Efectele naringeninei asupra profilurilor MiRNA-mARN în celulele HepaRG

Pentru mai multe detalii, contactați:tina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Naringenin, un firescflavonoidgăsit pe scară largă în fructele citrice, s-a raportat că posedă proprietăți antioxidante, antiinflamatorii și hepatoprotectoare ca supliment alimentar natural. Cu toate acestea, mecanismul de reglare al naringeninei în ficatul uman rămâne neclar. În studiul de față, secvențierea ARN mesager (mRNA-seq), secvențierea microARN (miRNA-seq) și qPCR în timp real au fost utilizate pentru a distinge diferențele de expresie între celulele HepaRG de control și cele tratate cu naringenină. Am obținut 1037 de ARNm exprimate diferențial și 234 de miARN. Conform predicției și analizei integrării țintei in silico, am găsit 20 de perechi potențiale miARN-ARNm implicate înficatmetabolism. Acest studiu este primul care oferă o perspectivă a interacțiunilor miARN-ARNm în reglarea naringeninei prin analiza integrată a mRNA-seq și miRNA-seq în celulele HepaRG, care caracterizează în continuare valoarea nutraceutică a naringeninei ca aditiv alimentar.

Cuvinte cheie: naringenina; mARN-seq; miARN-seq; celulele HepaRG

faceți clic pentru a obține mai multe informații despre produs

1. Introducere

Naringenin, un flavonoid natural, se găsește din abundență în citrice și alte fructe comestibile, cum ar fi grepfrutul, portocalele, bergamota, roșiile și smochinele [1]. După administrarea orală, naringenina este distribuită pe scară largă în tractul gastrointestinal și ficat [2,3] și prezintă o proprietate antioxidantă directă prin activitatea de captare a radicalilor liberi datorită structurii sale moleculare și induce sistemul antioxidant endogen în ficat [4]. Dovezile tot mai mari din studiile in vitro și in vivo au identificat diferite capacități de protecție ale naringeninei, cum ar fiantiinflamator[5], antioxidant [6], antifibroză [Z] și hepatoprotector 4,8| Activități. Aceste capacități sugerează că naringenina alimentară ar putea fi aplicată pentru a preveni sindromul metabolic și bolile maligne, inclusiv hepatita fulminantă,boală de ficat, fibroză etc. 19,10]. Cu toate acestea, există puține studii detaliate despre efectele reglatoare ale naringeninei asupra genelor generale ale ficatului [4].

MicroARN-urile (miARN) sunt o clasă de molecule de ARN monocatenar, necodante, cu o lungime de 18-26 nucleotide codificate de gene endogene, care prezintă o gamă largă de funcții de reglare biologică în filogenie, diferențiere, proliferare și apoptoză. [11]. miARN, care leagă ARN-urile mesager (ARNm) prin recunoașterea specifică secvenței, reglează negativ expresia genelor la nivel post-transcripțional prin degradarea ARNm-urilor țintă [12]. Sub stimulare exogenă, expresia miARN este modificată, iar apoi expresia ARNm țintă este reglată. În cele din urmă, funcțiile fiziologice extinse sunt modificate pentru a face față provocărilor cauzate de stimularea exogenă [13]. O metodă mai fiabilă pentru prezicerea relațiilor țintă miARN-mARN este integrarea simultană a analizei mRNA-seq cu analiza miRNA-seq folosind un anumit context de procesare in silico [14].

Prin urmare, obiectivul nostru a fost să studiem efectele naringeninei asupra genelor globale și să evidențiem posibilul mecanism de reglare al perechilor miARN-ARNm din ficat. În studiul de față, modificările expresiei ARNm și profilurile de expresie a miARN au fost investigate în celulele HepaRG prin efectuarea de mRNA-seq, miRNA-seq, analize bioinformatice și qPCR în timp real pentru a oferi dovezi pentru potențialul naringeninei ca supliment alimentar natural.

