Calea spre progres Studiile preclinice ale bolilor neurodegenerative legate de vârstă: o perspectivă asupra modelelor de rozătoare și derivate din HiPSC Partea 2

În plus față de modelele transgenice dezvoltate de laboratoarele academice individuale, National Institutes of Health (NIH) conduce în prezent Proiectul de descoperire și validare preclinică a țintelor Parteneriatului de Accelerare a Medicamentului-AD (AMP-AD), care este un consorțiu de granturi multi-instituționale și multidisciplinare. care, în mod colectiv, intenționează să accelereze conductele de descoperire a medicamentelor pentru AD (https://www.nia.nih.gov/research/dn/amp-ad-target-discovery-and-preclinicalvalidation-project).

Odată cu dezvoltarea rapidă a biotehnologiei, tehnologia transgenică a fost aplicată treptat în domeniul biologic. Tehnologia transgenică este o tehnologie de inginerie genetică care introduce gene străine în organisme pentru a le face să prezinte caracteristici specifice. Cu toate acestea, a existat controverse cu privire la relația dintre modelele transgenice și memorie.

Unii cercetători cred că modelele transgenice pot avea un efect pozitiv asupra memoriei. De exemplu, unele experimente pe animale transgenice au arătat că prin modificarea anumitor gene, capacitatea de învățare și memoria animalelor pot fi îmbunătățite. Aceste rezultate experimentale arată că tehnologia transgenică poate îmbunătăți capacitatea cognitivă umană.

Deși aceste rezultate ale cercetării sunt foarte interesante, trebuie să fim, de asemenea, precauți, deoarece rezultatele după aceste procese experimentale nu sunt rezultatul promovării umane sau al aplicării în grabă. Trebuie să efectuăm mai multe cercetări asupra acestei tehnologii pentru a înțelege riscurile sale potențiale pentru mediu și oameni și pentru a măsura posibilul impact social al acesteia. În același timp, trebuie să recunoaștem și că îmbunătățirea memoriei nu se bazează doar pe gene, ci și pe sănătatea fizică, iar obiceiurile de viață sănătoase pot atinge o stare bună de memorie prin canale normale.

Pe scurt, ar trebui să așteptăm cu nerăbdare aspectele pozitive ale tehnologiei transgenice și să o reglementăm și să o evaluăm în mod corespunzător. Prin utilizarea rațională a tehnologiei transgenice, ne putem schimba genomul, ceea ce ne va ajuta să rezolvăm unele probleme medicale și de mediu, promovând în același timp progresul uman în multe domenii, inclusiv îmbunătățirea memoriei. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece are efecte antioxidante, antiinflamatorii și anti-îmbătrânire, care pot ajuta la reducerea oxidarii și a reacțiilor inflamatorii din creier, protejând astfel sănătatea sistemul nervos. În plus, Cistanche poate promova, de asemenea, creșterea și repararea celulelor nervoase, sporind astfel conectivitatea și funcția rețelelor neuronale. Aceste efecte pot ajuta la îmbunătățirea memoriei, a capacității de învățare și a vitezei de gândire și pot preveni, de asemenea, apariția disfuncțiilor cognitive și a bolilor neurodegenerative.

Faceți clic pe cunoașteți modalități de îmbunătățire a funcției creierului

Deosebit de relevantă pentru această revizuire este componenta AMP-AD, numită inițiativa Model Organism Development and Evaluationfor LOAD (MODEL-AD). MODEL-AD își propune să genereze noi linii de șoareci transgenici care modelează cu exactitate fenotipurile AD și servesc ca o platformă îmbunătățită pentru conducta de dezvoltare a medicamentelor și modele mai translatable și relevante din punct de vedere biologic pentru validarea preclinică DMT.

Inițiativa MODEL-AD este compusă din Centrul de la Școala de Medicină a Universității din Indiana, Laboratorul Jackson, Sage Bionetworks, Școala de Medicină a Universității din Pittsburgh și un centru de la Universitatea din California Irvine.

