăm că acest fenotip este cauzat de secreția afectată de renina, atensiune arteriala-hormonul de creștere al cărui nivel sanguin este în mod normal crescut în timpul fazei active.

culturism cistanche

Rezultate

Reglarea negativă aTRPM6 (potențial de receptor tranzitoriu legat de melastatină 6)expresie la șoarecii cu deficit de Cnnm2-. Pentru a explora mecanismul molecular altensiune arterialareducerea numărului de șoareci cu deficit de Cnnm2-, am efectuat analize de micromatrice ADN pentru a investiga modificările expresiei genelor în rinichiul Cnnm2f/il; Șase2-șoareci Cre, cărora le lipsesc ambele alele Cnnm2 în rinichil4. Printre genele exprimate diferențial (Tabelul 1), am ales să analizăm Pvalb șiTrpm6, ambele fiind exprimate în DCT919. Analizele cantitative PCR(qPCR) au arătat căTrpm6expresia a fost redusă în mod similar în rinichii ambelor Cnnm2fi; Șase2-Cre și Cnnm2 plus/șoareci. Deoarece atât Cnnm2 plus /A cât și Cnnm2fi/; Am analizat șase2-șoareci Cre erau hipotensivi4TRPM6 exprimare mai detaliată. Analizele imunoblotting ale lizatelor de rinichi au confirmat o scădere semnificativă aTRPM6la nivel de proteine ​​de deficit de Cnnm2-, în timp ce nivelurile de NCC și NCC fosforilat (forma activă) nu au fost afectate semnificativ, expresia CNNM2 a fost confirmată prin imunoprecipitare și analize succesive de imunoblot). Scăderea deTRPM6în rinichii Cnnm2f/i; De asemenea, șase2-șoareci Cre au fost confirmați prin analize de imunofluorescență.

Am examinat și noiTRPM6expresia la șoarecii lipsiți de CNNM4, care prezintă, de asemenea, simptome de hipomagneziemie20, dar au crescuttensiune arteriala4. Analizele de imunoblotting și imunofluorescență au indicat căTRPM6expresia este crescută în celulele DCT ale șoarecilor cu deficit de Cnnm4-, sugerând căTRPM6expresia este strâns asociată cutensiune arterialavalori, dar nu este direct legată de nivelurile de magneziu din sânge.

Regulamentul deTRPM6expresia prin Mg2 plus intracelular în celulele DCT. Pentru a caracteriza mecanismul molecular alTRPM6 la șoarecii cu deficit de Cnnm2-, am folosit o linie celulară derivată din DCT MDCT21, care exprimă predominant Cnnm2 și moderat Cnnm3 și Cnnm4 printre genele familiei Cnnm. Deoarece CNNM2 și CNNM4 au activitate puternică de eflux de Mg2 plus, în timp ce CNNM3 nu are activitate de eflux de Mg2 plus l5, am efectuat o reducere mediată de ARN (siRNA) cu interferențe mici a fie Cnnm2, Cnnm4 sau ambelor. Knockdown Cnnm2 a crescut nivelurile intracelulare de Mg plus ([Mg plus ]) și reducerea simultană a Cnnm4 a condus la o ușoară creștere a mediei [Mg2]; valoare, care nu a fost semnificativă statistic. Apoi am examinatTrpm6expresia prin qPCR și a constatat o scădere semnificativă după knockdown Cnnm2 și o scădere mult mai mare după dubla knockdown Cnnm2 și Cnnm4. Prin urmare,Trpm6expresia pare să fie reglată negativ de nivelurile intracelulare de Mg2 plus, ceea ce este în concordanță cu rapoartele anterioare23. Pentru a examina direct importanța Mg2 plus, am cultivat celule MDCT în medii cu diferite concentrații de Mg2 plus .1h, scăderea concentrației extracelulare de Mg2 plus a condus la reducerea nivelului intracelular de Mg2 plus și creștereaTrpm6expresie, sugerând un rol supresor al Mg2 plus. În cazul celulelor MDCT dublu knockdown (Cnnm2/Cnnm4),Trpm6expresia a fost suprimată cu scăderea Mg2 plus

plus concentrații de până la 0,2 mm, dar reducerile ulterioare au anulat efectul supresor; atât intracelular Mg2 plus cât şiTrpm6nivelurile nu au fost semnificativ diferite de celulele martor transfectate cu siARN atât în ​​condiții de 0.1 cât și 0.02 mM. Aceste rezultate indică un mecanism de reglare dependent de Mg2 plusTrpm6expresie, care explicăTrpm6reglarea în jos a rinichilor șoarecilor cu deficit de Cnnm2-.

