Programul de fibrogeneză renală este controlat de microARN care reglează metabolismul oxidativ

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob , Diego Rodríguez-Puyolc ,d

Santiago Lamesa,**

un program de procese fiziologice și patologice, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madrid, Spania

b Genomic Facility, Parque Científico de Madrid, Madrid, Spania

c Departamentul de Patologie, Spitalul Universitario „Ramn y Cajal”, IRYCIS, Madrid, Spania

d Departamentul de Medicină și Specialități Medicale, Fundația de Cercetare a Spitalului Universitar „Príncipe de Asturias”, IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madrid, Spania

Cuvinte cheie: MicroRNAS, fibroză renală, oxidare a acizilor grași, matrice extracelulară, CPT1A, mitocondrii

culturismul cistanche este foarte bun pentru funcția renală

A B S T R A C T

Acumularea excesivă de matrice extracelulară (ECM) este semnul distinctiv al bolilor fibrotice. În rinichi, este calea finală comună a bolilor prevalente, care duce la insuficiență renală cronică. În timp ce citokinele precum TGF- joacă un rol fundamental în transformarea miofibroblastelor, cercetările recente au arătat că disfuncția mitocondrială și oxidarea defectuoasă a acizilor grași (FAO), care compromit principala sursă de energie pentru celulele epiteliale tubulare renale, s-au propus a fi contribuitori fundamentali. la dezvoltarea și progresia fibrozei renale. S-a raportat că microARN (miARN), care reglează expresia genelor post-transcripțional, controlează fibrogeneza renală. Pentru a identifica miARN-urile implicate în dereglarea metabolică a fibrozei renale, am efectuat un ecran de matrice miARN în modelul de șoarece al obstrucției ureterale unilaterale (UUO). MiR-150-5p și miR-495-3p au fost selectați pentru legătura lor cu patologia umană, rolul lor în metabolismul mitocondrial și țintirea lor asupra enzimei de transfer a acizilor grași CPT1A. Am găsit o reglare în sus de 2- și 4-ori a miR-150-5p și, respectiv, a miR{-495-5p, atât în ​​modelul UUO, cât și în cel al nefropatiei induse de acid folic (FAN) , în timp ce TGF- 1 și-a reglat expresiile în linia de celule epiteliale tubulare renale umane HKC-8. Acești miARN au fost sinergizați cu TGF- în ceea ce privește efectul său pro-fibrotic prin îmbunătățirea markerilor asociați cu fibroză Acta2, Col1 1 și Fn1. Studiile bioenergetice au arătat o reducere a ratei de consum de oxigen (OCR) asociată cu FAO în celulele HKC-8 în prezența ambelor miARN. În mod constant, nivelurile de expresie ale genelor lor țintă legate de mitocondrie CPT1A, PGC1 și factorul de transcripție mitocondrial A (TFAM) au fost reduse la jumătate în celulele epiteliale renale expuse acestor miARN. Prin contrast, nu am detectat modificări în masa mitocondrială și potențialul transmembranar (ΔѰm) sau producția de anioni radicali superoxid mitocondrial. Datele noastre susțin că miR-150 și miR{- 495 pot contribui la fibrogeneza renală prin agravarea insuficienței metabolice implicate în mod critic în celulele epiteliale tubulare, ducând în cele din urmă la fibroză.

1. Introducere

Boala cronică de rinichi (IRC) este o afecțiune clinică în care se menține reducerea funcției renale. În general, este considerat a fi ireversibil și progresiv. Reprezintă o problemă importantă de sănătate publică care poate afecta 12-14% din populația generală [1]. Poate fi prezent la aproximativ 30-40% dintre pacienții cu patologii foarte răspândite, cum ar fi diabetul zaharat și hipertensiunea arterială, unde contribuie la dictarea evoluției și a prognosticului. Indiferent de etiologia bolii, progresia CKD duce la fibroză tubular-interstițială și glomerulară [2]. Fibroza tubulo-interstițială implică extinderea spațiului dintre membrana bazală tubulară și capilarele peritubulare prin depunerea de proteine ​​​​matricei (ECM) (predominant colagen de tip I și III și fibronectină) în asociere cu celule inflamatorii, pierderea celulelor tubulare și acumularea de miofibroblaste. [3].

Transforming growth factor- (TGF-) este considerat o citokină profibrotică omniprezentă crucială și regulatorul principal al diferențierii miofibroblastelor în fibroză [4]. Studii recente au demonstrat că un defect global în oxidarea acizilor grași (FAO), care duce la un compromis în principala sursă de energie pentru celulele epiteliale tubulare, joacă un rol important în dezvoltarea fibrozei renale [5,6]. TGF- suprimă FAO într-o manieră dependentă de SMAD3-și PGC1A, afectând astfel regulatorii transcripționali ai absorbției și oxidării acizilor grași, inclusiv CPT1A [5]. Modificările în FAO au ca rezultat acumularea intracelulară de lipide și epuizarea ATP, ducând la fibroză [5,7]. Astfel, strategiile care vizează restabilirea tulburării metabolice care operează în CKD pot oferi opțiuni terapeutice [8].

MicroARN-urile (miARN-urile) au apărut ca regulatori critici ai expresiei genelor prin acțiunea lor asupra reglării posttranscripționale. În rinichi, s-a demonstrat că miR joacă un rol critic în nefrogeneză, homeostazie și boală [9]. MiRNA-urile sunt, de asemenea, capabile să regleze procesele fibrotice și au fost denumite „fibroză” [10]. În plus, din cauza lipsei unei terapii eficiente pentru a preveni sau a inversa fibrogeneza renală [11], manipularea exprimării miARN prin livrarea in vivo a imitatorilor sau inhibitorilor miARN a fost propusă ca o strategie terapeutică promițătoare pentru CKD [12]. În plus, miARN-urile circulante pot constitui biomarkeri diagnostici și chiar prognostici [13].

Controlul mediat de MiARN al fibrozei renale are loc în principal prin reglarea semnalizării TGF- 1 într-o manieră dependentă de celule și dependentă de context, utilizând calea Smad ca una dintre țintele principale [14]. În lucrările anterioare, am identificat mai multe miARN care au un impact asupra fibrozei renale prin reglarea căilor metabolice specifice [15,16]. Supraexprimarea miR-9-5p previne dediferențierea celulelor renale epiteliale tubulare și reprogramează tulburările metabolice legate de fibroză [16], în timp ce pierderea funcției miR{-33, fie genetică, fie farmacologică, are ca rezultat creșterea FAO și prevenirea acumulării de lipide în celulele epiteliale tubulare. Acest lucru este asociat cu creșterea aprovizionării cu energie, îmbunătățirea bioenergeticii mitocondriale și prevenirea fibrozei renale experimentale [15]. Astfel, miARN-urile care reglează bioenergetica celulară sunt, de asemenea, capabile să regleze fibrogeneza renală. În acest studiu, am folosit o strategie bazată pe matrice miARN în modelul de leziune renală cronică cu obstrucție ureterală unilaterală (UUO) pentru a identifica miARN implicați în fenotipul fibrotic renal prin modificarea căilor metabolice. Prin selectarea mai multor gene legate de funcția mitocondrială (CPT1A, TFAM, PGC1A), am identificat atât miR-150, cât și miR{-495 ca miARN capabili să reducă rata de consum de oxigen (OCR) asociată cu FAO și să promoveze TGF{ {21}}transformarea fibrogenică indusă în linia de celule epiteliale tubulare renale umane HKC-8. Descoperirile noastre subliniază importanța miARN-urilor ca regulatori metabolici mitocondriali implicați în fibrogeneza renală.