2. Rezultate

2.1.Analiza secvențierii transcriptomului în răspunsul la Naringenin

Pentru a identifica modificările expresiei ARNm alecelulele HepaRGca răspuns la naringenină, opt biblioteci complementare de ADN (ADNc) din grupul de control (CK-1, CK-2, CK-3 și CK{-4) și grupul experimental (T-1, T{-2, T{-3 și T{-4) au fost construite cu ARN total și supuse secvențierii Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou , China). Prezentări de ansamblu asupra rezultatelor de secvențiere și asamblare pentru grupul de control și grupul experimental sunt prezentate în Tabelul 1. Modificările expresiei genice au fost analizate prin compararea grupurilor tratate și de control. După cum se arată în Figura la, grupul expus la naringenină a exprimat 1037 gene exprimate diferențial (DEG) în comparație cu grupul de control. O hartă termică de 1037 DEG a arătat analiza grupului de control și a grupului de naringenin (Figura 1b; 381 gene reglate în sus și 656 în jos; Tabel S1, Materiale suplimentare).

Conform sistemului de clasificare Gene Ontology (GO), 1037 DEG au fost clasificate în trei categorii funcționale majore (proces biologic, componentă celulară și funcție moleculară) și 61 de subcategorii (Figura 2). Dintre procesele biologice, procesul celular(731) a fost cel mai frecvent reprezentat, urmat de procesul cu un singur organism (672) și de reglare biologică (595). În categoria componentei celulare, o proporție semnificativă de clustere a fost atribuită celulei (727), părții celulare (721) și organelelor (580). Genele implicate în grupurile de legare (666) și activitate catalitică (238) au fost reprezentate în mod deosebit în categoria funcției moleculare.

Clasificarea Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a fost găsită pentru 1037 DEG care au fost clasificate în continuare în primele douăzeci de căi biochimice în funcție de cea mai mică valoare q și cel mai mare GeneNumber în adnotarea căii (Figura 3). GeneNumber și raportul genelor adnotate din primele cinci căi sunt lupus eritematos sistemic (33,8,4 la sută), alcoolism (38,9,67 la sută), dereglare transcripțională în cancere (22, 5,6 la sută), calea de semnalizare PI3K-Akt (34, 8,65 la sută), și cascade de complement și coagulare (12, 3,05 la sută o). Au existat mai mult de 10 gene îmbogățite printre cele cinci căi. În general, tratamentul cu naringenin a avut un impact semnificativ asupra profilului global de expresie genică a celulelor HepaRG. Aceste rezultate au implicat că genele implicate în aceste căi pot juca roluri cruciale în reglarea naringeninei.

2.2. Analiza nivelurilor de transcriere miRNA ca răspuns la Naringenin

În acest studiu, ne-am propus să stabilim dacănaringeninaexpunerea modifică nivelurile de expresie ale miARN-urilor în celulele HepaRG. După expunere, am colectat ARN-uri mici și am măsurat abundența lor relativă folosind Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou, China). După cum se arată în Tabelul 2, au fost generate citiri curate a opt eșantioane, respectiv, după îndepărtarea citirilor de contaminanți. O prezentare generală a citirilor pentru secvențierea ARN-ului mic de la date brute la calitate înaltă și cu filtrare de calitate este oferită în Tabelul 2. Distribuțiile de lungime ale ARN-urilor mici au fost similare între biblioteci, deoarece ARN-urile 21-23 nt au fost cele mai abundente (Figura 4). ).

Toate ARN-urile mici au fost aliniate în baza de date GeneBank (Versiunea 209.0) și în baza de date Rfam (11.0) pentru a identifica și elimina ARN ribozomal (ARNr), ARN condițional mic (ARNsc), nucleolar mic (ARNs), nuclear mic (ARNs) și ARN de transfer (ARNt). În conformitate cu genomul de referință, aceste ARN-uri mici mapate la exoni, introni și secvențe repetate au fost, de asemenea, îndepărtate. ARN-urile mici de filtrare au fost căutate în baza de date miRBase (Versiunea 21) pentru a identifica miARN-urile. Harta termică a 3373 de miRNA-uri arată analiza grupului de control și a grupului de naringenin în Figura 5a. Profilul Illumina HiSeq2500 a celor 3373 de miARN analizați în expunerea la naringenină față de probele de control a arătat că un total de 234 de miARN exprimate diferențial (DEM, 174 sus și 60 reglați în jos; Tabelul S2, Materiale suplimentare) au fost detectabile în celulele HepaRG (Figura 5b) .