Perturbarea condiționată aTrpm6 (potențial de receptor tranzitoriu legat de melastatină 6)în rinichi. În continuare, ne-am propus să generămTrpm6-soareci cu deficit pentru a investiga in continuare importantaTRPM6în regulamentul detensiune arteriala. Am folosit o clonă de celule stem (ES) embrionare care poartă un recombinantTrpm6alela (Trpm6-) care conține o secvență acceptor de îmbinare, forțând îmbinarea prematură a ARNm și rezultând un ARNm trunchiat după exonul 6. Șoarecii heterozigoți himeri au fost obținuți prin injectarea cu blastocist a celulelor ES și recombinarea a fost confirmată prin PCR. Noi le-am încrucișat pe acesteaTrpm6plus /- soareci, dar nuTrpm6-/--de_primăvara au fost obținute. Acest rezultat este în concordanță cu rapoartele anterioare care arătau letalitatea embrionară înTrpm6-soareci deficitari24,25

Prin urmare, am efectuat o întrerupere condiționată specifică rinichilorTrpm6folosind Six2-Cre, care permite exprimarea eficientă și specifică a recombinazei Cre fuzionate cu GFP în rinichiul embrionar.Trpm6fl/, șoareci Six2-Cre (specifici pentru rinichiTrpm6-şoarecii cu deficit) s-au născut în raportul mendelian aşteptat. Pentru a determina expresia luiTRPM6, am efectuat analize de imunoblotting folosind un anti-TRPM6anticorp.TRPM6nivelurile de proteine ​​au fost mult reduse în rinichii deTrpm6fl/fl, șoareci Six2-Cre, dar nu au fost observate modificări semnificative în alte organe. De asemenea, analizele de colorare prin imunofluorescență nu au arătat nicio expresie aTRPM6în celulele DCT NCC-pozitive. Nu am observat nimic semnificativTRPM6-semnal pozitiv în peste 100 de astfel de grupuri de celule NCC-pozitive, sugerând căTRPM6expresia este aproape complet suprimată în celulele DCT ale Trpmfi/; Șase2-șoareci Cre. Aceste rezultate confirmă generarea de succes a rinichilor specificiTrpm6-soareci cu deficit.

Am examinat mai întâi efectul specific rinichilorTrpm6-deficit de homeostazie a magneziului. Am menținut șoarecii în cuști metabolice și am colectat probe de urină și ser, care au fost apoi supuse cuantificării colorimetrice a nivelurilor de magneziu folosind Xilidil Blue-I. Nivelurile serice de magneziu au fost semnificativ mai mici înTrpm6ll; Șase2-șoareci Cre în comparație cu cei de controlTrpm6plus / plus ; Șase2-șoareci Cre, în timp ce nivelurile urinare de magneziu au fost mai mari. De asemenea, am efectuat analize prin spectroscopie de emisie cu plasmă cuplată inductiv (ICP-ES) pentru a măsura câteva elemente metalice majore din ser și am constatat că numai nivelurile de magneziu au fost afectate semnificativ în Trpmd/; Şase2-şoareci Cre. Aceste rezultate indică în mod clar că șoarecii cu deficiență renală de Trpm6-au hipomagnezemie cu pierdere renală de magneziu, așa cum s-a observat în micel4 cu deficit de Cnnm2-specific renal.