2. Material și metode

Liniile celulare și condițiile de cultură. Celulele epiteliale tubulare proximale renale umane (HKC-8) au fost cultivate în DMEM/F12 (mediu Eagle modificat de Dulbecco 1:1 (v/v)) (Corning, New York, NY) suplimentat cu 15 mM HEPES, 5 procente (vol/vol) ser fetal bovin (FBS)

(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0.5 ug/ml hidrocortizon (Sigma, St. Louis, MO), 50 unități/ ml penicilină și 50 ug/ml streptomicină (Gibco, Rockville, MD) la 37°C și 5% CO2. Această linie celulară a fost oferită cu amabilitate de laboratorul Dr. Susztak (Philadelphia, Pennsylvania, SUA). Tratamentele cu TGF- 1 recombinant uman de 10 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) au fost efectuate după înfometarea fără ser a celulelor HKC-8 timp de 12 ore.

Procedura de transfecție. Celulele au fost însămânțate în vase de cultură de 60 mm pentru a ajunge la o confluență de 70 la sută. Aceștia au fost transfectați cu 40 nM fie de miRNA mirVana™ care mimează miR-150, miR{{-495, fie de control negativ imitativ de miRNA mirVana™ (compania Ambion, SUA) folosind lipofectamină 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Celulele au fost incubate cu lipofectamină-pre-miARN 37 ◦ C timp de 6 ore. Ulterior, 5 ml de mediu proaspăt care conține 10% FBS au fost adăugați în vasele de cultură, iar celulele au fost menținute în cultură timp de 6 ore până când sunt utilizate pentru experimentele ulterioare. În cazul combinației cu tratamentul cu TGF- 1, acesta a fost aplicat celulelor după supraexprimarea miARN-ului conform secțiunii anterioare.

Imunoblot. Celulele au fost spălate în PBS, omogenizate și lizate în 100 μL tampon de liză RIPA care conține 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% deoxicolat de sodiu, 1% NP-40 și 25 mM Tris- HCl pH 7,6, în prezența proteazei (Complete, Roche Diagnostics, Mannheim, Germania) și a inhibitorilor de fosfatază (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) și recoltați prin răzuire. Un sfert de bucată din fiecare probă de rinichi (obținută după disecție în jumătate, atât pe lungime, cât și pe cruce) a fost omogenizat în tampon RIPA de 300 ul cu perle de oțel inoxidabil de 5 mm (Qiagen, Valencia, CA) folosind TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA) vibrând la 50 Hz timp de 15 min la 4 ◦ C. Probele au fost clarificate prin centrifugare la 10,000 g timp de 15 min la 4 ◦ C. Peleta a fost apoi aruncată, iar supernatantul a fost păstrat ca lizat de proteine. Concentrațiile de proteine ​​au fost determinate de kit-ul de testare a proteinelor BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL) și au fost măsurate în Glomax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI). Cantități egale de proteine ​​(10–50 ug) din extractul total au fost separate pe geluri SDS-poliacrilamidă 8–10% și transferate pe membrane de nitroceluloză (GE Healthcare, Chicago, IL) la 12 V timp de 20 de minute într-un mediu semi-uscat. Sistem Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, Hercules, California).

Membranele au fost blocate prin incubare timp de 1 oră cu lapte degresat 5% în PBS care conține 0,5% Tween-20 și tamponate peste noapte cu anticorpii specifici: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{ {26}}; 4 ◦ C peste noapte), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦ C peste noapte), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15000; 1 oră, temperatura camerei) ). După incubarea cu anticorpi secundari IRDye 800 de capră anti-iepure și IRDye 600 de capră anti-șoarece (1:15.000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE), membranele au fost fotografiate în trei exemplare cu Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Densitometria de bandă a fost efectuată folosind software-ul ImageJ 1.48 (http://rsb.info.nih.gov/ij) și expresia relativă a proteinei a fost determinată prin normalizarea la GAPDH. Modificările de pliere au fost normalizate la valorile stării de control.

extracția ARN. ARN-ul total a fost extras din celule HKC-8 sau rinichi de șoarece folosind kitul miRNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) conform instrucțiunilor producătorului. Cantitatea și calitatea ARN au fost determinate la 260 nm de un spectrofotometru Nanodrop-1000 (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Analiza expresiei ARNm. Transcripția inversă (RT) a fost efectuată cu 500 ng de ARN total folosind kitul de sinteză iScript™ cADN (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT–PCR a fost efectuată cu iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA), folosind un 96-godeu Bio-Rad CFX96 RT–PCR System cu un termociclor C1000 (Bio-Rad, Hercules, CA) conform instructiunilor producatorului. O valoare Ct a fost obținută din fiecare curbă de amplificare folosind software-ul de analiză CFX96 furnizat de producător. Expresia relativă a ARNm a fost determinată folosind metoda 2 - ΔΔCt [17]. Gena 18S a fost utilizată în scopuri de normalizare. Secvențele de primer utilizate pentru cuantificarea ARNm au fost: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA- TAGCCACGCTCAG), COL1A1 (FW: CGGGTGACCGACCTGCC: FWV: CGGTAGACCGACCTGCC, FWV: CGGTAGACCGACCTGCC), GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCACTCCCCGCCCTA- TAAGCATC), 18S: GGGGAATGCTGGGGGTAGG, 18S: GGGGAATGCTGGGGGTAGG). Modificările de pliere au fost normalizate la valorile stării de control.

Cuantificarea expresiei miARN. Cuantificarea expresiei miARN-urilor a fost efectuată utilizând kitul miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT (Exiqon, Feedback, Danemarca). După RT, șablonul ADNc a fost amplificat folosind primeri LNA specifici pentru microARN pentru miR150-5p sau miR-495-3p matur (Exiqon, Feedback, Danemarca). qRT–PCR a fost efectuat într-un 96-godeu Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System cu un termociclator C1000 folosind iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) conform instrucțiunilor producătorului . O valoare Ct pentru godeuri triple a fost obținută din fiecare curbă de amplificare folosind software-ul CFX Manager Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Valorile Ct au fost normalizate la ARNr-ul 5S de control endogen. Nivelurile plasmatice de miARN au fost normalizate la miR-103a-5p. Expresia relativă a miARN a fost determinată folosind metoda 2 - ΔΔCt [17]. Modificările de pliere au fost normalizate la valorile stării de control.

Modele de șoarece de fibroză renală. Șoarecii au fost găzduiți în unitatea pentru animale fără patogeni specifici (SPF) de la CBMSO, în conformitate cu reglementările UE pentru toate procedurile. Animalele au fost manipulate în acord cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator conținut în Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European. Aprobarea a fost acordată de comisia locală de evaluare a etică a Centro de Biología Molecular „Severo Ochoa” din Madrid, de comitetul de etică de la CSIC și de Unitatea de reglementare pentru procedurile experimentale pe animale din Comunidad de Madrid.

