Pielea umană este cel mai mare organ al corpului uman și protejează organismul de toxinele din mediu

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Abstract:Recent, pe măsură ce rolul anti-îmbătrânire al melaninei în piele și inhibarea producției de melanină a fost identificat, dezvoltarea de materiale capabile să mențină homeostazia pielii a atras atenția. În acest studiu, am investigat în continuare efectul anti-melanogenic al extractului de Codonopsis pilosula (CPE) și, sub stres oxidativ, efectul citoprotector în melanocitele Melan-a expuse la H2O2. În primul rând, tratamentul cu CPE a redus semnificativ producția de melanină prin inhibarea proteinelor asociate melanogenezei, inclusiv factorul de transcripție asociat microftalmiei (MITF), tirozinaza și proteina 2 (TRP 2) asociată tirozinazei, ca rezultat al fosforilării MAPK/JNK în Melan. -a celule. În continuare, pentru a investiga efectele protectoare ale CPE asupra leziunilor pielii induse de stresul oxidativ și mecanismul său molecular, am determinat efectul CPE după inducerea stresului oxidativ prin expunerea melanocitelor la H2O2. CPE a protejat celulele de citotoxicitatea indusă de H2O2-prin reducerea expresiei genei care codifică proteina pro-apoptotică Bax, în timp ce a indus genele care codifică familia limfomului cu celule B (Bcl2) și MITF, care este un regulator transcripțional care favorizează diferențierea melanocitelor. În plus, rezultatele noastre arată că CPE a îmbunătățit producția de proteine ​​legate de autofagie, cum ar fi Beclin-1 și lanțul ușor 3 (LC3)Ⅱ; acest lucru a fost în mod substanțial inversat prin pretratamentul cu 3-metil adenină (MA, un inhibitor de autofagie). În mod colectiv, descoperirile noastre demonstrează că tratamentul cu CPE prezintă nu numai un efect anti-melanogenic în melanocitele normale, ci și un efect citoprotector în melanocitele supuse stresului oxidativ prin inducerea autofagiei și a expresiei MITF.dimensiunea penisului cistanche,Prin urmare, credem că CPE este un candidat puternic pentru menținerea celulelor în melanocite.

Cuvinte cheie:Codonopsis pilosula; celule Melan-a; melanogeneza; autofagie; stresul oxidativ

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

1. Introducere

Pielea umană este cel mai mare organ al corpului uman și protejează organismul de toxinele din mediu, alergeni și stresul oxidativ. Melanina, care este produsă în principal de melanocite, este cunoscută că joacă un rol important în prevenirea bolilor de piele și este prezentă în diferite țesuturi ale corpului uman [1,2]. Cu toate acestea, producția și acumularea excesivă de specii reactive de oxigen (ROS) din cauza stresului, radiațiilor ultraviolete (UV) și îmbătrânirii duc la multe tulburări ale pielii, cum ar fi hiperpigmentarea, melasma și, în cele din urmă, degradarea melanocitelor. Mai multe studii privind tratamentul melanogenezei s-au concentrat pe reglarea expresiei factorului de transcripție asociat microftalmiei (MITF) și a activității tirozinazei [3-5]. În plus, studii recente au arătat că melanogeneza pielii este mediată prin mai multe căi de semnalizare melanogenă, inclusiv semnalizarea protein kinază activată de mitogen (MAPK), protein kinaza A(PKA) și calea mediată de adenozin monofosfat ciclic (cAMP) [6].

Cistanche poate anti-imbatranire

Sistemul de autofagie celulară este bine cunoscut ca un proces de autodigestie celulară care degradează proteinele deteriorate sau izolează organele disfuncționale dintr-o celulă și apoi le descompune în lizozomi pentru a menține homeostazia celulară [7,8]. Studii recente au identificat autofagia ca fiind implicată în funcția normală a melanocitelor și în reglarea expresiei factorului de transcripție MITF care formează melanină. Prin urmare, agenții inductori de autofagie au potențialul de a limita daunele cauzate de razele UV și oxidarea lipidelor și de a menține homeostazia în melanocite și keratinocite [9-11].praf de cistanche,Cu toate acestea, există puține informații despre aplicarea preparatelor naturale inductoare de autofagie care protejează melanocitele împotriva stresului oxidativ.