Lipsa variației circadiene asângepresiuneși activitatea reninei. În continuare, ne-am supusTrpm6i/l; Şase2-şoareci Cre tosângepresiunemăsurători folosind radiotelemetrie. Sistolice și diastolicetensiune arterialavalorile au fost ambele semnificativ mai mici înTrpm6l/; Șase2-șoareci Cre decât la șoarecii de control. Este de remarcat faptul că variația circadiană obișnuită atensiune arteriala, cu valori ridicate în perioada întunecată și valori scăzute în perioada de lumină la șoareci, nu a fost observată înTrpm6f/l; Șase2-șoareci Cre. Pentru a examina dacă ritmul circadian decurge normal, am folosit radiotelemetria pentru a măsura activitatea locomotivă a șoarecilor și am confirmat o variație circadiană foarte clară înTrpm6l/; Şase{{0}}şoareci Cre. De asemenea, am examinat nivelurile sanguine de vasopresină (AVP) și nivelurile de ARNm ale două gene ceas Bmall și Per2 în creier și rinichi; toate sunt cunoscute că prezintă o variație circadiană tipică27,28. Am analizat în șase momente diferite (la 0,4,8 zeitgeber times (ZT) pentru perioada de lumină și la 12,16,20 ZT pentru perioada întunecată). Șoarecii de control prezintă modele circadiene clare ale expresiei lor, așa cum sa raportat anterior28 și, din nou, nu am găsit anomalii semnificative înTrpm6/il; Șase2-șoareci Cre. De asemenea, am verificat nivelul de expresie al lui Trpm7, care codifică un canal permeabil Mg2 plus strâns legat deTRPM6, în rinichi. Tiparele de expresie au fost foarte asemănătoare în ambeleTrpm6plus / plus ; Six2-Cre și Trpm6f/; Șase2-șoareci Cre și nu au prezentat modele circadiene clare. În mod colectiv, concluzionăm că ritmul circadian decurge normal înTrpm6eu; Șase2-șoareci Cre. S-a considerat căsângepresiunecreșterea în timpul perioadei active (perioada întunecată pentru șoareci și perioada de lumină pentru oameni) atât la om, cât și la șoareci are loc ca răspuns la o creștere a secreției de renină în sânge2. Am măsurat activitatea reninei în probele de sânge colectate la șase momente diferite descrise mai sus. O creștere clară a activității reninei din sânge a fost observată în perioadele întunecate în probele de la șoareci martor, dar nu a fost observată o creștere semnificativă în probele din cele deTrpm6/lȘase2-șoareci Cre. De asemenea, am măsurat nivelul sanguin al noradrenalinei, a cărei eliberare este cunoscută ca fiind stimulată de activarea sistemului renină-angiotensină29,30. După cum era de așteptat, variația lor circadiană a dispărut și înTrpm6, șoareci2-Cre. Între timp, nivelul proteic al angiotensinogenului din sânge (AGT), o altă moleculă care limitează viteza pentru activarea sistemului renină-angiotensină la șoareci31, nu a fost afectat deTrpm6 deficienta. Rezultatele sugerează că variația circadiană afectată a reninei este importantă pentru pierderea variației circadiane asângepresiunedeTrpm6-deficienta.

Apropierea deTRPM6-exprimarea celulelor la celulele secretoare de renina. Renina este exprimată și secretată din celulele JG în rinichi17,18. Celulele JG sunt în contact direct cu macula densa, care este situată adiacent DCT și stimulează secreția de renină din celulele JG ca răspuns la reducerea nivelurilor urinare de Cl18. Colorația prin imunofluorescență pentru renină și oxid nitric sintază neuronală (nNOS), un marker al maculei dense, nu a arătat nicio anomalie în modelul sau intensitatea semnalelor pozitive observate în apropierea glomerulilor.Trpm6f/; Șase2-șoareci Cre. Prin urmare, celulele direct implicate în secreția de renina și reglarea acesteia nu par a fi afectate semnificativ deTrpm6deficienta. La fel deTRPM6este co-exprimat cu NCC în DCT, apoi am examinat relația spațială dintreTRPM6celulele care exprimă /NCC (DCT) și macula densa sau celulele JG. Imaginile confocale ale secțiunilor DCT sagitale au arătat o suprapunere aproape completă aTRPM6și semnalele NCC pe tot parcursul DCT. Apoi am colorat pentru nNOS și NCC și am constatat că zonele pozitive pentru nNOS și NCC sunt conectate, fără nicio suprapunere a semnalelor. În plus, colorarea dublă pentru renină șiTRPM6/NCC a dezvăluit că uniiTRPM6Celulele care exprimă /NCC sunt în apropiere de celulele JG care exprimă renină, sugerând căTRPM6Celulele care exprimă /NCC, precum și macula densa, pot avea un impact semnificativ asupra secreției de renină.