Obstrucția ureterală unilaterală (UUO): Procedura chirurgicală UUO a fost efectuată așa cum a fost descris anterior [18]. Pe scurt, șoarecii au fost anesteziați cu izofluran (3–5 procente pentru inducție și 1–3 procente pentru întreținere) și împărțiți în două grupuri experimentale: grupul UUO și grupul cu operație simulată. În grupul UUO, șoarecii au fost rasi pe partea stângă a abdomenului, s-a făcut o incizie verticală prin piele cu un bisturiu și pielea a fost retrasă. S-a făcut o a doua incizie prin peritoneu pentru a expune rinichiul. Ureterul stâng a fost ligat de două ori la 15 mm sub pelvisul renal cu mătase chirurgicală, iar ureterul a fost apoi tăiat între cele două ligaturi. Apoi, rinichiul legat a fost plasat ușor înapoi în poziția sa anatomică corectă și a fost adăugată soluție salină sterilă pentru a reumple pierderea de lichid. Inciziile au fost suturate și șoarecii au fost în cușcă individual. Operația simulată a fost efectuată într-o manieră similară, dar fără ligatura ureterală. Buprenorfina a fost folosită ca analgezic. O primă doză a fost administrată cu 30 min înainte de operație și apoi la fiecare 12 ore timp de 72 ore, la o doză de 0,05 mg/kg subcutanat. În acest model, fluxul sanguin renal și rata de filtrare glomerulară devin semnificativ reduse în 24 de ore, iar inflamația interstițială (vârf la 2-3 zile), dilatarea tubulară, atrofia tubulară și fibroza sunt evidente după 7 zile. Rinichiul obstrucționat atinge disfuncția maximă în aproximativ 2 săptămâni după procedură. Șoarecii au fost sacrificați prin supradozaj cu CO2 și control și au fost recoltate probe de rinichi și sânge obstrucți după perfuzia cu PBS la 3, 5, 7, 10 și 15 zile după UUO.

Nefropatie indusă de acid folic (FAN): în acest model, fibroza renală a fost indusă prin injectare intraperitoneală (ip) cu 250 mg de acid folic (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) per kg greutate corporală dizolvată în 0.3 M bicarbonat de sodiu (vehicul) așa cum a fost descris anterior [19]. Animalele martor au primit 0,3 ml de vehicul (ip). Șoarecii au fost sacrificați prin supradozaj cu CO2 și rinichi și probe de sânge au fost recoltate după perfuzia cu PBS după 15 zile de administrare de FA.

profilarea microARN. Pentru a identifica miARN-uri specifice care reglează rezultatul fibrotic, a fost selectată o matrice de microARN personalizat miRCURY LNA (Exiqon, Feedback, Danemarca) ca platformă pentru profilarea microARN. Această platformă a constat dintr-un total de 175 de teste unice specifice pentru miARN-urile de șoarece prezente în Sanger miRBase v22.1 (http://microrn a.sanger.ac. UK). Pentru fiecare microARN, catena predominantă a fost selectată pentru analiză. Selecția MiR s-a bazat pe genele țintă prezise legate de fibroza renală, metabolismul mitocondrial, procesele redox și ritmul circadian. Această analiză a fost realizată cu instrumentele bioinformatice pentru predicția țintei miRNA bazate pe secvențe, microcosmos [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) și miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). După extracția ARN din probe de rinichi UUO de 7 zile, fracția de miARN prezentă în 20 ng de ARN total a fost supusă transcripției inverse utilizând kitul miRCURY LNA RT (Exiqon, Feedback, Danemarca) conform instrucțiunilor producătorului. ADNc-urile rezultate au fost analizate cu panourile miRCURY miRNA PCR într-un sistem Roche LightCycler 480 Real-Time PCR utilizând miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Feedback, Danemarca). Fiecare probă a fost analizată în dublu exemplar. Această procedură a fost efectuată în Facilitatea de Genomică a Fundacion Parque Científico de Madrid (Madrid, Spania). Software-ul LC480 a fost utilizat pentru a obține valorile Cq (Cq) pentru fiecare miARN. Valoarea delta Ct (ΔCt) a fost calculată prin normalizarea valorilor Ct la snRNAU6 de întreținere endogenă. Harta termică a fost generată cu datele PCR în timp real prezentate ca ΔCt. Gruparea ierarhică a fost construită în funcție de valorile ΔCt. Valoarea delta Ct (ΔΔCt) a fost calculată prin scăderea ΔCt a grupului de probă de referință (rinichi de control) din ΔCt a fiecărei probe de rinichi obstrucționate. Cuantificarea relativă (RQ) sau schimbarea de ori a fiecărui miARN a fost generată folosind metoda 2 - ΔΔCt [17]. MiARN-urile exprimate diferențial au fost identificate prin testul parametric Limma. Pentru a ține cont de testarea ipotezelor multiple, valorile P au fost ajustate (adj.) folosind corecția Benjamini-Hochberg pentru rata de descoperire falsă (FDR) [25]. Rezultatele au fost reprezentate grafic pe o diagramă vulcanică.

Analiza miARN în plasma sanguină de la pacienții cu CKD. Nivelurile de miARN selectate au fost analizate în probe de plasmă de la o cohortă de 100 pacienți cu CKD, care este detaliat mai jos. Sângele venos periferic a fost colectat în vacutainere acoperite cu spray cu EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ). Pentru a obține plasmă, sângele a fost centrifugat la 400 g timp de 20 de minute, supernatantul a fost transferat într-un tub nou și centrifugat la 800 g timp de 20 de minute. Plasma a fost colectată și depozitată înghețată în alicote la - 80 ◦ C. MiARN-ul plasmatic a fost extras din sânge utilizând kitul de izolare miRCURYTM ARN-Biofluids și UniSp2 Spike-in ARN (Exiqon, Vedbaeck, Danemarca). Analizele nivelurilor miR-150 din aceste probe au fost efectuate așa cum este descris în secțiunea procedurii de cuantificare a expresiei miARN. Măsurătorile ratei consumului de oxigen. Rata consumului de oxigen asociat oxidării acizilor grași (OCR) (ligat la fosforilarea oxidativă) și rata de acidificare extracelulară (ECAR) (asociată cu producția de lactat și glicoliză) au fost studiate folosind analizorul metabolic Seahorse Bioscience conform instrucțiunilor producătorului [26]. Celulele HKC-8 au fost însămânțate într-o placă p60 și transfecția cu microARN a fost efectuată așa cum este descris mai sus când au atins o confluență de 70% 48 de ore mai târziu, celulele HKC{-8 au fost tratate cu 10 ng/ml TGF{{ 18}} timp de 48 de ore. Apoi, celulele au fost însămânțate la 2 × 104 celule per godeu într-o microplacă de cultură celulară Seahorse Bioscience XFe24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). După aderarea celulară, mediul de creștere a fost înlocuit cu un mediu limitat de substrat, Mediu Eagle Modificat Dulbecco (DMEM) suplimentat cu 0,5 mM Glucoză și 1 mM Glutamat. Cu o oră înainte de măsurarea testului, celulele au fost incubate cu mediu de test Krebs-Henseleit Buffer (KHB) suplimentat cu 0,2% carnitină la 37 °C fără CO2. Cu 15 minute înainte de analiză, inhibitorul CPT1 Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 μM a fost adăugat la godeurile corespunzătoare și celulele au fost incubate la 37 ◦ C fără CO2. În cele din urmă, imediat înainte de analiză, a fost adăugat BSA sau 200 μM Palmitate-BSA FAO Substrate (Agilent Technology, Santa Clara, CA, SUA). Imediat, testul de stres XF Cell Mito a fost efectuat într-un analizor de energie Seahorse XFe24 prin adăugarea secvenţială a mai multor modulatori ai funcţiei mitocondriale. În primul rând, a fost utilizată oligomicină inhibitoare de ATP sintetaza (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM) după măsurarea bazală. Aceasta scade fluxul de electroni prin ETC, rezultând o reducere a respirației mitocondriale. Apoi, a fost adăugat agentul de decuplare cianura 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazonă (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 μM), care prăbușește gradientul de protoni și perturbă potențialul membranei mitocondriale. Ca urmare, fluxul de electroni prin ETC este dezinhibat, iar consumul de oxigen de către complexul IV atinge maximul. A treia și ultima injecție este un amestec de inhibitori ai complexului III și I antimicină/rotenonă (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). Această combinație oprește respirația mitocondrială și permite calcularea respirației non-mitocondriale conduse de procese din afara mitocondriilor. Substraturile/inhibitorii au fost pregătiți în același mediu în care a fost efectuat experimentul și au fost injectați automat din porturile de reactiv la orele indicate. Măsurătorile au fost înregistrate pentru perioade de timp de 3-min (pe o perioadă totală de 2 ore) și valorile au fost normalizate pentru conținutul total de proteine. Proteina a fost extrasă din godeuri cu 0,1% soluție de NP-40-PBS și cuantificată cu un test de proteine ​​BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Au fost utilizate patru godeuri pentru fiecare grup experimental. Testul de stres XFp Cell Mito a fost folosit pentru a determina parametrii cheie ai funcției mitocondriale: respirație mitocondrială bazală, respirație legată de ATP, scurgere de protoni (consum de oxigen ne-- ATP), respirație maximă, respirație non-mitocondrială , și capacitatea respiratorie de rezervă, așa cum a fost descris anterior [27].