Împreună, acest consorțiu intenționează să stabilească următoarea generație de modele AD in vivo bazate pe date umane într-un mod riguros și extrem de controlat. Procedând astfel, își propune să alinieze caracteristicile fiziopatologice ale modelelor AD cu stadiile corespunzătoare ale bolii clinice, utilizând biomarkeri translatabili ca mijloc de creștere a traductibilității constatărilor preclinice.57

Până în prezent, au fost generate 54 de modele de șoareci AD, inclusiv șoareci FAD, APOE, APP, MAPT/tau, precum și modele LOAD bazate pe acumularea de Ab și alte variante legate de LOAD identificate anterior (https://www.model-ad.org /strain-table/), care sunt disponibile prin intermediul JAX/IU/Pitt AD Precision ModelsCenter.

Modele chimice-toxine ale AD

În plus față de modelele transgenice mai recente, modelele de rozătoare AD s-au bazat istoric pe expunerea la compuși toxici care provoacă neurodegenerare selectivă care duce la tulburări cognitive și comportamentale similare cu cele observate la pacienții cu AD.

În timp ce o varietate de modele de expunere la toxine au fost folosite în studiul atât al AD, cât și al PD, modelele AD au fost în mare parte înlocuite cu modelele transgenice mai recente discutate mai sus.

Modele chimice ale ADinduce patologie asemănătoare AD, utilizând fie compuși care perturbă selectiv și reversibil activitatea neuronilor colinergici, fie toxine care perturbă permanent procesele de homeostazie celulară care duc la moartea celulelor, cum ar fi acidul okadaic și diferite clase de metale grele 58 (Tabelul 2). Deși aceste modele produc unele deficite neurologice și comportamentale care seamănă cu simptomele AD, inclusiv tulburările de învățare și memorie, le lipsesc în mare parte leziuni patologice AD ​​(adică plăcile Ab și NFT).

Modelele animale care se concentrează în mod explicit pe perturbarea neuronilor colinergici se bazează pe ipoteza colinergică acum oarecum datată a AD.59 În astfel de modele, antagoniştii receptorilor muscarinici, de exemplu, compusul scopolamină, sunt eliberaţi în regiunile ţintite ale creierului, cum ar fi HP, pentru a bloca. activitatea endogenă a acetilcolinei și induc tulburări cognitive în învățare și memorie.60

Alte modele de intervenție chimică ale AD implică administrarea locală sau periferică de neurotoxine care duc la moartea nespecifică a celulelor neuronale61–64 (Tabelul 2).

Modele transgenice de PD

Așa cum este cazul AD, modelele de șoarece transgenic de PD permit studiul caracteristicilor clinice ale bolii induse prin manipularea locilor genetici asociate cu formele mendeliane ale bolii, iar sute de linii unice sunt acum disponibile comercial pentru cumpărare.

La fel ca AD, majoritatea cazurilor clinice de PD sunt clasificate ca fiind sporadice, formele ereditare ale bolii reprezentând mai puțin de 1% din toate cazurile.89 Alterările genetice ale genelor SNCA, LRRK2 și UCH-L1 sunt legate de forme autosomal-dominante de PD, în timp ce alternanțele genelor PRKN, PINK1 și DJ-1 sunt asociate cu formele autozomal-recesive90 (Tabelul 1).

Cele două gene vizate cel mai frecvent în modelele PD transgenice sunt SNCA și LRRK2.91,92 Mutațiile acestor gene cauzează PD familială și au fost, de asemenea, asociate cu forma sporadică a PD prin GWAS.93.