Secreția de renină afectată deTrpm6 (potențial de receptor tranzitoriu legat de melastatină 6)deficienta. În general, sistemul nervos autonom joacă un rol crucial în orchestrarea progresiei ritmului circadian. Secreția de renină din celulele JG în timpul perioadei active este considerată a fi stimulată de noradrenalina secretată de neuronii simpatici renali32. Pentru a investiga direct efectul unei astfel de stimulări asupra secreției de renină, am pregătit felii de rinichi și le-am stimulat cu izoproterenol, un agonist al receptorilor adrenergici (AR). Rezultatele au arătat o scădere foarte clară a semnalului renin-pozitiv rămas în felie după stimularea cu izoproterenol timp de 30 de minute. Analizele cantitative au arătat că procentul de glomeruli înconjurați de semnal pozitiv la renină a scăzut de la aproximativ 80 la sută la 30 la sută după stimularea cu izoproterenol, indicând apariția secreției masive de renină. Cu toate acestea, nu am observat un efect semnificativ al stimulării izoproterenolului asupra semnalului reninei în feliile de rinichi dinTrpm6/1; Șase2-șoareci Cre. Pentru a confirma rezultatul, am măsurat și activitatea reninei din sânge după administrarea de izoproterenol. Rezultatele arată că o creștere semnificativă a activității reninei din sânge a fost observată doar la șoarecii martor, în timp ce creșterea ritmului cardiac a fost observată în mod obișnuit la ambele tulpini. Aceste rezultate implică faptul că celulele JG secretoare de renină nu pot răspunde la stimularea neuronilor simpatici renali, în concordanță cu dispariția creșterii circadiane asângepresiuneși activitatea reninei înTrpm6l/fl; Șase2-șoareci Cre.

Celulele JG pot fi, de asemenea, stimulate să secrete renină ca răspuns la prostaglandine, printre care prostaglandina E2(PGE2) este considerată cea mai semnificativă, deoarece este secretată fiziologic de celulele maculei dense atunci când nivelurile urinare de Cl- scad17,18. Mai mult, se știe și că PGE, tratamentul feliilor de rinichi poate stimula eficient secreția de renine33. Stimularea celulelor JG cu PGE2 și izoproterenol activează în mod obișnuit producția de cAMP, care în cele din urmă provoacă secreția de renină. Prin urmare, am testat, de asemenea, efectul PGE și analogul cAMP permeabil la membrană, dibutilil-cAMP(db-cAMP).PGE2 și db-cAMP au stimulat cu succes secreția de renină în felii de rinichi din Trpmdi/A, Six2- Crează șoarecii și controlează șoarecii. Aceasta indică faptul căTrpm6 deficiența nu anulează mecanismul general implicat în detectarea semnalelor externe, transmiterea semnalelor intracelulare și executarea secreției de renină, dar afectează în mod specific răspunsul la -AR.

Scăderea expresiei -AR în celulele JG cuTrpm6 (potențial de receptor tranzitoriu legat de melastatină 6)deficienta. Răspunsul receptorului -AR afectatTrpm6l/l; Șase șoareci2-Cre ne-au determinat să investigăm starea expresiei receptorului -AR și, astfel, am efectuat imunofluorescența 1-AR, subtipul major -AR exprimat în celulele JG34. După cum sa raportat anterior34, am găsit modelul de colorare asemănător unei benzi în secțiunile renale atât ale șoarecilor martor, cât și ale Trpmdi/l, Six2-Cre. Se știe că 1-AR este puternic exprimată atât în ​​vasele de sânge, cât și în celulele JG34 și, în mod constant, celulele 1-AR pozitive la sfârșitul colorării sub formă de bandă în rinichiul de șoarece de control au fost, de asemenea, pozitive. pentru colorarea cu renină (indicată cu un vârf de săgeată). În schimb, colorarea Trpm6l/fl; Șase2-Rinichi de șoarece Cre au prezentat un număr mai mic de celule dublu pozitive 1-AR/renină, ceea ce sugerează că 1-expresia AR a fost scăzută în celulele JG. Pentru a corobora această constatare, am izolat celulele JG utilizând metoda de centrifugare cu gradient de densitate Percoll conform raportului anterior35. Analizele de imunoblotare au arătat că celulele JG pozitive pentru renină sunt îmbogățite în fracțiunea de bandă 3, ceea ce este în concordanță cu raportul lor35, iar expresia 1-AR în această fracțiune de bandă 3 a fost în mod specific mult mai mică în Trpmdi/1; Șase2-șoareci Cre. Luați împreună, am găsit astaTrpm6deficiența scade nivelul de expresie al 1-AR în celulele JG, ceea ce este în concordanță cu secreția afectată de renină.