Testul luciferazei. Pentru a caracteriza situsurile de legare candidate miARN-150 și miARN-495 în CPT1A 3′-UTR uman, un test de reporter al luciferazei care conține CPT1A 3′-UTR (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, Product ID S814347) a fost utilizat. Mutațiile direcționate pe site în regiunile de semințe ale site-urilor miR-150 și miR{-495 prezise din 3′ - UTR-uri au fost generate prin utilizarea trusei de mutageneză direcționată Multisite-QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) conform la protocolul producătorului. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), Toate constructele au fost secvențiate înainte de utilizare pentru a confirma că sunt structura adecvată. Celulele HKC-8 au fost însămânțate în placă ap{24-godeuri și au fost co-transfectate tranzitoriu cu 200 ng pLightSwitch_CPT1A{_3′-UTR (construcții intacte sau mutante) și 4 ng pGL3-Promotor (o luciferază de licurici sub controlul promotorului SV40) (Promega Corporation, Madison, WI, SUA) plasmide reporter și 40 nM de miARN mirVana™ care mimează miR-150, miR -495 sau mirVana™ miARN mimează controlul negativ (compania Ambion, SUA) folosind lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) când au atins o confluență de 70 la sută, așa cum este descris mai sus. Au fost utilizate patru godeuri pentru fiecare grup experimental. Testele luciferazei au fost efectuate 24 de ore mai târziu folosind sistemul de raportare Dual-Luciferase (Promega, Madison, WI). Semnalele luciferazei de vanilie și licurici au fost detectate folosind un sistem de detectare multiplu Glomax (Promega Corporation, Madison, WI, SUA). Activitatea renilla luciferazei a fost normalizată de activitatea luciferazei de licurici.

Potențialul membranei mitocondriale (MMP). Modificările MMP au fost determinate ca diferențe în fluorescența esterului metilic al tetrametilrodaminei (TMRM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Se acumulează în mitocondriile polarizate încărcate negativ și are fluorescență în portocaliu. Când potențialul membranei mitocondriale se prăbușește în celulele apoptotice sau stresate metabolic, reactivul TMRM este dispersat în citosolul celular și nivelurile de fluorescență scad dramatic. Celulele HKC-8 au fost cultivate și transfectate așa cum este descris în secțiunile privind cultura celulară și procedura de transfecție. Apoi, mediul de creștere a fost înlocuit cu soluție de sare echilibrată Hank (HBSS) fără roșu fenol cu ​​Hepes 10 mM. Tratamentele cu oligomicină (5 μM) și FCCP (4 μM) timp de 5 minute au fost utilizate ca condiții de control pozitive și negative. Apoi, celulele au fost colorate cu 250 nM TMRM timp de 30 de minute la 37 ◦ C. Celulele au fost recoltate cu tripsină, centrifugate (3000 rpm, 5 min) și granula a fost resuspendată în 200 μL HBSS cu 1% Albumină serică bovină (BSA) și acid etilendiaminotetraacetic 5 mM (EDTA). Intensitatea fluorescenței a fost măsurată prin citometrie în flux utilizând o lungime de undă de emisie de 570 nm pentru TMRM (FL2) [28] într-un sistem BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) și analizată cu software-ul FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland). , SAU). Pentru fiecare condiție experimentală, au fost analizate cel puțin 20.000 de singlete în triplicat.

Producția de anioni radicali superoxid mitocondrial. Evaluarea producției de anioni de radical superoxid a fost efectuată utilizând indicatorul anionic de radical superoxid mitocondrial Mito-SOX™ Red (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA), un colorant fluorogen foarte selectiv pentru anionul radical superoxid mitocondrial din celulele vii, conform indicațiilor producătorului. instrucțiuni. Celulele HKC-8 au fost cultivate și transfectate așa cum este descris în secțiunile privind cultura celulară și procedura de transfecție. Apoi, mediul de creștere a fost înlocuit cu soluție de sare echilibrată Hank (HBSS) fără roșu fenol cu ​​Hepes 10 mM. Tratamentul cu antimicină A (150 μM) și cianura de carbonil m-clorofenilhidrazonă (CCCP) (50 μM) timp de 5 minute au fost utilizate ca condiții de control pozitive și negative. Apoi, celulele au fost colorate cu 5 μM MitoSOX™ Red timp de 30 de minute la 37 ◦ C. Celulele au fost recoltate așa cum este descris în secțiunea de potențial al membranei mitocondriale. Intensitatea fluorescenței a fost măsurată prin citometrie în flux utilizând o lungime de undă de emisie de 580 nm pentru MitoSOX™ Red (FL2) într-un sistem BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) și analizată cu software-ul FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland, SAU). Pentru fiecare condiție experimentală, cel puțin 20,000 singlete au fost analizate în trei exemplare.