Codonopsis pilosula este rădăcina Codonopsis pilosula (Fr.) Nanny., aparținând familiei Campanula. Este cultivat sau cultivat în munții Gangwon-do, Coreea, și este, de asemenea, distribuit în regiunile de nord și de vest ale Chinei, cum ar fi regiunile Guanxi și Shanxi [12]. În medicina populară, a fost folosit ca înlocuitor pentru ginseng de sute de ani, deoarece are aceleași activități farmacologice, cum ar fi refacerea energiei, întărirea sistemului imunitar, scăderea bolilor gastro-intestinale și reglarea tensiunii arteriale, dar la un preț mai mic. Cercetările fitochimice arată că C. pilosula conține cantități mari de zaharoză, polizaharide, triterpene, saponine, fitosteroli, glicozide fenolice, alcaloizi și poliacetilene [13]. Printre acestea, se știe că lobetiolina, principala acetilenă a C. pilosula, activează NF-kB și are un efect de stimulare a imunității [14]În plus, conform studiilor recente privind efectul extractului de C. pilosula, un extract etanolic de C. pilosula inhibă semnificativ reacțiile alergice cauzate de ovalbumină, în timp ce un extract de apă scade nivelul glucozei plasmatice, iar un extract de butanol prezintă activitate de captare a radicalilor liberi și un efect inhibitor asupra peroxidării lipidelor în omogenatul creierului de șobolan[15-17] .

Anterior, sa constatat că activitatea antioxidantă a C.pildsula variază din cauza diferențelor de conținut de polifenoli în funcție de solventul de extracție utilizat [18]. Astfel, am investigat efectul inhibitor melanogen al extractului de C. pilosula (CPE) în condiții normale prin căi de semnalizare mecanică, precum și efectul citoprotector împotriva stresului oxidativ indus de H2O2-în melanocitele Melan-a.

2. Materiale și metode

2.1.Reactivi

RPMI 1640 și ser fetal bovin (FBS) au fost achiziționate de la Welgene (Daegu, Coreea).extract de salsa cistanchePenicilina-streptomicina a fost achiziționată de la GibcoBRL (Eggenstein, Germania). 12-miristat 13-acetat (TPA) de forbol a fost achiziționat de la TOCRIS (Bristol, Marea Britanie). Peroxid de hidrogen (HaO2),3-(4,5-dimetiltiazol{{7} }il)-2,5-bromură de difeniltetrazoliu (MTT), 4',6-diamidino{-2-fenilindol (DAPI) și 3-MA au fost achiziționate de la Sigma -Aldrich (St Louis, MO, SUA). Toate celelalte substanțe chimice și reactivi au fost de calitate analitică.

2.2.Prepararea extractului de Codonopsis Pilosula

Rădăcina de C.pilosula (CP) a fost pur și simplu tocată și 100 g de CP au fost scufundate în 1 Lof 50% etanol (g/v); apoi, a fost extras de trei ori folosind unde ultrasonice la 30 de grade. După ce fiecare extract a fost centrifugat pentru a colecta supernatantul, supernatantul a fost concentrat şi liofilizat pentru a prepara extractul de C.pilosula (CPE).

2.3. Cultura celulară și prepararea stocului de CPE

Celulele melanocite Melan-a au fost crescute și menținute în RPMI 1640 suplimentat cu 10% FBS, penicilină (100 U/ml), streptomicina (100 U/ml) și 200 nM forbol 12-miristat 13- acetat (TPA) și menținut la 37 de grade într-un incubator cu 5% CO2. După cultivarea a 3 x 105 celule per godeu într-o placă cu șase godeuri, celulele Melan-a au fost plasate într-un incubator timp de 48 de ore până când culoarea mediului s-a schimbat în negru. Soluțiile stoc (100 mg/mL) de CPE au fost dizolvate în apă sterilă și depozitate la grade -20 .