Efectul intervenției artificiale asupra circadianuluisângepresiunevariație. În setul final de experimente, am testat efectul diferitelor intervenții asupra circadianuluisângepresiunevariație. Pentru a confirma importanța reninei, am administrat șoarecilor de tip sălbatic un inhibitor de renină aliskiren36 disponibil clinic. CaTrpm6ablația, administrarea de aliskiren prin implantarea chirurgicală a unei minipompe osmotice a suprimat semnificativ circadianulsângepresiunevariație. În continuare, am efectuat operații de denervare renală, deoarece activarea -AR pe celulele JG prin sistemul nervos simpatic este calea majoră de stimulare a secreției de renină într-o manieră circadiană2. Din nou, am constatat că intervenția a suprimatsângepresiunevariație. Aceste rezultate sunt în acord cu modelul nostru conform căruia defectele răspunsului -AR și secreția de renină sunt responsabile pentru pierdereatensiune arterialavariația în Trpmdl/l; Șase2-șoareci Cre.

De asemenea, am testat efectul creșterii conținutului de magneziu din dietă. În acest scop, șoarecii de tip sălbatic au fost hrăniți cu o dietă bogată în Mg care conține 0,6% (dietă normală:0,3% magneziu) timp de 1 lună. După cum era de așteptat, acei șoareci au prezentat niveluri crescute de Mg în sânge. Am verificat apoi nivelul de expresie alTRPM6la DCT; a scăzut drastic prin hrănirea unei diete bogate în Mg, iar gradul a scăzutTRPM6expresia a fost mai mare decât ablația renală Cnnm2. Când am măsurattensiune arterialala acești șoareci, am constatat că șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în Mg au fost semnificativ mai micisângepresiunevariatie decatTrpm6-șoareci cu deficit, ceea ce este în concordanță cu noțiunea noastră că renalăTRPM6este important pentru circadiantensiune arterialavariație.

Tabelul 1 Gene care au fost reglate în sus sau în jos în rinichii Cnnm2flfl/flfl; Şase2-şoareci Cre.

Discuţie

În acest studiu, am demonstrat importanțaTRPM6 (potențial de receptor tranzitoriu legat de melastatină 6)în regulamentul detensiune arteriala. În special, arătăm dispariția aproape completă a variației circadiene atensiune arterialaîn specifice rinichilorTrpm6-soareci cu deficit. De asemenea, am constatat că secreția de renină, un hormon cheie care orchestrează tensiunea arterială, a fost sever abrogată înTrpm6-şoareci cu deficit, ceea ce este în concordanţă cu cele observatetensiune arterialafenotip. Mai multe rapoarte au arătat că TRPM7, un alt Mg2 plus -canal permeabil aproape similar cuTRPM6, afectează și tensiunea arterială37,38. TRPM7 previne creștereatensiune arterialala administrarea angiotensinei II prin suprimarea răspunsului celulelor endoteliale vasculare la angiotensină II37. Dimpotrivă, s-a raportat recent că TRPM7 facilitează și ridicareatensiune arterialala administrarea leptinei prin medierea Mg2 plus influxul în celulele corpului carotidian38. Astfel, rolul TRPM7 întensiune arterialareglementarea este ambiguă. Cu toate acestea, deoarece nivelul de expresie al TRPM7 în rinichi nu a fost afectat de rinichiTrpm6ablație (Figura suplimentară 5), se pare că TRPM7 nu este direct implicat în fenotipurile observate în acest studiu.