Etichetarea mitocondrială. Evaluarea conținutului mitocondrial a fost efectuată utilizând MitoTracker™ green FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA), care difuzează pasiv prin membrana plasmatică și se acumulează în mitocondriile active, indiferent de potențialul membranei mitocondriale, conform instrucțiunilor producătorului. Celulele HKC-8 au fost cultivate și transfectate așa cum este descris în secțiunile privind cultura celulară și procedura de transfecție. Apoi, mediul de creștere a fost înlocuit cu soluție de sare echilibrată Hank (HBSS) fără roșu fenol cu ​​Hepes 10 mM. Celulele au fost colorate cu 150 nM cu MitoTracker™ green FM timp de 30 de minute la 37 ◦ C. Pentru analiza citometriei în flux, celulele au fost recoltate așa cum este descris în secțiunea potențialului membranei mitocondriale. Intensitatea fluorescenței a fost măsurată utilizând o lungime de undă de emisie de 516 nm pentru MitoTracker™ green FM (FL1) într-un sistem BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) și analizată cu software-ul FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC). , Ashland, OR). Pentru fiecare condiție experimentală, au fost analizate cel puțin 20,000 singlete în triplicat. Pentru imagistica prin fluorescență, nucleele au fost, de asemenea, colorate cu DAPI (Sigma, St. Louis, MO) timp de 5 minute la RT. Celulele vii au fost vizualizate cu un microscop confocal inversat Zeiss LSM 710 cu o Celulă observată, un obiectiv 63X/1,2 Water C-Apochromat Corr UV-VIS-IR M27 și analizate cu software-ul Zeiss Zen2010B sp1 (Zeiss, Oberkochen, Germania) .

Determinarea numărului de copii mitocondriale. ADN-ul genomic a fost extras din celulele HKC-8 utilizând kitul DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Valencia, CA), conform instrucțiunilor producătorului. Abundența mitocondrială a fost determinată cu kit-ul de testare a numărului de copii ale ADN mitocondrial uman (Detroit R&D, Detroit, MI). Numărul relativ de copii mtDNA a fost prezentat ca raportul mtDNA-ADN nuclear.

Probe de pacienti cu BRC uman. O cohortă de 100 de pacienți cu IRC (etapa 3-4) de la Spitalul Principe de Asturias a fost selectată pentru analiza nivelurilor plasmatice de miARN. Acesta a inclus două subgrupe diferite clasificate în funcție de evoluția funcției renale pe baza indicatorului GFR MDRD [29] pe o perioadă de 24 de luni: 50 de pacienți au prezentat mai puțin de 10% dinrinichideteriorarea funcției, în timp ce ceilalți au experimentat o reducere de cel puțin 40% a funcției renale sau au inițiatrenalterapie de substituție (dializă). De asemenea, am cuantificat gradul de fibroză înrinichibiopsii dintr-o cohortă diferită de 26 de pacienți cu disfuncție a grefeirinichitransplant de la Spitalul Ramn y Cajal. Toate biopsiile au fost evaluate conform criteriilor Banff 2007 [30].

Analize statistice. Datele au fost analizate folosind teste neparametrice, cu excepția cazurilor în care este indicat. Diferența dintre cele două grupuri independente a fost examinată cu testul Mann-Whitney, în timp ce mai mult de două grupuri au fost comparate cu testul Kruskall-Wallis. O valoare P de 0.05 sau mai puțin a fost considerată semnificativă statistic (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0,001).="" datele="" au="" fost="" analizate="" folosind="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca).="" datele="" sunt="" raportate="" ca="" medie="" ±="" eroarea="" standard="" a="" mediei="">

3. Rezultate

Date de expresie a miARN în fibrotică indusă de UUOrinichi. Pentru a descifra contribuția miARN-urilor la reglarea metabolică arenalfibrogeneza, modelul UUO de 7 zile a fost realizat la șoareci WT. ARN a fost izolat din martor și fibroticrinichiprobele și profilul de expresie a miARN a fost analizat într-o matrice de microARN personalizată. Selecția miARN-urilor sa bazat pe potențialul lor de țintire a enzimelor cheie implicate în metabolismul mitocondrial, procesele redox și ritmul circadian după analiza „in silico” (mai multe detalii în secțiunea Metode). Harta de căldură a dezvăluit modele de expresie clar distincte în unele miARN-uri atunci când a comparat fibrotic și controlrinichiprobe (Fig. 1A). Analiza diagramei vulcanului a arătat că 73 din 175 miARN-uri au fost exprimate diferențial, 17 sus și 56 reglați în jos, în probele de rinichi fibrotici în comparație cu cele de control (Fig. 1B, Tabelul suplimentar 1). Printre acestea, au fost selectate miARN-uri specifice care ar putea regla rezultatul fibrotic în rinichi prin căi metabolice. În acest scop, analiza in silico a 3′UTR (regiunea netradusă) a genelor specifice implicate în funcțiile metabolice și mitocondriale, CPT1A, TFAM, PGC1A a fost efectuată cu trei instrumente de predicție independente (Targetscan, miRWalk și miRanda). Criteriile de selecție au inclus și nivelul expresiei renale, noutatea țintelor, gradul de cunoaștere a căii metabolice și semnificația biologică. Legătura cu patologia umană, nivelul de expresie a țesutului renal, rolul lor în metabolismul mitocondrial și potențiala țintire a enzimei de transfer a acizilor grași CPT1A ne-au încurajat să ne concentrăm pe trei miARN, miR-150-5p, miR{-495-3p și miR-33-5p, ca candidați capabili să regleze modificările metabolice asociate fibrogenezei renale (Fig. 1C). De notat, CPT1A 3′-UTR conține un site de semințe pentru miR-150 și două locuri de semințe pentru miR-495. Am observat că miR-150 și miR{-495 au scăzut activitatea unui test reporter de luciferază care conține CPT1A 3′-UTR cu ~15%, respectiv 25%. Această reglare în jos a fost complet abrogată în cazul mutațiilor punctuale (PM) în 3′-UTR al CPT1A pentru site-ul de legare miR-150 (PM2) și parțial absentă în ambele site-uri de legare miR-495 (PM1). și PM3) (Fig. 1A și B suplimentare). Aceste date indică o interacțiune directă a CPT1A cu miR-150 și miR-495. MiR-33-5p a făcut obiectul unui studiu separat [15]. MiR-150-5p și miR{-495-3p au fost reglate în creștere în probele de rinichi fibrotici în comparație cu cele de control, cu o modificare de ori de 3,69 (valoarea P: 0.012). ) și, respectiv, 1,95 (valoarea P: 0,012).

MiR-150 și miR-495 îmbunătățesc răspunsul profibrotic TGF la omrenalcelule epiteliale tubulare. Reacția cantitativă în lanț de transcripție inversă-polimerază (qRT-PCR) a fost efectuată pentru a confirma schimbarea expresiei miR-150-5p și miR{-495-3p care au fost identificate prin profilarea expresiei miARN în UUOrinichiprobe (Fig. 2A și B). În plus, cinetica expresiei miR-150-5p și miR{- 495-3p în rinichi la 3, 5, 7, 10 și 15 zile după procedura UUO a fost analizată prin qRT-PCR. Expresia acestor miARN a fost îmbunătățită semnificativ de 2- ori la 5 zile după UUO și a rămas crescută la 15 zile după UUO (Fig. 2C și D). Nivelul de expresie al acestor miARN a fost, de asemenea, evaluat în modelul de nefropatie cu acid folic (FAN). Am găsit o reglare în sus de 4- și 2-fold a miR-495-3p și, respectiv, a miR-150-5p, în fibroticărinichimostre din modelul FAN (Fig. 2E). TGF- 1, unul dintre regulatorii principali ai fibrogenezei, a indus, de asemenea, expresia miR{-150 și miR{-495 în celulele HKC-8 mai mult de 2-ori și {{ 6}} ori, respectiv, după 48 de ore, susținând un rol potențial pentru acești miARN-uri în evenimentele legate de semnalizarea TGF (Fig. 3A și B). Pentru a evalua dacă miR-150 și miR{-495 au fost implicate în transformarea pro-fibrotică a celulelor epiteliale tubulare de către TGF- 1, linia celulară umană HKC-8 a fost transfectată cu miR -150-5p sau miR-495-3p și tratate cu TGF- 1 pentru momente diferite. Creșterea nivelurilor de miR-150-5p și miR{-495-3p a îmbunătățit semnificativ expresia nivelului de ARNm indus de TGF- 1-a markerilor asociați cu fibroză Acta2, Col1 1 și Fn1 ( Fig. 3C și D). În mod similar, supraexprimarea miR-150-5p sau miR{-495-3p a redus puternic CPT1A și a sporit abundența proteinei -SMA (Fig. 3E și F). Aceste date sugerează că aceste miARN-uri pot participa la patogenezarenalfibroza prin promovarea dediferențierii epiteliale dependente de TGF- 1-a celulelor tubulare, precum și prin compromiterea expresiei unei enzime critice implicate în FAO.