În plus, rolul supraexprimării SNCA în PD familială (cazuri de tri/duplicare) și sporadic a fost bine stabilit.94

Până în prezent, majoritatea modelelor transgenice care manipulează SNCA nu numai că introduc mutațiile familiale missense, dar folosesc și o strategie de supraexpresie prin inserarea mai multor copii ale genei SNCA umane sau de șoarece pentru a imita producția de a-sinucleină (a-syn), fie singură, fie în combinație, cu un mutație familială missens.95–97

O mutație greșit în LRRK2 este cea mai frecvent raportată mutație asociată cu PD familială,98 și mai multe linii de șoarece transgenice au fost generate pe baza unei varietăți de mutații LRRK2 cunoscute.

Mutația GS2019S, de exemplu, are ca rezultat o mutație de creștere a funcției cu activitate kinazei îmbunătățită.99 Alte modele, cum ar fi mutațiile R1441C/G, T1348N și A2016T, raportează modificări în expresia sau agregarea ina-syn și, în unele cazuri, deficiențe motor nominale; cu toate acestea, deficitele precise și caracteristicile clinice variază substanțial între modele.89,92,100

În plus față de genele SNCA și LRRK2, au fost generate mai multe alte linii transgenice în care sunt vizate alte gene asociate PD (Tabelul 1). Întrucât multe dintre aceste modele modifică cu succes expresia și agregarea a-syn, cele mai multe prezintă puțină sau deloc neurodegenerare și, în consecință, funcțiile motorii rămân relativ nedeteriorate92 (Tabelul 1).

Analiza atentă a agregatelor a-syn produse în multe dintre aceste linii transgenice a dezvăluit în continuare că incluziunile formate nu seamănă cu corpurile Lewy (LB) care se găsesc în mod natural observați în creierul PD post-mortem, ci, în schimb, prezintă o compoziție structurală unică.101

Eșecul modelelor transgenice de a reproduce atât aspectele moleculare, cât și cele neurodegenerative ale PD se datorează probabil unei combinații de mai mulți factori. Principala dintre aceste preocupări este că natura și amploarea implicării genelor legate de familia și forma mai comună a bolii rămâne neclară, punând sub semnul întrebării relevanța modelelor bazate pe manipularea acestor gene pentru marea majoritate a cazurilor de PD.

O altă limitare este că modelele transgenice au ca rezultat supraexprimarea transgenei care nu imită nivelurile fiziologice și, prin urmare, pot introduce artefacte. Mai mult, forma sporadică a bolii implică probabil modificări ale mai multor gene, susceptibilitatea fiind influențată în continuare de componentele de mediu, sugerând că modelele transgenice monogenice pot avea o utilitate limitată.

În general, multe dintre aceleași probleme care afectează modelele transgenice AD ​​sunt valabile pentru modelele de PD: există o lipsă actuală de înțelegere a rolului precis al genelor legate de familial în etiologia PD și măsura în care acestea contribuie la formele sporadice ale bolii.

Aceste probleme au făcut extrem de dificilă producerea modelului de PD atransgenic, care reproduce fidel acumularea a-syn și formarea LB, la rândul său, conducând la un model de neurodegenerare și tulburări de comportament care se potrivesc cu cele observate în populațiile clinice.

Modelele transgenice actuale recapitulează doar unele dintre aceste caracteristici și, prin urmare, s-au dovedit că au o validitate predictivă mică pentru evaluarea eficacității potențialelor DMT. În schimb, modelele chimice-toxine ale PD sunt încă utilizate pe scară largă datorită capacității lor de a reproduce fidel caracteristica selectivă de neurodegenerare DA a PD.

Modele chimice-toxine ale PD

În ultima jumătate de secol, o mare varietate de compuși toxici au fost folosiți pentru a modela modelul de neurodegenerare observat în PD. Dintre acestea, patru modele de leziuni chimice au aparut ca fiind cele mai utilizate pe scara larga pentru cercetarea preclinica, iar efectele lor au fost pe larg caracterizate.