2.3. Predicția țintei și analiza integrării profilurilor de expresie ARNm și miARN ca răspuns la Naringenin

Acționând la nivel post-transcripțional, miARN-urile reduc și/sau reduc expresia genei ARNm celular prin scindarea ARN-ului țintă. Pentru a prezice genele țintă a 234 DEM-uri, am efectuat analize computaționale folosind ARNhybrid (v2.1.2) plus luminator (v6). .01), Miranda (v3.3a) și TargetScan (Versiunea:7.0). Profilarea simultană a nivelurilor de 234 DEM și 1037 DEG in silico poate identifica mARN-urile țintă prezumtive ale miARN-urilor. Am selectat intersecția DEG-urilor și genele țintă ale DEM-urilor și apoi am efectuat analize bioinformatice asupra acestor gene de intersecție. Au fost obținute un total de 5607 perechi miARN-mARN negative pentru tratamentul cu naringenină, cu implicarea a 216 DEM și 681 DEG (Tabelul S3, Materiale suplimentare). În conformitate cu sistemul de clasificare GO, 681 DEG au fost clasificate în 58 de subcategorii (Figura 6). Primele trei subcategorii nu s-au schimbat în trei categorii funcționale majore în comparație cu analiza de secvențiere a transcriptomului (Figurile 2 și 6).

Analiza de îmbogățire a căilor pentru 681 DEG de 5607 perechi miARN-ARNm negative a identificat primele douăzeci de căi în funcție de cea mai mică valoare q și cel mai mare Număr Gene în adnotarea căii după expunerea la naringenină (Figura 7): cu calea de semnalizare PI3K-Akt (25,8,96) la sută )fiind a opta cale și a doua cea mai abundentă.

2.4. Validarea qPCR în timp real a reglării naringeninei în metabolismul hepatic și perechile potențiale de reglare miARN-ARNm

În conformitate cu adnotările globale ale funcției genelor, revizuirea literaturii și relația lor potențială cu miRNA-urile care răspund la naringenină, 19 DEG (ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTCD, ABAT, AZSTIN2, HS66) , B4GALT6, GUSB, DCT, ALAS2 și MAT1A) au fost selectați manual ca reprezentanți pentru rolurile lor potențiale în metabolismul hepatic. În plus, calea de semnalizare PI3K-Akt a fost îmbogățită semnificativ (a patra în analiza KEGG a ARN-seq, Figura 3; a opta în analiza KEGG a miRNA-ARN-seq, Figura 7); prin urmare.11 DEG (PDGFRB. CSF1R. FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1 și NFkB1) dintre căile de semnalizare PI3K-Akt au fost eliminate.

Am descris aici interacțiunea dintre 30 de grade și 11 miARN umani (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{{9 }}p, hsa-miR-6837-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR{{19} }a-3p, hsa-miR-7-5p și hsa-miR-200a-5p), inclusiv 20 de interacțiuni negative miARN-mARN (Figura 9). După cum se arată în Figura 9, un singur miARN poate regla mai multe ARNm-țintă și invers (de exemplu, ABAT HS6ST3, B4GALT6 și DCT ar putea fi reglate simultan de hsa-miR-429; HS6ST3 poate fi reglat simultan de hsa-miR -429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR{-519a-3p, hsa-miR{-676-3p, hsa-miR-7-5 p și hsa-miR-194-5p; unele DEG nu aveau DEM perechi). Profilurile de expresie ale 19 DEG legate de metabolismul hepatic și 11 DEG dintre calea de semnalizare PI3K-Akt au fost validate în continuare utilizând qPCR în timp real (Figura 9a, b). Nivelul de expresie a 11 miARN umani (două sus și nouă reglați în jos) a fost evaluat în continuare pentru modificările induse de naringenină prin qPCR în timp real, în concordanță cu rezultatele secvențierii (Figura 9c). Deși au existat unele diferențe cantitative între cele două platforme analitice, asemănările dintre datele ARN-seq și PCR în timp real au sugerat că datele ARN-seq erau reproductibile și de încredere.