MiR-150 și miR-495 induc modificări bioenergetice mitocondriale și reduc expresia genelor implicate în funcția mitocondrială esențială. Pentru a obține o perspectivă asupra consecințelor metabolice induse de administrarea miR-150-5p sau miR{-495-3p, am studiat profilul bioenergetic al omului.renalcelule epiteliale tubulare.

Fig. 1. Datele de exprimare a miARN în fibroza indusă de UUO. (A) Harta termică care arată expresia relativă a miARN a contralaterală și obstrucționatărinichide șoareci C57/BL6-J supuși procedurii UUO timp de 7 zile (n=6). Bara de scară variază de la verde la roșu (expresie mare până la scăzută), iar numerele reprezintă valorile ΔCt. În partea stângă sunt indicate miARN-urile selectate pentru studiu. (B) Analiza grafică a vulcanului a miARN-urilor modulate cu UUO. Log10 cuantificarea relativă (RQ) și valorile P negative (- ) log10 ajustate (adj.) sunt reprezentate grafic pe axa x și, respectiv, y. Fiecare miARN este reprezentat printr-un punct. 73 din 175 miARN-uri au arătat o expresie alterată în probele fibrotice (adj. P-valoare mai mare sau egală cu 0,05). Sunt evidențiate miARN-urile selectate pentru analize ulterioare. (C) miR-150-5p și miR{-495-3p au fost selectate pe baza puterii lor pentru țintirea in silico a genelor CPT1A, TFAM și PGC1A. Pentru fiecare microARN selectat, situsurile țintă conservate ale semințelor în 3'UTR ale acestor gene, sunt indicate schimbarea orificiilor și semnificația lor (valoarea P adj.).

Fig. 2. Nivelurile de expresie ale miR-150-5p și miR-495-5p înrinichide la modelele UUO și FAN. (A, B) analiza qRT-PCR a expresiei miR-150-5p (A) și miR{-495- 3p (B) înrinichide la șoareci la 7 zile după UUO în probe analizate anterior cu matricea de microARN. (C–E) Analiza qRT-PCR a expresiei miR-150-5p și miR{-495-3p după modelul FAN (C) și la 3, 5, 7, 10 și la 15 zile după UUO pentru miR-150-5p (D) și miR{{{0}}p (E). Graficele cu bare reprezintă media nivelurilor de expresie a modificării pliului ± sem de la 6 (A, B, E) și 3 (C și D) șoareci per grup. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" în="" comparație="" cu="" condițiile="" lor="" de="" control="" corespunzătoare;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" comparativ="" cu="">rinichide la șoareci cu același tratament experimental.

TGF- 1 a fost folosit ca model de citokină implicată în modificările asociate pro-fibrotice. Pentru a determina starea bioenergetică a acestor celule, rata de consum de oxigen asociată cu FAO (OCR) și rata de acidificare extracelulară (ECAR) a celulelor HKC-8 au fost măsurate în timpul tratamentului secvenţial cu compuși care modulează activitatea mitocondrială în prezența palmitatului. , folosind un analizor de flux extracelular Seahorse XF24 (mai multe detalii în secțiunea Metode). După 48 de ore cu TGF- 1, celulele HKC-8 în prezența miR{-150-5p au prezentat o scădere constantă a OCR bazal, cuplat cu generarea de ATP, respirație legată de ATP și respirație maximă, ceea ce se referă la OCR sensibil la FCCP (Fig. 4A). Deteriorarea OXPHOS a fost oglindită de o scădere a conținutului de ATP în celulele HKC-8 care supraexprimă miR{-150-5p (Fig. 4C). Nu am observat că aceste miARN-uri au indus variații în ECAR (datele nu sunt prezentate). În concordanță cu aceasta, nivelurile de expresie ARNm ale lor mitocondriale-

genele țintă înrudite CPT1A, PGC1 și factorul de transcripție mitocondrial A (TFAM) au fost reduse la jumătate în celulele tratate cu miR-150, în comparație cu celulele tratate cu NC imitați miARN (Fig. 4E). Studiile care au folosit aceeași abordare experimentală cu miR-495-3p au dat rezultate similare (Fig. 4B, D, F). Cu toate acestea, masa mitocondrială, determinată de numărul de copii ADNmt și de colorarea mitocondrială cu MitoTrackerTM green FM, nu a fost modulată semnificativ de miARN-150 și miARN{- 495 atât în ​​condiții bazale, cât și sub tratament cu TGF. O tendință de scădere a acestui parametru a fost observată la bază (Fig. 2A, B, C suplimentare). În general, aceste date susțin faptul că miR-150 și miR-495 promovează a

acțiune pro-fibrotică în celulele epiteliale tubulare prin afectarea funcției mitocondriale.

MiR-150 și miR-495 nu modifică potențialul transmembranar mitocondrial (ΔѰm) și radicalul superoxid mitocondrial

Fig. 3. MiR-150 și miR-495 îmbunătățesc răspunsul pro-fibrotic dependent de TGF- 1-la omrenalcelule epiteliale tubulare. (A, B) Analiza RT-PCR a expresiei miR{{0}}p (A) și miR{-495-3p (B) în celulele HKC-8 tratate cu 1{{24 }} ng/ml TGF- 1 pentru orele indicate. (C, D) niveluri de ARNm de actină a mușchiului neted alfa (-SMA), colagen de tip alfa 1-1 (Col{1 1), fibronectină (FN) din celulele transfectate cu miR-NC și miR miR -150-5p (C) sau miR-495-3p (D) au fost determinate prin qRT-PCR utilizând Sybr green. Celulele au fost tratate cu TGF- 1 (10 ng/ml) după supraexprimarea miARN acolo unde este indicat (vezi și secțiunea metode). (E, F) Imunobloturi care prezintă nivelurile de proteine ​​​​CPT1A și -SMA în celulele transfectate cu miR-NC și mimează miR-150-5p (E) sau miR{{{20}}p (F) pentru punctele de timp indicate. GAPDH a fost utilizat în scopuri de normalizare. Graficele cu bare (panourile din dreapta) reprezintă media expresiei modificării pliului ± sem din 3 experimente independente. *P < {{30}},05,="" **p=""><0,01, ***p=""><0,001 în="" comparație="" cu="" condițiile="" lor="" de="" control="" corespunzătoare;="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01, ###p=""><0,001 în="" comparație="" cu="" celulele="" tratate="" cu="" mir-nc="" cu="" aceeași="" condiție="">