2.4.Măsurarea viabilității celulare

Viabilitatea celulară a CPE în celulele Melan-a a fost determinată utilizând un test colorimetric MT și citometrie în flux. Celulele au fost menținute până când au atins o confluență de 80 procente în plăci de 96-godeuri și apoi au fost tratate cu CPE și/sau 0,5 mMH2O2 timp de 24 de ore. S-a adăugat un mediu celular cu 10 μL de soluție MTT (5 mg/mL) și celulele au fost incubate pentru încă 4 ore. După incubarea celulelor, cristalele de formazan insolubile au fost dizolvate în 100 uL de dimetil sulfoxid. Absorbanța la 540 nm a fost măsurată prin spectrofotometrie folosind un cititor de microplăci. Celulele moarte au fost determinate cu un kit de detectare a morții celulelor PI/Annexin V (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, SUA) conform protocolului producătorului. Pe scurt, celulele au fost spălate și incubate timp de 15 minute la RT în întuneric, care conține FITC-Anexin V și PI. Ulterior, celulele moarte au fost analizate de analizorul de celule MuselM.

2.5. Estimarea Melaninei In Vitro

Aproximativ 2×105 celule/godeu au fost crescute într-o placă cu șase godeuri. După tratamentul cu CPE și/sau 0,5 mM H-Op așa cum s-a descris anterior [19], celulele spălate cu PBS au fost recoltate, lizate în 1× PBS care conține 1 procente Triton X-100 și centrifugate la 4 grade la 13, 000 rpm timp de 15 min. Conținutul de melanină celulară a fost solubilizat folosind NaOH 1 N. Un cititor de plăci ELISA a fost utilizat pentru a cuantifica melanina prin măsurarea absorbanței la 405 nm. Datele au fost obținute din trei experimente, iar conținutul de melanină a fost calculat și notat ca schimbarea pliului în comparație cu celulele de control. 2.6.Izolarea proteinelor și testarea Western Blot

Probele de proteine ​​au fost extrase așa cum sa explicat în munca noastră anterioară [20]. Apoi, concentrația de proteină a lizatului celular a fost măsurată folosind un kit de analiză a proteinei BCA (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA). Cantități echivalente de lizat de celule denaturate (30 ug de lizat de celule per probă) au fost separate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă 10% (SDS-PAGE) și transferate pe o membrană de nitroceluloză. Membrana a fost incubată cu anticorpul primar diluat în lapte praf degresat 5% în PBS conţinând 0,05% Tween 20(PBST) peste noapte la 4 grade.

După incubarea anticorpului primar, membranele au fost spălate și incubate în anticorpul secundar conjugat cu HRP diluat în lapte degresat 5% în PBST timp de 1 oră la temperatura camerei. Expresia proteinei a fost analizată utilizând un sistem de detecție cu chemiluminiscență îmbunătățită (ECL) (AI680, GE Healthcare, Uppsala, Suedia).

2.7.Estimarea ROS intracelular prin colorare DCFH-DA

Nivelurile celulare de ROS în celulele Melan-a tratate cu Hoo au fost estimate prin metoda de microscopie cu fluorescență DCFH-DA [21]. Nivelurile de fluorescență intracelulară DCF sunt proporționale cu ROS intracelular produs. Mai întâi, 2 × 105 celule/godeu au fost tratate cu concentrații individuale de CPE și/sau H-O2 timp de 24 de ore, apoi DCFH2-DA a fost adăugat cu 2 ore înainte de sfârșitul reacției. Datele au fost colectate din trei sau mai multe experimente independente. 2.8.Prelucrarea statistică

Toate rezultatele experimentale sunt prezentate ca medii ± abateri standard (SD) a trei replici biologice.cistanche stemSemnificația statistică dintre valorile medii multiple a fost evaluată prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de testul de comparație multiplă al lui Duncan, folosind SPSS 18.0(SPSS Inc., Chicago, IL, SUA), asa cum este indicat in legende. O valoare p<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

3. Rezultate

3.1.Reglarea în jos a Melanogenezei în Melanocite prin CPE

Melanocitele sintetizează melanina ca răspuns la stimuli externi, cum ar fi iradierea UV. Factorii majori, cum ar fi hormonul de stimulare a melanocitelor (-MSH), factorul de celule stem (SCF) și endotelina-1(ET{{-1) sunt secretați de melanocite și cresc expresia MITF, promovând astfel melanogeneza [22,23]. În primul rând, am examinat dacă tratamentul cu CPE a inhibat producția de melanină și proteinele legate de melanogeneză.