3. Discuții și concluzii

Descoperirile discutate aici dezvăluie primele informații detaliate cu privire la modificările paralele ale expresiei ARNm și miARN în celulele HepaRG ca răspuns lanaringenina. Am efectuat o analiză integrativă a acestor date, inclusiv 234 DEM și 1037 DEG induse de naringenină, care oferă o perspectivă globală asupra interacțiunilor miARN-ARNm ale naringeninei în mecanismul de reglare. În conformitate cu adnotările funcției genelor și revizuirea literaturii de specialitate, au fost eliminate 19 DEG legate de metabolism. În special, calea de semnalizare PI3K-Akt a fost semnificativ îmbogățită atât în ​​analiza secvențierii transcriptomului (a treia cea mai abundentă și clasată pe locul patru), cât și în analiza de integrare a profilurilor de expresie miARN-mARN (a doua cea mai abundentă și clasată pe locul opt) ca răspuns la naringenină. În plus, 11 DEG din calea de semnalizare PI3K-Akt au fost validate în continuare utilizând analiza qPCR în timp real. În această lucrare, am construit o rețea de reglementare miRNA-mARN în conformitate cu seturile de date DEM și DEG și informațiile de direcționare a miRNA. Unele studii au demonstrat că rețeaua de reglementare miARN-mARN răspunde laafectarea ficatului, inclusiv carcinomul hepatocelular și stresul oxidativ [15]. Deși au fost identificate mai multe fenomene de activare a ARN induse de miARN [16], în cele mai multe circumstanțe, corelația negativă dintre miARN și ARNm-urile țintă a acestora este adesea considerată suport pentru țintirea miARN [17]. În cele din urmă, 20 de perechi de corelație negativă miARN-ARNm au fost identificate cu implicarea metabolismului hepatic și a căii de semnalizare PI3K-Akt.

În ceea ce privește genele globale, am abordat întrebarea noastră de cercetare particulară folosind analiza căii pentru a evidenția 19 DEG-uri legate de clusterele funcționale: metabolism, inclusiv metabolismul lipidic (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C și B4GALT6), metabolismul energetic (CA9 și NDUFA4L2) , Metabolismul cofactorilor și vitaminelor (TH, LIPT2 și FTCD), metabolismul aminoacizilor (RRM2, AZIN2, DCT, ALAS2 și MAT1A), biosinteza și metabolismul glicanilor (HS6ST3 și GUSB) și metabolismul carbohidraților" (HKDC1, PCK1, UGDH și ABAT). Acești 19 DEG îmbogățiți pentru metabolism sunt implicați în principal în sensibilitatea la insulină, acumularea de lipide, stocarea glicogenului și consumul de energie. Studiile anterioare au raportat că reglarea în jos a ALOX15 la leziunile hepatice induse de alcool la șoareci[18], CA9 la șoarecii BALB/C [19], boala hepatică grasă nealcoolică subțire (NAFLD) [20], HKDC1 [21] și reglarea în sus a UGDH [22] pot ameliora semnificativ stresul oxidativ, acumularea de lipide și afectarea ficatului. Eliminarea NDUFA4L2 a suprimat acumularea de ROS apoptoza în celulele carcinomului hepatocelular (HCC) [23]. Silenția RRM2 a inhibat proliferarea celulelor NCI-H929 [24], iar supraexpresia FTCD a suprimat proliferarea celulară prin promovarea leziunii ADN și inducerea apoptozei celulare în celulele HCC [25]. Ablația ACSL5 a îmbunătățit sensibilitatea la insulină a crescut cheltuiala de energie și a întârziat absorbția trigliceridelor la șoareci [26]. Suplimentarea cu DCT a îmbunătățit steatoza și inflamația ficatului asociate vârstei [27]. Formarea picăturilor de lipide la stimularea acizilor grași și a virusului hepatitei C în celulele knockdown PLA2G4C a fost afectată [28]. Reglarea în jos a LIPT2 a inhibat sinteza acizilor grași [29]. Suprareglarea ABAT [30], AZIN2 [31], B4GALT6 [32], HS6ST3 [33] și GUSB [34] ar putea promova descompunerea acizilor grași și a glicogenului. Supraexprimarea ALAS2 ar putea îmbunătăți capacitatea hematopoietică a ficatului [35l, iar MAT1A exprimată în hepatocite a menținut starea diferențiată a acestor celule [36]. În concordanță cu constatările descrise mai sus, reglarea acestor gene metabolice în rezultatele noastre poate fi favorabilă pentru îmbunătățirea metabolismului ca răspuns la naringenină.