Fig. 4. MiR-150 și miR-495 sporesc represiunea FAO indusă de TGF 1-în celulele HKC-8. (A, B) Rata de consum de oxigen (OCR) a celulelor HKC-8 transfectate cu

40 nM miR-NC și mimic miR-150-5p (A) sau miR-495-3p (B) și expuse la 10 ng/ml TGF{{5} } după supraexprimarea miARN (vezi și secțiunea metode). Graficele cu bare (panourile din dreapta) arată ratele de OCR asociate cu capacitățile bazale, cu scurgeri de protoni, legate de ATP, maxime și de rezervă și stările respiratorii non-mitocondriale. Datele sunt reprezentate după normalizare prin cantitatea de proteine. (C, E) Nivelurile de ATP din celulele HKC-8 transfectate cu miR-NC și mimează miR-150-5p (C) sau miR-495-3p (E). (D, F) nivelurile de ARNm de CPT1A, PGC1A și TFAM în celulele HKC-8 transfectate cu miR-NC și miR-150-5p (D) sau miR{-495-3p (F) au fost determinat prin qRT-PCR folosind Sybr green. Graficele cu bare arată media ± sem a 4 experimente independente. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" în="" comparație="" cu="" condițiile="" de="" control="" corespunzătoare;="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01, ###p=""><0,001 în="" comparație="" cu="" celulele="" tratate="" cu="" mir-nc="" cu="" aceeași="" condiție="">

producția de anioni. Potențialul membranei mitocondriale (ΔΨm) generat de pompele de protoni (Complexele I, III și IV) este o componentă esențială în procesul de stocare a energiei în timpul fosforilării oxidative. Creșterea ΔѰm poate duce la perturbări redox mitocondriale, în timp ce scăderea acesteia determină o reducere a producției de ATP, compromițând viabilitatea celulară [254]. Anionul radical superoxid (O2•−) este un radical liber care poate fi generat în mitocondrii ca o consecință a scurgerii de electroni care poate apărea în mai multe etape ale ETC. Generarea de O2•− în matricea mitocondrială depinde, de asemenea, în mod critic de raporturile NADH/NAD plus și CoQH2/CoQ și de concentrația locală de O2 [255]. Supraproducția sa poate duce la pierderea homeostaziei redox mitocondriale prin diferite mecanisme, o afecțiune care a fost legată de multe stări patologice, inclusiv AKI și CKD [201]. ΔѰm a fost examinat cu colorantul TMRM și producția de anioni radicali superoxid cu colorant MitoSOX. În primul rând, am validat aceste teste prin tratamentul celulelor cu FCCP și CCCP ca martori negativi, pentru TMRM și respectiv MitoSOX, și Oligomicină și Antimicină A ca martori pozitivi, pentru TMRM și respectiv MitoSOX, în linia de celule umane HKC{{7} }. În cazul testului TMRM, tratamentul cu oligomicină a indus o creștere de 3-ori a mediei fluorescenței TMRM în comparație cu colorantul de control, în timp ce tratamentul cu FCCP a dus la o scădere de 9-ori. Antimicina A și CCCP au produs o creștere de 35-ori și, respectiv, o scădere de 2-ori, în testul MitoSOX (Fig. 3A și B suplimentare). Pentru a determina dacă efectele miR{-150 și miR{-495 asupra metabolismului mitocondrial au declanșat modificări ale acestor parametri, celulele HKC-8 au fost transfectate cu un miR{-150-5p sau miR{{17} }p mimic sau miR-NC corespunzător. Nu s-au găsit diferențe semnificative statistic în cuantificarea fluorescenței sondelor TMRM sau MitoSOX între condițiile de tratament cu miR-urile și miR-NC selectate (Figura 3C suplimentară).

Nivelurile MiR-150 și miR-495 nu sunt afectate în probele de plasmă și rinichi de la pacienții cu BRC. Am evaluat expresia miARN-urilor selectate în biopsiile de plasmă și rinichi de la pacienții cu CKD. Analiza biopsiilor de rinichi de la 26 de pacienți (Spitalul Ramn y Cajal) nu a arătat o corelație între gradul de fibroză și nivelurile miR-150-5p și, respectiv, miR{-495-3p (Fig. 4A și B suplimentare) . Nivelurile plasmatice circulante ale miR-150-5p, miARN cu cea mai mare expresie renală dintre cele două, au fost, de asemenea, determinate într-o cohortă de 100 de pacienți cu CKD (Hospital Príncipe de Asturias). Din cauza limitărilor în disponibilitatea probei, nu am putut determina valorile serice ale miR- 495-3p în această cohortă. Acești pacienți au fost împărțiți anterior în două subgrupe în funcție de evoluția funcției lor renale pe o perioadă de 24 de luni, astfel încât 50 de pacienți au prezentat mai puțin de 10 la sută din deteriorarea funcției renale, în timp ce restul dintre ei au prezentat o reducere de cel puțin 40 la sută a rinichilor. funcţie. Cuantificarea qRT-PCR a nivelurilor plasmatice de miR-150-5p nu a arătat o tendință clară către o expresie diferențială în cele două subgrupuri de pacienți (Figura suplimentară 4C).

4. Discutie

Descoperirea miARN-urilor ca regulatori cheie ai proceselor fiziopatologice a încurajat cercetările privind utilizarea lor ca agenți terapeutici în aproape orice cadru clinic, inclusiv bolile de rinichi [31]. Fibroza renală este un rezultat foarte răspândit al bolii renale cronice (IRC) cu independență de etiologie, iar prezența acesteia este un predictor clar al evoluției. Prin urmare, un efort semnificativ a fost dedicat identificării miARN-urilor legate de fibroza renală [32,33]. În acest studiu, ne-am concentrat asupra rolului din ce în ce mai important al tulburării metabolice înrenaldeteriorași am identificat doi miARN, miR-150 și miR-495, care au fost actori anterior necunoscuți în scenă. Mai mult, am descoperit că acestea exercită un efect profund asupra bioenergeticii celulare prin sinergie cu TGF- și prin modificarea căilor metabolice cheie legate de grăsimi.acid oxidare.