Tratamentul CPE la 100.200 și 300 ug/mL a redus semnificativ producția de melanină în comparație cu controlul negativ. În special, tratamentul cu 300 ug/mL de CPE a dus la o reducere similară cu cea indusă de tratamentul cu arbutină (Figura 1A, B). În plus, am investigat proteinele tirozinazei melanogenezei, TRP-1, TRP{{6 }} și MITF prin Western blot.Cistanche tubulosa beneficii și efecte secundareTratamentul cu CPE la concentrații de 300 ug/mL a scăzut semnificativ nivelurile proteinelor MITF, TRP-2 și tirozinazei (Figura 1C). Deoarece s-a confirmat că CPE inhibă expresia proteinelor legate de MITF, inhibând formarea melaninei, am examinat în continuare dacă CPE a afectat calea de semnalizare MAPK. CPE a crescut fosforilarea MAPK într-o manieră dependentă de doză, inducând în mod specific fosforilarea JNK (Figura 1D). Aceste rezultate sugerează că inhibarea melanogenezei de către CPE rezultă din diminuarea exprimării MITF și tirozinazei prin inducerea fosforilării JNK/MAPK.

3.2. Efectul CPE asupra morții celulare induse de H2O2- în melanocite

Celulele pielii, cum ar fi keratinocitele și melanocitele, reacționează sensibil la ROS, cum ar fi peroxidul de hidrogen (HzOz) și anionul superoxid, pentru a menține o stare normală. Cu toate acestea, un dezechilibru în starea oxidant-antioxidant din cauza ROS celulare excesive poate duce la acumularea de proteine ​​sau organele deteriorate, ducând în cele din urmă la moartea celulelor apoptotice [24,25]. Recent, s-a raportat că melanina promovează îmbătrânirea pielii prin stimularea formării melaninei în funcție de mediul extern al pielii, precum și sănătatea pielii fiind menținută prin păstrarea conținutului intracelular de melanină [26]. Astfel, am investigat efectul extractului CPE asupra celulelor supuse stresului oxidativ prin tratamentul cu H2O2. Celulele tratate cu HzO2-au arătat o scădere a viabilității celulare cu 32,8% în comparație cu celulele netratate. Cu toate acestea, tratamentul cu CPE a redus inhibarea viabilității celulare într-o manieră dependentă de concentrație sub tratamentul cu H-O2. În special, CPE la 300 ug/mL a restabilit viabilitatea celulară la 91,9 la sută (Figura 2A). În plus, moartea apoptotică a celulelor tratate cu CPE și/sau H2O2-a fost detectată prin colorare dublă cu anexină V- FITC/PI, urmată de analiză citometrică în flux. După tratamentul cu H2O2, procentul de celule apoptotice a crescut la 34,5%, comparativ cu 14,8% în celulele netratate. Cu toate acestea, tratamentul cu CPE a inhibat semnificativ moartea apoptotică indusă de H2O2-, procentul de celule colorate cu anexină V fiind de 22,2 la sută (Figura 2B). Deoarece acesta arată același model ca și conținutul de ROS, aceste rezultate arată că CPE menține viabilitatea celulei prin inhibarea morții celulare prin protejarea împotriva ROS indus de H2O2- (Figura 2C).

3.3. Efectul CPE asupra morții celulare induse de HzO2- în melanocite

După cum sa confirmat anterior, CPE menține viabilitatea celulelor prin inhibarea creșterii apoptozei după tratamentul cu HzO2. Astfel, am investigat apoi efectul CPE asupra expresiei proteinelor implicate în moartea celulelor și a proteinei MITF, care reglează producția de melanină în prezența H2O2. După cum se arată în Figura 3, în celulele tratate cu H2O2, expresia MITF a fost ușor redusă, pe de altă parte, în celulele tratate cu CPE, iar expresia MITF a fost aproape aceeași ca și în celulele netratate. În plus, H2O2 a crescut expresia proteinei Bax care induce apoptoza [27, 28], dar a scăzut expresia Bax într-o manieră dependentă de concentrație în celulele tratate cu CPE. Prin contrast, H202 a scăzut expresia proteinei Bcl2, care promovează supraviețuirea celulară [28,29], dar expresia Bel2 a fost crescută prin tratamentul CPE într-o manieră dependentă de concentrație. Când am calculat expresia acestor două proteine ​​pentru a determina raportul Bax/Bcl2, a fost observată aceeași tendință. Prin urmare, sub stresul oxidativ indus de H2O2-, expresia MITF a fost redusă prin inducerea morții celulare, în timp ce CPE a prezentat un efect protector puternic, prevenind moartea celulară indusă de H2Oz și menținând expresia MITF.