Acestea includ 6-hidroxidopamina (6-OHDA), un analog al catecolaminei; 1-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahidropiridină (MPTP), un analog opioid sintetic; rotenonă, un pesticid; și paraquat, un erbicid102 (Tabelul 2). Un alt model de PD netransgenic se bazează pe injectarea de fibrile preformate (PFF; proteine ​​monomerice recombinate a-syn convertite în formă de agregat fibrilar) în creierul animalelor, ceea ce declanșează hiperfosforilarea proteinelor endogene a-sin și provoacă o patologie asemănătoare LB în SN. pars compacta (SNpc)87,88 (Tabelul 2).

Aceste modele bazate pe toxine pot induce, cu grade diferite, agregarea a-syn și neurodegenerarea selectivă a neuronilor DA în calea nigrostriatală, un dezavantaj notabil al omologilor lor transgenici de model.

Căile implicate în declanșarea morții celulare și amploarea pierderii neuronului DA variază substanțial între modele, care au fost revizuite în detaliu în altă parte.103 În cele din urmă, rezultatul pierderii celulelor DA în PD este că nucleii motori ai striatului nu mai pot fi menținute. funcția fiziologică normală, provocând o gamă largă de abilități motorii afectate.

Cu toate acestea, pierderea neuronilor DA nigrostriatali nu este, în sine, nu un model de PD în sine, ci mimează un parkinsonism mai general, caracterizat printr-un spectru mai larg de simptome motorii.104

Până în acest punct, în timp ce unele modele bazate pe toxine, inclusiv PFF, MPTP cronic și administrarea de rotenonă, pot induce agregate a-syn și formare asemănătoare LB, ele sunt distincte de incluziunile LB caracteristice în PD și de distribuția globală a acestor agregate. nu reflectă modelul observat în PDbrains.102

Aceste modele sunt, de asemenea, limitate în capacitatea lor de a modela natura progresivă a PD și răspândirea patologiei în alte regiuni ale creierului, deoarece pacienții cu PD suferă, de asemenea, neurodegenerare în regiunile subcorticale și, eventual, corticale în stadiile ulterioare ale bolii.105

În rezumat, modelele bazate pe expunerea la toxine demonstrează unele asemănări cu patologiile observate în PD; cu toate acestea, mecanismul morții celulare indus de toxine este probabil diferit de cel care stau la baza pierderii neuronale în PD. ani.

Aceste limitări sugerează că modelele bazate pe expunerea la toxină care vizează inducerea morții selective a neuronilor DA în calea nigrostriatală prezintă o imagine incompletă a PD și oferă o explicație a motivului pentru care eforturile de identificare a DMT în astfel de modele nu au reușit să fie eficiente în studiile clinice.12

Modele de vectori virali pentru PD și ADAvantajele sistemelor de vectori virali

Sistemele de livrare a vectorilor virali oferă mai multe avantaje care sunt greu de realizat cu alte abordări.108 În primul rând, sistemele de vectori virali oferă un control robust asupra expresiei temporale a genei de interes.

În al doilea rând, îmbătrânirea este principalul factor de risc al tulburărilor din spectrul AD-PD, iar posibilitatea de a elibera vectorul în orice moment al duratei de viață a animalului reprezintă un avantaj major pentru proiectarea studiului. În al treilea rând, vectorii virali susțin livrarea și exprimarea transgenelor locale, permițând astfel țintirea precisă și specifică a regiunilor de interes ale creierului.

În al patrulea rând, manipulările precise ale dozelor pot fi realizate cu ușurință cu ajutorul vectorilor virali. În al cincilea rând, modelul de interes poate fi creat în mai multe specii de animale, de la rozătoare mici până la primate mari non-umane.

În al șaselea rând, pot fi făcute cu ușurință diferite variații ale genelor pentru a obține un fenotip de interes. În al șaptelea rând, versatilitatea și flexibilitatea diferitelor platforme de vectori utilizate pentru transferul de gene mediate de virusuri în sistemul nervos central sunt vaste.