Calea de semnalizare PI3K-Akt poate oferi indicii pentru mecanismul molecular implicat în metabolism, inflamație și stresul oxidativ [37], care joacă un rol esențial în răspunsul la naringenină. Calea de semnalizare PI3K-Akt are diverse efecte în aval asupra metabolismului celular, fie prin reglarea directă a transportatorilor de nutrienți și a enzimelor metabolice, fie prin controlul factorilor de transcripție care reglează expresia componentelor cheie ale căilor metabolice [38,39], inclusiv metabolismul glucozei, biosinteza. a macromoleculelor și menținerea echilibrului redox. S-a raportat că atenuarea PDGFRB a inhibat activarea și proliferarea celulelor stelate hepatice și a ameliorat fibroza hepatică [40]. Inhibarea în colaborare a CSF1R și FGFR2 este de așteptat să sporească efectele antitumorale prin țintirea evaziunii imune și a angiogenezei în micromediul tumoral [41]. Doborârea ITGB4 a suprimat glicoliza în fibroblastele asociate cancerului [42]. Deteriorarea genetică a PCK1 a prevenit o creștere indusă de acizi grași a fluxului oxidativ, a stresului oxidativ și a inflamației [43], care a fost, de asemenea, corelată cu căile de semnalizare guvernate de insulină [44]. S-a demonstrat că supraexprimarea CREB3L3 nucleară a indus lipoliza sistemică, cetogeneza hepatică și sensibilitatea la insulină cu cheltuială de energie crescută [45]. Inhibarea CREB3L1 a blocat invazia cancerului și metastazele [46]. NFkB este un regulator cheie al dezvoltării imune, al răspunsurilor imune, al inflamației și al cancerului [47]. A fost bine stabilit că suprimarea NFkB transduce semnalele antiinflamatorii și reduce inflamația [48]. În calea de semnalizare PI3K-Akt, rezultatele noastre au arătat că naringenina a redus semnificativ expresiile ARNm ale PDGFRB, PCK1, CREB3L1 și NFkB1 cu miARN-uri înrudite (has-miR-1306-5p și hsa-miR{{40} }p) fiind semnificativ diminuat. Prin urmare, datele noastre au sugerat că naringenina poate juca un rol benefic în stresul antiinflamator, antioxidant și ameliorativ în metabolismul prin inhibarea căii de semnalizare PI3K-Akt.

Acest studiu a fost primul care a integrat analiza mRNA-seq și miRNA-seq în ficat ca răspuns la naringenină și oferă o perspectivă a metabolismului în reglarea naringeninei. În ceea ce privește metabolismul și calea de semnalizare PI3K-Akt, cele 11 DEM, 30 DEG și 20 de perechi miARN-ARNm au nevoie de mai multe cercetări pentru activitățile naringeninei. Există unele limitări ale acestei cercetări; de exemplu, efectele dependente de doză și dependente de timp ale naringeninei în interacțiunile miARN-ARNm au fost încă neclare. Deși având în vedere miARN-urile analizate in silico capacități de reglementare sugerate, funcțiile lor trebuie să fie certificate în continuare într-un context specific într-un sistem viu. În rezumat, am furnizat cercetări preliminare care analizează expresia ARNm și miARN și profilarea metabolismului. Mecanismul de reglementare al perechilor miARN-ARNm ar putea fi o dovadă posibilă suplimentară pentru adnotarea valorii nutraceutice a naringeninei.

4. Materiale și Metode

4.1. Produse chimice și reactivi

Linia celulară HepaRG a fost achiziționată inițial de la Biopredic International (Rennes, Franța). Mediul RPMI-1640 și soluția de penicilină-streptomicină-glutamină au fost obținute de la Gibco (Gaithersburg, MD, SUA). Serul fetal bovin (FBS) a fost achiziționat de la Corning (Auckland, Noua Zeelandă). Naringenina și dimetilsulfoxidul (DMSO) au fost de la Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, SUA). Reactivul TRIzolTM a fost furnizat de Thermo Fisher (Carlsbad, CA, SUA). Apa ultrapură a fost purificată printr-un sistem de purificare a apei academic Milli-O (Millipore, Bedford, MA, SUA). Toți ceilalți reactivi au fost produse comercializate de cel mai înalt grad analitic disponibil.