3.4. Efectul CPE asupra activării autofagiei în melanocite induse de stres oxidativ

Studii recente au arătat că autofagia și regulatorul său joacă un rol crucial în răspunsul antioxidant împotriva stresului oxidativ indus de ROS în celulele umane [26,30]. Feng și colab.[31] a arătat că extractul de frunze de Apocymum venetum protejează neuronii răniți împotriva apoptozei induse de H2O2-prin reducerea activării autofagiei indusă de ROS. Deoarece a fost stabilită asocierea dintre modularea autofagiei și anti-melanogeneză, rolul autofagiei în efectul protector al CPE împotriva stresului oxidativ indus de H-Oz a fost investigat în celulele Melan-a. Nivelurile de LC3, o proteină autofagozomă, au fost utilizate ca indicator al autofagiei. Datele Western blot au indicat că CPE a crescut semnificativ expresia proteinelor pro-autofagice LC3-Ⅱ și Beclin, a căror expresie a fost scăzută prin tratamentul cu H2O2. Acest lucru sugerează că CPE are un efect citoprotector prin stresul oxidativ intracelular în ordinea activării autofagiei (Figura 4A). În continuare, relația dintre efectul citoprotector și autofagia CPE în celulele Melan-a tratate cu HzOz a fost analizată în continuare folosind un inhibitor autofagic puternic,3-MA. În comparație cu datele anterioare, celulele pretratate cu 3-MA și CPE și stimulate cu H2O2 au prezentat niveluri scăzute de expresie LC{3-II (Figura 4B). În general, aceste date implică faptul că inhibarea autofagiei afectează negativ eficacitatea citoprotectoare a CPE în celulele tratate cu HzO2-, indicând faptul că autofagia este esențială pentru efectele citoprotectoare ale CPE.

4. Discutie

Am stabilit anterior metoda optimă de extracție, rezultând cea mai mare activitate antioxidantă, precum și conținut de polifenoli [18]. În acest studiu, am aplicat metoda de extracție cu ultrasunete cu randament ridicat și am constatat că extractul prezintă un efect citoprotector prin activarea autofagiei în condiții de stres oxidativ, precum și prin inhibarea melanogenezei în celulele Melan-a.

În primul rând, am investigat în continuare efectul anti-melanogenic al CPE.CPE a redus melanogeneza prin scăderea expresiei genelor legate de melanogeneză, cum ar fi MITF, tirozinaza și TRP-2. Mai multe studii au demonstrat că mecanismele de biosinteză ale melanogenezei legate de expresia enzimelor sunt mediate de diferite căi de semnalizare, inclusiv protein kinaza activată de mitogen (MAPK), protein kinaza A (PKA) și PI3K/Akt [32]. Printre acestea, activarea căii de semnalizare MAPK a reprimat MITF la nivelul stabilității proteinei, precum și la nivel transcripțional, în melanocitele primare umane [33,34]. Fosforilarea MAPK și cascadele de semnalizare ale kinazei cu răspuns extracelular (ERK), kinazei N-terminale c-Jun (JNK) și p38 reglează, de asemenea, producția de melanină. Printre acestea, activatorul JNK suprimă melanogeneza prin fosfo-inhibarea expresiei MITF dependente de coactivatorul de transcripție 3(CRTC3) reglat de CREB [35,36]. Rezultatele noastre arată că fosforilarea MAPK, în special JNK, crește în mod eficient după tratamentul CPE în comparație cu celulele de control. Aceste descoperiri sugerează că depigmentarea indusă de CPE în melanocitele Melan-a poate apărea prin căile de semnalizare reglate de MITF/JNK.