Sistemele virale, inclusiv vectorii recombinanți adeno-asociați (UAV) și vectorii lentivirali (LV), susțin eficient și robust exprimarea genelor pe termen scurt sau pe termen lung, atât la nivel local, cât și la nivel global. În sfârșit, sistemele bazate pe vectori virali sunt semnificativ mai economice. , atât în ​​ceea ce privește efortul, cât și costurile, în raport cu alte modele de boală.

Modele vectoriale virale AD și PD: AAV și LV

Abordarea vectorului viral pentru modelul de fenotipuri AD și PD in vivo a fost utilizată de mai multe grupuri diferite folosind fie rAAV, fie LV. De la prima lor utilizare la începutul mileniului, o varietate de modele virale au fost dezvoltate și utilizate pentru AD.

Modelele inițiale de AAV-tauopatie au exploatat AAV2/2 pentru a exprima proteina umantau P301L în creierul șoarecilor și șobolanilor. timp de cel puțin 8 luni post-transducție. În mod semnificativ, agregatele tauand hiperfosforilate asemănătoare NFT au fost găsite la 3 până la 4 săptămâni după transducție.110,111

Aceste studii au oferit prima dovadă a conceptului că injecția de AAV-P301L tau ar putea duce la expresia persistentă a proteinei și agregarea acesteia la șoareci și șobolani.

În mod constant, injectarea de AAV-tip sălbatic (WT) sau APP triplu-mutant a dus la formarea plăcilor Ab, dar nu a neurodegenerarii vizibile. Aceste constatări sunt în contrast cu observațiile de mai sus conform cărora AAV-WTtau sau AAV-P301L tau a fost capabil să provoace neurodegenerare semnificativă a neuronilor piramidali HP.112

În experimente mai recente, AAV2/5 a fost utilizat pentru a furniza WT tau și vectorul de control GFP în HP dorsală a șobolanilor Fischer 344 în vârstă.113 Ambele viruși au fost exprimați robust în neuronii HP și au condus la o structură axonală aberantă, la generarea axonală și la fragmentarea tau în Axonii HP comparați cu axonii care exprimă GFP de control care păreau normali.

Într-un alt model, tau P301L exprimat din promotorul sinapsinei I umane a fost livrat de vectorul AAV2/9 în cortexul entorinal lateral, ceea ce a permis autorilor să detecteze forme multiple de variante tau fosforilate și agregate înainte de pierderea sinapselor căii perforante și neurodegenerarea.114.

Aceste date susțin utilitatea abordărilor bazate pe AAV în AD, în special în modelarea modificărilor patologice timpurii, cum ar fi degenerarea și degradarea axonală. Mai multe studii au folosit modele bazate pe virusuri menite să inducă alte aspecte patologice ale LOAD.115,116 De exemplu, AAV-BRI-Ab42 și Vectorii AAV-BRI-Ab40 au fost utilizați pentru exprimarea și secreția controlată a peptidelor Ab la rozătoarele HP.116

În special, animalele injectate cu AAV-BRIAb42-au demonstrat că acești vectori au fost capabili să induce formarea plăcii, dar acest lucru nu a fost observat cu expresia rAAV2/1-BRIAb40.

Într-un alt studiu, AAV2/2 a fost utilizat pentru a livra Ab40 și Ab42, un fragment C-terminal al APP care conține peptidele Ab (C100) și un mutant V717F al lui C100 la șoarecii HP și cerebelul.