4.2. Cultura de celule HepaRG

Celulele HepaRG au fost însămânțate la 5 × 10 * celule/cm- în plăci cu șase godeuri și crescute în mediu RPMI-1640, cultivate cu sau fără naringenină 100 uM timp de 48 de ore și suplimentate cu 10% FBS și 1% antibiotice (100 U/ml penicilină și 100 ug/ml strepto-micină) la 37 de grade într-un incubator umidificat cu 5% CO. CK-1, CK-2, CK-3 și CK{-4 se referă la grupul de control de control; T-1, T-2, T-3 și T-4 se referă la grupul de tratament cu naringenină de 100 μM. Numerele 1, 2, 3 și 4 reprezintă mostre din patru experimente repetate independente.

4.3.Extractia totala a ARN-ului

Celulele HepaRG au fost spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) rece cu gheață și recoltate cu reactiv TRIzolTM așa cum este recomandat de producător. Spectrofotometrele Thermo Scientific NanoDropTM2000 c (Wilmington, DE, SUA) au fost utilizate pentru a măsura calitatea și cantitatea de ARN din fiecare probă conform protocolului producătorului.

4.4.Secvențierea ARN

ARNm a fost îmbogățit cu perle Oligo(dT), apoi ARNm îmbogățit a fost fragmentat și transcris invers în ADNc cu primeri aleatori prin kit-ul de extracție PCR OiaOuick (Qiagen, Venlo, Țările de Jos). Moleculele de ARN într-un interval de dimensiuni de 18-30 nt au fost îmbogățite prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă. Adaptorii 3' și 5' au fost adăugați, apoi ARN-urile îmbogățite au fost transcrise invers prin trusa de extracție QiaQuick PCR, conform instrucțiunilor producătorului (Qiagen, Venlo, Țările de Jos). Produșii de ligatură au fost selectați în funcție de dimensiune prin electroforeză pe gel de agaroză. Au fost patru probe în grupul de naringenină și patru probe în grupul de control. Fiecare probă a generat două biblioteci de ADNc: una pentru mRNA-seq și cealaltă pentru miARN-seg. Produsele amplificate prin PCR au fost îmbogățite pentru a genera, respectiv, 16 biblioteci de ADNc și secvențiate folosind Ⅲlumina HiSeq2500 de Genedenovo Biotechnology Co. (Guangzhou, China). Datele de secvențiere ARN și ARN mic au fost depuse în Arhiva de citire a secvenței NCBI (numerele de acces de la SRR13675952 la SRR13675963).

4.5. qPCR în timp real

Transcripția ARNm în ADNc a fost efectuată cu sistemul de transcripție inversă GoScriptTM (Promega, Madison, WI, SUA) din 3 ug de ARN total, conform instrucțiunilor producătorului. Pentru analiza miARN, sinteza cADN-ului a fost efectuată cu miARN First Strand cDNA Synthesis (Tailing Reaction, Sangon Biotech, Shanghai, China) din 2 ug de ARN total.

cu GoTaq® qPCR Master Mix（Promega, Madison, WI, SUA) pe un LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Germania), conform recomandărilor producătorului. Procedura de ciclizare termică a început cu o denaturare inițială la 95°C timp de 10 minute. Aceasta a fost urmată de 45 de cicluri de denaturare timp de 10 secunde la 95 de grade, legarea primerului timp de 20 de secunde la 60 de grade și alungire timp de 20 de secunde la 72 de grade. Procedura s-a încheiat cu o amplificare finală la 95 grade timp de 5 secunde, 65 grade C timp de 1 minut, adăugarea unei etape de curbă de disociere și o etapă de răcire. Primerii au fost achiziționați de la Sangon Biotech (Shanghai, China). Secvențele de perechi de primeri utilizate pentru validarea semnăturii sunt descrise în Tabelele 3 și 4. Valorile Ct au fost calculate cu referire la -actină sau U6.