După cum sa observat la șoarecii cu deficit de Cnnm2-,tensiune arterialavalorile au fost reduse înTrpm6-şoareci deficitari(Fig.2)14. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că a existat o diferență clară între acești șoareci. Întreruperea Cnnm2 este în general redusătensiune arteriala, dar variația circadiană a fost încă clar observabilă. În schimb, această variație a dispărut înTrpm6-soareci cu deficit. O astfel de diferență calitativă este, de asemenea, în concordanță cu observația noastră că variația circadiană a reninei a fost păstrată la șoarecii cu deficit de Cnnm 2- (Fig.9 suplimentară). Trebuie remarcat faptul că atât CNNM2 cât șiTRPM6se consideră că sunt importanți pentru reabsorbția renală de Mg2 plus prin mediarea transportului vectorial Mg2 plus prin DCT și, într-adevăr, șoarecii cu deficiență în oricare genă au prezentat fenotip renal Mg2 plus pierdere identic (Fig. 1 și ref. 39). Diferența calitativă atensiune arterialafenotip între Cnnm2-şiTrpm6-șoarecii deficienți sugerează că transportul Mg2 plus în DCT, funcția comună a celor două molecule, nu este direct implicat în variația circadiană atensiune arterialași secreția de renină, sugerând că rolul CNNM2-independent alTRPM6stă la baza acestor fenotipuri interesante.

Mai multe mecanisme funcționează pentru a stimula secreția de renină din celulele JG pentru a menținetensiune arteriala. Printre acestea, aportul de la neuronii simpatici renali este considerat a juca rolul principal în creșteretensiune arterialaîn perioada activă de variaţie circadiană32. Acești neuroni secretă noradrenalina, care se leagă și activează -AR pe celulele JG pentru a stimula producția de AMPc, ducând în cele din urmă la secreția de renină1732. În experimentele noastre folosind felii de rinichi obținute dinTrpm6-șoarecii deficienți, stimularea cu izoproterenol, un agonist -AR, nu a arătat niciun efect asupra secreției de renină, în timp ce stimularea cu PGE2 sau db-cAMP a crescut eficient secreția de renină (Fig. 4). PGE2 este secretat de macula densa ca răspuns la niveluri scăzute de Cl urinar și activează receptorii EP2 și EP4 de pe celulele JG, care, ca și activarea -AR, stimulează în cele din urmă producția de cAMP40. Prin urmare, aceste rezultate implică faptul că semnalizarea -AR este abrogată selectiv în celulele JG aleTrpm6-șoareci cu deficit, fără a afecta calea de semnalizare mediată de cAMP din aval. În mod constant, imunofluorescența secțiunilor de rinichi de șoarece și imunoblotting-ul celulelor JG izolate au arătat că expresia -AR a fost semnificativ scăzută în celulele JG aleTrpm6-şoareci cu deficit(Fig. 5). O astfel de expresie redusă a -AR ar trebui să facă celulele JG incapabile să secrete renină ca răspuns la stimularea nervilor simpatici în timpul perioadei active, eliminând astfel variația circadiană a nivelului de renina din sânge șitensiune arteriala. Trebuie remarcat faptul că există un studiu care a folosit șoareci knockout 1/ 2-AR, care a arătat o scădere a circadianuluitensiune arterialavariatie caTrpm6-şoareci deficitari41. Ei au atribuit-o scăderii activității locomotorii, dar rămâne posibil ca variația circadiană redusă a activității reninei să contribuie la scăderea variației circadiene apresiunea sângeluie. În mod alternativ, fundalul neobișnuit al șoarecilor lor (fond mixt de C57BL6/J, 129 și VFB; am folosit fundal C57BL6/ pur) ar putea masca efectul -AR asupratensiune arterialavariație; mediile genetice sunt critice pentru circadiantensiune arterialavariatie42.