În mod interesant, mutanții Ab42 și V717F au demonstrat o inducere mai mare a microgliozei și perturbarea barierei hematoencefalice (BBB) ​​în comparație cu formele Ab40, dar nu au activat formarea plăcii, inducerea astrocitelor sau neurodegenerarea. Utilizarea tehnologiei AAV și LV pentru a exprima diferite forme de Ab și precursorii săi va continua să fie o metodă esențială de studiere a rolului lor în LOAD.117

Mai recent, LV a fost folosit pentru a exprima TDP-43, Ab42 sau ambele în cortexul motor al șobolanilor, ceea ce a descoperit că pierderea TDP-43 implică microglia ca o cauză a degenerării sinaptice observată în LOAD. 118

Mai mult, lenti-TDP-43 a declanșat modificări în procesarea APP asociată cu producția de Ab42 și a indus activitatea caspazei și neuroinflamația, care a fost observată în mod similar cu lenti-Ab42.

Expresia combinată a proteinei TDP-43 și Ab42 a dus la un rezultat similar cu TDP-43 singur, dar cu caracteristica adăugată de pierdere neuronală, sugerând un posibil efect sinergic între cei doi factori. Un alt studiu care a folosit LV pentru a exprima TDP-43 în cortexul motor a constatat modificarea metabolismului aminoacizilor, stresul oxidativ și moartea neuronală.119

Aceste rezultate împreună demonstrează utilitatea sistemelor model de AD bazate pe LV pentru a elucida factorii patogeni cheie legați de disfuncția proteinelor implicate în AD, în timp ce Ab și tau au fost testate pe larg în LOAD, în concordanță cu noțiunea de mult timp că Ab este un suspect cheie în patogeneza AD. . Cu toate acestea, eșecurile continue în studiile de droguri care vizează scăderea nivelurilor de amiloid necesită reorientarea efortului asupra altor potențiali vinovați.

Mai multe studii recente au demonstrat că APOEε4 poate contribui la toxicitatea asociată cu fenotipul AD și, până în prezent, APOE rămâne cel mai semnificativ și mai replicabil factor de risc genetic pentru AD.120

Având în vedere rolul APOEε4 în patogeneza AD și efectul protector potențial al izoformei ε2, Hu și colegii121 au generat modele de șoareci folosind izoforme AAV8-APOE conduse de promotorul GFAP exprimat în mod specific în astrocite din toate regiunile creierului, ceea ce a dus la o creștere generală. în nivelurile APOE în tot creierul șoarecelui.

Supraexpresia mediată de virus a APOEε4 la șoarecii APOEε4-TR a crescut particulele de lipoproteine ​​APOE slab lipidate și a scăzut colesterolul asociat APOE la șoarecii APOEε4-TR. În schimb, supraexprimarea APOEε2 în APOEε4-TR șoarecii au crescut lipidarea APOE și colesterolul asociat.

În plus, supraexprimarea APOEε4 a crescut nivelurile de Ab endogen, în timp ce supraexprimarea APOEε2 a avut tendința de a scădea Ab endogen. Pe baza acestor date, autorii sugerează că creșterea APOEε2 la purtătorii APOEε4 este o strategie benefică pentru tratarea AD, în timp ce creșterea APOEε4 la purtătorii APOEε4 este dăunătoare. Într-un alt studiu, injecția directintracerebrală a fost efectuată folosind AAV pentru a exprima APOEε2.

Studiul a raportat că supraexpresia APOEε2 a redus semnificativ nivelurile de Ab solubile în creier (inclusiv oligomerice) și insolubile, precum și încărcarea amiloidului, în două modele de șoarece de amiloidoză cerebrală, a căror patologie depinde fie de expresia unui șoarece, fie de izoformele APOEε4 umane.122

Zhao și colab.122 au arătat în continuare că o reducere pe scară largă a Ab creierului poate fi realizată printr-o singură injecție a virusului prin livrarea intra-talamică a AAV care exprimă APOEε2.

Colectiv, aceste date sugerează că livrarea genei AAV a APOEε2, folosind un AAV, poate salva efectele dăunătoare ale APOEε4 asupra patologiei amiloidei cerebrale; astfel, această abordare poate reprezenta o cale terapeutică viabilă pentru tratarea sau prevenirea LOAD.

For more information:1950477648nn@gmail.com