4.6.Analiză și Statistică Bioinformatică

DEG-urile și DEM-urile au fost identificate folosind un pachet software bazat pe R. Valoarea prag pentru selectarea DEG și DEM a fost valoarea q (valoarea p ajustată) Mai mică sau egală cu 0.05 și modificarea ori (FC) Mai mare sau egală cu 2 sau mai mică mai mult sau egal cu 0,5. Clasificarea KEGG și GO, inclusiv funcțiile moleculare, procesele biologice și componentele celulare, au fost utilizate pentru a analiza DEG și DEM.

Rezultatele testului biologic sunt prezentate sub formă de medie ± SD pe baza a patru experimente independente în GraphPad Prism 8.

Materiale suplimentare: Următoarele sunt disponibile online la https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1: Tabelul S1, Identificarea a 1037 de ARNm exprimate diferențial ca răspuns la naringenin; Tabelul S2, Identificarea a 234 de miARN exprimate diferențial ca răspuns la naringenină; Tabelul S3, Identificarea a 5607 perechi miARN-ARNm negative ca răspuns la naringenină, cu implicarea a 216 DEM și 681 DEG în total

Referințe

1. Salehi, B.; Fokou, PVT Potențialul terapeutic al naringeninei: o revizuire a studiilor clinice. Farmaceutice 2019, 12, 11. [CrossRef] [PubMed]

2. Bai, Y.; Peng, W.; Yang, C.; Zou, W.; Liu, M.; Wu, H.; Fan, L.; Li, P.; Zeng, X.; Su, W. Farmacocinetica și metabolizarea naringinei și a metabolitului activ naringenin la șobolani, câini, oameni și diferențele dintre specii. Față. Pharmacol. 2020, 11, 364. [CrossRef]

3. Joshi, R.; Kulkarni, YA; Wairkar, S. Aspecte farmacocinetice, farmacodinamice și formulări ale Naringeninei: o actualizare. Life Sci. 2018, 215, 43–56. [CrossRef]

4. Hernández-Aquino, E.; Muriel, P. Efecte benefice ale naringeninei în bolile hepatice: mecanisme moleculare. Lumea J. Gastroenterol. 2018, 24, 1679–1707. [CrossRef]

5. Wang, Q.; Ou, Y.; Hu, G.; Wen, C.; Yue, S.; Chen, C.; Xu, L.; Xie, J.; Dai, H.; Xiao, H.; et al. Naringenina atenuează boala hepatică grasă non-alcoolică prin reglarea în jos a căii NLRP3/NF-kB la șoareci. Br. J. Pharmacol. 2020, 177, 1806–1821. [CrossRef]

6. Khan, TH; Ganaie, MA Naringenin previne toxicitatea indusă de doxorubicină în țesuturile renale prin reglarea insultei oxidative și inflamatorii la șobolanii Wistar. Arc. Physiol. Biochim. 2020, 126, 300–307. [CrossRef]

7. Wang, J.; Ding, Y.; Zhou, W. Albumină lipozomi automodificați pentru terapia fibrozei hepatice prin căi dependente de SPARC. Int. J. Pharm. 2020, 574, 118940. [CrossRef]

8. Kometsi, L.; Govender, K.; Mofo Mato, EP; Hurchund, R.; Owira, PMO Prin reducerea stresului oxidativ, naringenina atenuează suprareglarea indusă de hiperglicemie a proteinei factorului 2 asociat factorului nuclear hepatic eritroid 2-. J. Pharm. Pharmacol. 2020, 72, 1394–1404. [CrossRef] [PubMed]

9. Rossino, MG; Casini, G. Nutraceutice pentru tratamentul retinopatiei diabetice. Nutrienți 2019, 11, 771. [CrossRef] [PubMed]

10. Hernández-Aquino, E.; Quezada-Ramírez, MA; Silva-Olivares, A.; Casas-Grajales, S.; Ramos-Tovar, E.; Flores-Beltrán, RE; Segovia, J.; Shibayama, M.; Muriel, P. Naringenin atenuează progresia fibrozei hepatice prin inactivarea celulelor stelate hepatice și a căilor profibrogene. EURO. J. Pharmacol. 2019, 865, 172730. [CrossRef] [PubMed]