culturism cistanche

Cum pierdereaTRPM6 (potențial de receptor tranzitoriu legat de melastatină 6)în celulele DCT duce la scăderea expresiei -AR în celulele JG a rămas evazivă. Experimentele care utilizează alte tipuri de celule au arătat că expresia -AR este reglată de diferite molecule cunoscute pentru a media semnalizarea intercelulară: Adăugarea de glucocorticoizi la mediul de cultură al liniei celulare derivate din canalul deferent DDT1 MF-2 crește expresia -AR43. De asemenea, s-a raportat că oxidul nitric (NO) a suprimat degradarea -AR în celulele cardiace prin S-nitrozilarea GRK24. Printre aceste molecule, este demn de remarcat faptul că NO este secretat de celulele maculei dense renale, stimulând celulele JG într-o manieră paracrină pentru a crește secreția de renină45. În timp ce expresia nNOS, enzima producătoare de NO în rinichi, este limitată la celulele macula densa, acestea sunt în contact direct cu celulele DCT, următorul segment al tubulelului renal6. Astfel, este posibil caTrpm6-deficitul în celulele DCT duce la scăderea expresiei -AR în celulele JG prin afectarea producerii sau eliberării de NO din celulele adiacente de macula densa.

Se știe că celulele JG comunică, de asemenea, cu alte celule prin formarea de joncțiuni gap cu celulele din jur, cum ar fi celulele mezangiale, și primesc Ca2 plus pentru a suprima secreția de renină7. Deși celulele JG și celulele DCT nu intră în contact direct între ele, ele sunt încă strâns localizate (ref. 46 și Fig. 3) și este posibil ca aceste celule să folosească comunicații joncționale între lacune prin celulele intermediare, cum ar fi celulele mezangiale; toate cele trei tipuri de celule exprimă Cx3747,48, o izoformă a conexinei care oligomerizează și constituie joncțiuni gap. O analiză ulterioară poate identifica molecula și ruta responsabile pentru semnalizarea intercelulară între celulele DCT și JG, ceea ce este important pentru a dezvălui mecanismul general al perturbării circadiane.tensiune arterialavariatie prinTrpm6-deficienta.

ÎnTrpm6-șoarecii cu deficit, variația circadiană a nivelurilor sanguine nu doar a reninei, ci și a noradrenalinei a dispărut. Activarea sistemului renină-angiotensină stimulează eliberarea noradrenalinei în fluxul sanguin29,30 și, prin urmare, pare rezonabil că efectulTrpm6 (potențial de receptor tranzitoriu legat de melastatină 6)ablația asupra nivelurilor de renina și noradrenalina din sânge a fost similară. Deoarece noradrenalina acționează și asupra -AR a celulelor JG pentru a promova secreția de renină, se presupune că cele două molecule constituie o buclă de feedback pozitiv, stimulând reciproc secreția celuilalt. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că rezultatele experimentelor de administrare a izoproterenolului arată în mod explicit defectul în secreția de renină (Fig.4) și, astfel, pare a fi cauza principală a pierderii variației circadiene atât a reninei, cât și a noradrenalinei.

Până în prezent, au fost dezvoltate și utilizate o varietate de medicamente eficiente pentru tratarea pacienților hipertensivi. Cu toate acestea, un număr semnificativ de pacienți prezintă rezistență la tratamentele convenționale care utilizează o combinație de medicamente antihipertensive majore cu mecanisme funcționale diferite4. Denervarea chirurgicală a neuronilor simpatici renali folosind catetere endovasculare a fost efectuată pe bază de probă pentru a trata o astfel de hipertensiune rezistentă50. Eficacitatea sa practică de îmbunătățiretensiune arterialacontrolul a fost controversat51,52, dar studiile publicate recent au arătat o reducere semnificativă atensiune arterialacomparativ cu martorii simulați53,54. Există, de asemenea, rezultate mixte asupra efectului denervației renale asupra variației circadiene atensiune arteriala. Unele rapoarte au arătat că amploareatensiune arterialascăderea denervației renale a fost mai mare în timpul perioadelor active53, dar alții au raportat nicio modificare a variației circadiane atensiune arteriala55,56. În analiza folosind animale de laborator, operațiile noastre de denervare renală împotriva șoarecilor au suprimat variația circadiană atensiune arteriala(Fig.6). Operații similare au fost efectuate și împotriva șobolanilor, dar chiar și șobolanii de tip sălbatic de control nu prezintă aproape nici un circadiantensiune arterialavariație în primul rând57,58, ceea ce face dificilă evaluarea efectului operației. Sunt necesare mai multe studii pentru a clarifica impactul denervației renale asupra circadianuluitensiune arterialavariație, care ne-ar ajuta și să înțelegem mecanismul mai detaliat altensiune arterialadereglare de cătreTrpm6-deficienta.

