Starea actuală a neuroprotecției în bolile cardiace congenitale Partea 3

3.2. Evaluarea semi-cantitativă a ADN-ului mitocondrial ectopic

Imaginile colorării cu Hsp60 (matricea mitocondrială) și colorării cu histonă-H2B (markerul nuclear) au fost scăzute din imaginile colorării dsDNA. Apoi, folosind funcția „AdjustThreshold” a software-ului lmage] (National Institutes of Health), imaginile au fost binarizate.

Mitocondriile sunt fabricile de energie din celule, responsabile de sintetizarea ATP pentru a furniza energia necesară celulelor. Matricea mitocondrială este lichidul intern al mitocondriilor, care conține o varietate de enzime și ioni și este un loc cheie pentru diferite reacții biochimice ale mitocondriilor. Memoria este una dintre cele mai importante abilități cognitive ale ființelor umane. Deși cele două pot părea fără legătură, sunt strâns legate.

Cercetările arată o interacțiune între matricea mitocondrială și memorie. Enzimele și ionii din matricea mitocondrială pot afecta direct excitabilitatea neuronilor prin reglarea metabolismului energetic și a stării canalului ionic în celulele neuronale, afectând astfel memoria. În plus, există o varietate de molecule de semnalizare în matricea mitocondrială, care pot fi transmise neuronilor din aval prin axonii și sinapsele neuronilor, afectând eficiența de transducție a semnalului neuronilor, afectând astfel formarea și consolidarea memoriei.

În același timp, activitatea memoriei afectează direct și starea matricei mitocondriale. Activitățile de memorie vor crește consumul de energie al neuronilor și vor promova reacția redox în matricea mitocondrială, afectând astfel nivelul metabolic al mitocondriilor și echilibrul ionic intracelular, afectând în continuare excitabilitatea și eficiența de transducție a semnalului neuronilor.

Prin urmare, menținerea sănătății mitocondriale este crucială pentru menținerea unei bune funcții de memorie. Menținând obiceiuri bune de viață, cum ar fi dieta regulată, exerciții fizice moderate, somn adecvat etc., puteți contribui la menținerea sănătății matricei mitocondriale. În plus, funcția de memorie poate fi, de asemenea, îmbunătățită printr-o intervenție farmaceutică adecvată pentru a promova reacțiile biochimice și semnalizarea în cadrul matricei mitocondriale.

În viața de zi cu zi, putem exercita memoria în mai multe moduri, cum ar fi cititul, studiul, gândirea, jocurile etc. În același timp, ar trebui să acordăm atenție și menținerii sănătății bune pentru a menține mai bine sănătatea matricei mitocondriale. Cred că prin aceste eforturi, cu siguranță vom avea o memorie mai bună și vom face față mai bine diferitelor provocări din viață și muncă. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche deserticola poate îmbunătăți semnificativ memoria, deoarece Cistanche deserticola poate regla și echilibrul neurotransmițătorilor, cum ar fi creșterea nivelului de acetilcolină și a factorilor de creștere. Aceste substanțe sunt foarte importante pentru memorie și învățare. În plus, Cistanche deserticola poate, de asemenea, să îmbunătățească fluxul sanguin și să promoveze livrarea de oxigen, ceea ce poate asigura că creierul primește suficiente nutrienți și energie, îmbunătățind astfel vitalitatea și rezistența creierului.

Faceți clic pe cunoașteți suplimentele pentru a crește memoria

Am selectat dsDNA puncta cu dimensiuni cuprinse între 2 și 20 um' (circularitate 0.1-1.0) utilizând funcția „Analiză-Analizează particule”. dacă era necesar, imaginile originale au fost examinate pentru numărarea finală. Dacă semnalul histonei H2B ar fi mic. apoi imaginile scăzute au arătat structuri asemănătoare gogoșilor.