Melanocitele produc pigmentul de melanină și îl transferă pe keratinocite, unde pigmenții ajută la protejarea pielii de factorii de stres oxidativ din mediu, cum ar fi poluanții atmosferici, produsele chimice și daunele UV [37-39]. MITF este unul dintre principalii regulatori transcripționali responsabili pentru genele cheie care promovează dezvoltarea și diferențierea melanocitelor, precum și reglează melanogeneza. Mai mult, MITF reglează expresia anumitor gene care mențin homeostazia celulară, inclusiv cele care codifică proteinele implicate în proliferare (de exemplu, CDK2) și apoptoză (de exemplu, Bcl2)[40-42]. Stein-Grimson și colab.[43] au identificat șoarecii mutanți MITF ca fiind afectați de pierderea auzului și de tulburări pigmentare ca urmare a pierderii melanocitelor, precum și a osteoclastelor și mastocitelor defecte. Acest lucru sugerează că MITF joacă un rol important în dezvoltarea acestor tipuri de celule.

CPE este un derivat al medicamentelor din plante utilizate pentru tratarea bolilor gastrointestinale și alergice datorită efectelor sale anti-îmbătrânire și antialergice[15,44]. Cu toate acestea, dacă CPE poate proteja melanocitele de stresul oxidativ rămâne necunoscut. Pentru a estima efectul CPE asupra supraviețuirii melanocitelor ca răspuns la stresul oxidativ, am observat mai întâi moartea celulară în melanocitele expuse la H-O2. După tratamentul cu 0,5 mM H-O2 timp de 24 de ore, viabilitatea celulară a fost scăzută în comparație cu cea a celulelor netratate. Cu toate acestea, viabilitatea celulelor tratate cu CPE a fost restabilită prin reducerea conținutului de ROS; apoi raportul Bax/Bcl2 și expresia MITF au fost crescute, spre deosebire de celulele tratate cu H2O2-.

Autofagia este sistemul major de degradare intracelulară prin care deteriorarea lizozomilor are ca rezultat degradarea lor. Mizushima și colab. [45] au demonstrat că, în condiții de înfometare, inflamație sau stres oxidativ, procesul autofagic poate regla degradarea proteinelor și organelelor deteriorate din celule, astfel încât să se poată realiza renovarea celulară și homeostazia. Proteina asociată microtubulilor 1, lanțul ușor 3 (LC3) și Beclin-1 joacă roluri majore în autofagia mamiferelor. LC3 există în două forme, și anume, o formă citosolică (LC3 I) și o formă conjugată cu lipide fosfatidiletanolamină (LC3 III) care este inserată atât în ​​membranele interioare, cât și în cele exterioare ale autofagozomului în creștere[46,47]Zhang și colab.[46,47] 48] a folosit conversia LC3I la LC3II ca marker biochimic pentru a analiza starea autofagiei în melanocite. Cercetările ulterioare au indicat că LC3 este un marker al formării finale a autofagozomului, în timp ce Beclin-l este implicat în etapa inițială de formare a autofagozomului, activând autofagia [49]. Activitatea autofagică constitutivă joacă un rol cheie în prevenirea daunelor oxidative în melanocite, dar au existat puține studii asupra mecanismelor moleculare care reglează autofagia în melanocite sub stres oxidativ.

În consecință, am investigat implicația autofagiei mediate de CPE pentru supraviețuirea celulară în melanocitele supuse stresului oxidativ. Rezultatele noastre arată că, după tratamentul CPE, autofagia a fost activată prin exprimarea crescută a Beclin-1 și conversia indusă a LC3I la LC3 II. Acest lucru sugerează că CPE exercită un efect citoprotector prin activarea autofagiei în melanocitele supuse stresului oxidativ.

În concluzie, prezentul studiu a demonstrat că tratamentul cu CPE nu numai că are un efect anti-melanogenic prin calea MITF/JNK în melanocitele normale, ci și, în condiții de stres oxidativ indus de HzOg, a menținut supraviețuirea celulară și a exercitat citoprotecție prin MITF, rezultând o activare susținută. de autofagie în celulele Melan-a.

Acest articol este extras din Cosmetics 2021, 8, 67. https://doi.org/10.3390/cosmetics8030067 https://www.mdpi.com/journal/cosmetics