Măsurătorile telemetrice aletensiune arteriala, ritmul cardiac și activitatea locomotorie. Măsurătorile telemetrice aletensiune arterialaau fost efectuate după cum urmează4.Tensiune arterialatraductoarele (TAl1PA-C10, Data Sciences International) au fost inserate chirurgical în artera carotidă comună stângă a șoarecilor de 2- până la 3-lună sub anestezie (prin administrare intraperitoneală a 0,3 mg/ kg medetomidină, 4 mg/kg midazolam și 5 mg/kg butorfanol). După 3 săptămâni de recuperare, sistolic și diastolictensiune arterialavalorile au fost înregistrate cu o prelevare programată de 2-min la fiecare 60 de minute, utilizând software-ul Dataquest ART (Data Sciences International). Înregistrările au fost obținute timp de cel puțin cinci zile consecutive, iar mediile măsurătorilor efectuate la aceeași oră în fiecare zi au fost determinate pentru fiecare șoarece și utilizate pentru analize statistice ulterioare, cu excepția Fig. 4 suplimentară. Pe baza Nakamori și colab.68, renal denervarea a fost efectuată cu 2 săptămâni înainte de inseraretensiune arterialatraductoare după cum urmează. Rinichii au fost expuși prin incizie abdominală și țesutul conjunctiv din jurul vaselor renale a fost disecat. Apoi, vasele renale au fost scufundate în etanol 95 la sută timp de 2 minute și apoi, în PBS timp de 2 minute. Operația simulată a fost efectuată folosind procedura echivalentă fără imersie în etanol. Aliskirenul a fost administrat 25 mg/kg/zi prin încorporarea subcutanată a unei pompe osmotice (1004, ALZET), iar înregistrarea a fost începută din ziua următoare introducerii pompei. Pentru suplimentarea cu magneziu, șoarecii au fost hrăniți cu o dietă îmbogățită cu magneziu, care conține 0,6% magneziu (CLEA Japonia) timp de 1 lună înainte.tensiune arterialamăsurare.

Frecvența cardiacă a fost măsurată cu același sistem de radiotelemetrie, cu excepția faptului că înregistrarea a fost efectuată cu o prelevare programată de 30-s în fiecare minut și a fost utilizată o singură măsurătoare pentru analize ulterioare.

Activitățile locomotorii au fost evaluate folosind același sistem de radiotelemetrie, prin monitorizarea modificărilor puterii semnalului de la traductor datorate locomoției animalului. În acest caz, traductoarele au fost introduse chirurgical în spațiul subcutanat din flancul drept. Înregistrările au fost efectuate cu aceleași intervale de timp ca cele descrise mai sus.

culturism cistanche

Referințe

1. Giles, TDCritmul circadian altensiune arterialaşi relaţia cu evenimentele cardiovasculare.J. Hipertens. 24, S11-S16 (2006).

2. Smolensky, MH, Portaluppi, F.& Hermida, RC inTensiune arterialaMonitoring in Cardiovascular Medicine and Therapeutics, 3rd EDT.(eds White, WB)Part II, Ch.6, 105-128(Springer,2016).

3. Witteman, JCet al. Un studiu prospectiv al factorilor nutriționali și al hipertensiunii arteriale în rândul femeilor din SUA. Circulație 80,1320-1327(1989).

4. Ascherio, A.et al. Un studiu prospectiv al factorilor nutriționali și al hipertensiunii arteriale în rândul bărbaților din SUA. Circulație 86,1475-1484(1992).

5. Ascherio, A.et al. Studiul prospectiv al factorilor nutritivi,tensiune arterialași hipertensiune arterială în rândul femeilor din SUA. Hipertensiune arterială 27,1065-1072(1996).

Notă:cele de mai sus nu sunt o listă completă de referință