Acestea reprezintă ADNdc citosol de origine nucleară și ar trebui eliminate din cantitatea de ADNdc citosol de origine mitocondrială. Gama de dimensiuni poate fi modificată în funcție de tipul celulei sau de originea specimenelor histologice. Figura lE prezintă un exemplu de numărare a ADN-ului mitocondrial ectopic

puncte folosind 1B D.

Alternativ, imaginile colorării cu Hsp60 au fost scăzute din imaginile colorării dsDNA. Apoi, numărul dsDNA puncta a fost numărat folosind funcțiile „Adjust-Threshold „Analyze-Analyze Particles”. Ulterior, dsDNA puncta fără semnalul histonă-H2B au fost numărate prin observație directă. Ultima metodă este potrivită atunci când imaginile histonă-H2B arată un raport semnal-zgomot scăzut.

În total, această metodă poate arăta clar scurgerea ADN mitocondrial ectopic în citoplasmă și permite o evaluare obiectivă și statistică a unui astfel de ADN mitocondrial ectopic în celule.

4. Discutie

În studiul nostru, am dezvoltat o metodă care permite numărarea ADN-ului mitocondrial citoplasmatic. Detectarea ADN-ului mitocondrial citoplasmatic a fost raportată prin utilizarea tehnicilor de imunofluorescență, dar metodele nu au fost cantitative pentru evaluarea ADN-ului mitocondrial citoplasmatic în majoritatea cazurilor [15,25]. Într-un alt studiu, PCR cu picături a fost efectuat pentru a cuantifica ADN-ul mitocondrial circulant [9].

recent, Sato et al. [26,27] a publicat un protocol excelent pentru evaluarea ADN-ului citoplasmatic prin microscopie imunofluorescență utilizând anticorpi Lamin B1 (LMNB1) ca marker de structură nucleară și subunitatea 4 a citocrom c oxidazei (COX4) ca marker de structură mitocondrială. Acest protocol pare foarte util pentru cuantificarea dsDNA citoplasmatică de origine nucleară.

Cu toate acestea, când am încercat COX4 sau alți markeri de membrană mitocondrială, inclusiv markeri interni și externi, a fost foarte dificil să diferențiem cu precizie citoplasma de mitocondrii.

De exemplu, dacă am observat semnale circulare folosind un marker de membrană mitocondrială și am observat semnale dsDNA în interior, atunci acest dsDNA ar putea reprezenta fie ADN mitocondrial în interiorul mitocondriilor circulare (normal) fie ADN mitocondrial citoplasmatic în afara mitocondriilor asemănătoare gogoșilor (ectopic). Astfel, am folosit Hsp60 ca marker de etichetare a matricei mitocondriale pentru a evalua ADN-ul mitocondrial ectopic din citoplasmă.

Așa cum este descris într-o revizuire recentă [23], există multe tipuri diferite de ADN citoplasmic de origine nucleară și majoritatea dintre ele sunt pozitive pentru markerii histonelor. Datorită limitării combinației de anticorpi utilizați pentru tripla colorare, am folosit histone H2Bas un marker de histonă.

Cu toate acestea, dacă această limitare este rezolvată, H2AX poate fi un marker mai bun pentru dsDNA citoplasmatic de origine nucleară. ADNdd citoplasmatic histon-H2B-negativ a fost observat rar în celulele HeLa de control utilizate în acest studiu, dar un astfel de ADNdc de origine nucleară poate fi prezent dacă sunt utilizate alte linii celulare sau condiții.

Hibridizarea in situ a ADN-ului mitocondrial utilizată în lucrarea noastră recentă este potrivită pentru evaluarea calitativă, dar ar putea fi dificil de utilizat hibridizarea in situ pentru evaluarea cantitativă [8].

Hibridizarea in situ expune specimenul la temperaturi ridicate, ceea ce poate duce la deformarea sau zgomotul unor părți ale specimenului. Pe de altă parte, metoda imunocitochimică prezentată în această lucrare poate obține semnale cu zgomot de fond scăzut. În lucrarea noastră recentă, în celulele umane și peștii zebra utilizate ca modele de boala Parkinson, am arătat că ADN-ul mitocondrial a fost scurs în citoplasmă, care este toxic pentru celule. De asemenea, am observat că cantitatea de ADN mitocondrial citosolic a crescut în țesuturile cerebrale post-mortem ale pacienților cu boala Parkinson [8].

Aceste linii de dovezi sugerează că o cantitate crescută de ADN mitocondrial ectopic scurs din mitocondrie poate induce inflamație acută și cronică care duce la diferite boli, inclusiv boala Parkinson și insuficiența cardiacă; astfel, reglarea în sus a degradării ADN-ului citosolic sau inhibarea senzorilor săi ar putea fi un potențial obiectiv terapeutic pentru aceste boli [8,28].

Metoda introdusă în această lucrare pentru evaluarea cantitativă a ADN-ului mitocondrial ectopic servește ca un instrument important pentru cercetările ulterioare în acest domeniu.

Contribuții ale autorului: HM și MTH au formulat ipotezele, au conceput majoritatea experimentelor, au efectuat experimentele, au analizat datele și au scris manuscrisul. NM a efectuat experimentele legate de celulele cultivate. Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțare: Această lucrare a fost susținută de granturi de la AMED (numerele de grant JP21gm6110028 și JP19dm0107154 (HM)), Fundația pentru Știință Takeda (HM), JSPS KAKENHI (numerele de grant JP14516799 (HM), JP 16690754 (1HM) și JP 16690735 (1HM) ), JST (Moonshot R&D; grant numberJPMJMS2024 (HM)) și Grants-in-Aid de la TBRF (grant number TBRF-RF 21-135 (HM)).

Declarație de disponibilitate a datelor: Datele și instrumentele descrise în acest manuscris sunt disponibile la cerere.

Mulțumiri: Îi mulțumim lui Shinano Kobayashi pentru participarea la discuții utile și pentru furnizarea de sprijin continuu. Mulțumim Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) pentru că a oferit o bursă postdoctorală TBRF pentru cercetătorii străini către MH (TBRF-RF 21-135).

Conflicte de interese: Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Referințe

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Soare, L.; Chen, ZJ Roluri pivotale ale semnalizării cGAS-cGAMP în apărarea antivirală și efectele imuneadjuvante. Știință 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. Acetilarea indusă de recunoașterea genomului herpesvirusului a IFI16 nuclear este esențială pentru translocarea citoplasmatică, inflamazomul și răspunsurile IFN. PLoS Pathog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, NM; Diner, BA; Hancks, DC; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, stabilizarea IFI16 mediată de cGAS DM promovează semnalizarea înnăscută în timpul infecției cu virusul herpes simplex. Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavarone, AT; Portnoy, DA c-di-AMP secretat de Listeria monocytogenes intracelular activează un răspuns Iinterferon de tip gazdă. Știință 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Sen, P.; Wangensteen, KJ; Simithy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; et al. Citoplasmiccromatina declanșează inflamația în senescență și cancer. Natura 2017, 550, 402–406. [CrossRef]

6. Takahashi, A.; Loo, T.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Miyata, K.; Frizer, GN; et al.Reglarea în jos a DNazelor citoplasmatice este implicată în acumularea de ADN citoplasmatic și SASP în celulele senescente. Nat.Comun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.;Chin, HS; et al. Macroporii BAK/BAX facilitează hernia mitocondrială și efluxul ADNmt în timpul apoptozei. Știință 2018,359, eaao6047. [CrossRef]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. dsDNA citosolic de origine mitocondrială induce citotoxicitate și neurodegenerare în modelele celulare și zebrafish ale bolii Parkinson. Nat. comun. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Soare, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; et al. Parkin și PINK1 atenuează inflamația indusă de STING. Natura 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, deputat; Croteau, DL; Bohr, VA Suplimentarea NAD(+) reduce neuroinflamația și senescența celulară într-un model de șoarece transgenic al bolii Alzheimer prin cGAS-STING. Proc. Natl.Acad. Sci. SUA 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com