Leziunile epiteliale coexistă cu un defect al grăsimiloracidoxidare, principala sursă de energie pentru celulele epiteliale tubulare [5]. Ea duce la dediferențierea lor, inducend afectarea funcției tubulare, declanșând stoparea ciclului celular și promovând eliberarea de citokine pro-fibrotice critice care pot contribui la activarea miofibroblastelor interstițiale [5,34]. Expresia MiR-150 și miR{-495 a fost crescută la mousefibroticrinichisi inuman rinichicelule epiteliale (HKC-8) după tratamentul cu TGF-, sugerând implicarea lor în răspunsul pro-fibrotic. De interes, analiza in silico a regiunilor genomice care codifică miR-150 și miR{-495 permite identificarea site-urilor de legare pentru factorii de transcripție legați de semnalizarea TGF și alte căi implicate în deteriorarea UUO (căutări în genecards.org pentru miR-150 și miR{-495). Atât miR-150 cât și miR{-495 au scăzut nivelul de expresie al genelor lor țintă CPT1A, PGC1 și TFAM, ceea ce s-a reflectat într-o scădere a conținutului de OCR și ATP bazal, legat de ATP și maxim după tratamentul cu miR-150 și miR-495. Acest efect a fost însoțit de un răspuns TGF-profibrotic îmbunătățit în celulele HKC-8. Am descoperit că TGF-a scăzut masa mitocondrială și ADN-ul mitocondrial. După tratamentul cu miARN-150 și miARN-495, a fost observată o tendință de scădere a conținutului mitocondrial în condiții bazale, deși nu a atins semnificație. Acest lucru indică un mecanism independent de rolul PGC1 sau TFAM și cel mai probabil legat de un efect metabolic legat de reglarea în jos a CPT1A ca principală variabilă afectată de prezența miARN-urilor. Modificările bioenergetice mitocondriale sunt critice în bolile renale [35]. În continuare, am arătat recent că CPT1A este o enzimă critică pentru conservarea unui compartiment tubular sănătos, deoarece supraexpresia sa protejează de fibroza renală [6]. Cu toate acestea, PGC1

și genele TFAM sunt, de asemenea, strâns legate de funcția mitocondrială și biogeneză [36]. Expresia afectată a acestor gene este asociată cu CKD, în timp ce conservarea acesteia contribuie la integritatea rinichilor, așa cum se arată în mai multe modele de afectare. Astfel, Han et al. a constatat că câștigul de funcție tubular al PGC1 a protejat șoarecii împotriva fibrozei renale indusă de Notch și a inversat disfuncția mitocondrială asociată cu acest model [37]. În mod similar, re-exprimarea Tfam în celulele tubulare a prevenit reprogramarea metabolică și pro-fibrotică indusă de Notch [38]. Astfel, este de imaginat că scăderea expresiei ARNm a acestor gene mitocondriale, indusă de miR-150 și miR{-495, contribuie, de asemenea, la un fenotip epitelial deteriorat.

Scăderea pe care am observat-o în OCR asociată cu deteriorarea celulelor epiteliale este în conformitate cu rapoartele anterioare, inclusiv cu studiile noastre cu miR-33 și miR-9 [15,16]. În timp ce Kang și colab. a raportat, de asemenea, că oxidarea glucozei a fost mai mică în modelele umane și de șoarece de fibroză renală [5], datele noastre arată că scăderea OCR mediată de microARN nu induce per se variații în ECAR, sugerând că oprirea glicolitică în condiții fibrotice depinde cel mai probabil. pe stimulii fibrotici mai degrabă decât pe fosforilarea oxidativă afectată. Mai multe miARN-uri au fost identificate ca modificatori majori ai funcției mitocondriale, inclusiv miARN-ul pro-fibrotic arhetipal, miR-21 [39]. Suprimarea expresiei PPAR de către miR-21 a fost invocată ca un mecanism prin care acest miARN își exercită acțiunea pro-fibrotică. Pe lângă inhibarea FAO, genele țintă pentru miR-21 au indicat că acest miARN reduce la tăcere o gamă largă de procese mitocondriale. Alte exemple includ mir-9 [16], miR{-33 [15] și miR{-30e [40,41]. Cu toate acestea, din cunoștințele noastre, există puține rapoarte care abordează reglarea microARN a genelor CPT1A, PGC1 și TFAM în contextul fibrozei renale. Interesant este că microARN-214 care promovează tranziția epitelial-la-mezenchimală (EMT) în timpul fibrozei renale, vizează direct TFAM în celulele canceroase de colon [42]. Această represiune a fost raportată și pentru miR-590-3p [43]. Familia miR-29, unul dintre cei mai bine caracterizați regulatori ai producției de ECM în fibroza de organ, vizează direct PGC1, păstrând homeostazia cardiacă. Astfel, tăcere patologică a miR-29 duce la reglarea PGC1, generând modificări profunde în biogeneza mitocondrială care contribuie la boala cardiacă [44]. Deși datele noastre susțin în mod clar rolul miR-150 și miR{-495 în fibroza renală, ar fi necesare studii suplimentare in vivo pentru a confirma această afirmație.

Pentru a evalua integritatea lanțului de transport de electroni mitocondrial (ETC), ne-am concentrat pe două caracteristici: ΔѰm și producția de anioni radicali superoxid. Am observat că miR-150 și miR-495 nu au modificat acești parametri. Un ΔѰm stabil a fost necesar pentru viabilitatea celulei și amploarea sa variază între tipurile de celule [45]. Menținerea sa este strict reglată, deoarece o creștere a ΔѰm poate duce la perturbări în starea redox, în timp ce scăderea sa determină o reducere a producției de ATP și poate declanșa apoptoza. În studiul nostru, modificările ΔѰm au fost cuantificate cu colorantul fluorescent cationic TMRM, în timp ce producția de anioni radicali superoxid mitocondrial a fost măsurată cu colorantul fluorogen MitoSOX Red. Utilizarea acestor instrumente în condiții care afectează funcția renală nu este vizibilă în literatură. Cu toate acestea, în fața absenței modificărilor în studiul nostru, nu am urmărit în profunzime alte strategii pentru a evalua hormeza redox și, prin urmare, nu putem exclude faptul că acești miARN-uri pot altera tonul nucleofil sau funcția mai multor componente ale ETC.

În cadrul clinic, miR-150 a fost sugerat ca un miARN pro-fibrotic în nefrita lupică prin modularea semnalizării TGF [46,47], în timp ce miR-495 a fost asociat cu un rol protector în diabetul cardiac. fibroză [48]. Pentru a afla potențiala implicare a acestora în CKD, le-am evaluat nivelurile serice și parenchimatoase în două cohorte diferite de pacienți. Nivelurile serice ale miARN-urilor au fost propuse ca potențiali biomarkeri pentru progresia CKD [49,50]. Astfel, nivelurile serice de miR-21 circulante și abundența miR-29c în exozomii urinari se corelează cu fibroza renală, sugerând rolul lor potențial ca biomarkeri [51, 52]. Cu toate acestea, nivelurile miR-150 și miR{-495 nu au fost diferite nici în probele de plasmă, nici de rinichi de la pacienții cu BRC. Diferitele modele de expresie a microARN între specii și tipuri de celule pot explica această absență a diferenței în nivelurile miR-150 și miR{-495 în țesutul fibrotic [53]. În timp ce în unele cazuri, nivelurile plasmatice raportate de microARN ar putea să le reflecte pe cele din țesutul renal, ar trebui luate în considerare și alte mecanisme legate de secreția de miARN în sistemul circulator sau o contrabalansare a acestei secreții de către alte organe [13,54].

În general, rezultatele noastre susțin promovarea miR-150 și miR-495renalepitelialăcelulădediferențiere cel mai probabil prin privarea de energie, transmisă de reprimarea genelor legate de funcția mitocondrială CPT1A, PGC1 și TFAM. Ele oferă, de asemenea, o bază pentru a-și urmări rolul in vivo, precum și utilitatea lor potențială ca biomarkeri de diagnostic sau prognostic.

Contribuții ale autorului

SL a conceput și dirijat cercetarea. VM a proiectat, efectuat și analizat majoritatea experimentelor. RR a asistat la analiza matricei de microARN. DRP și LGB au efectuat studii pe două cohorte diferite de pacienți cu BRC. Toți autorii au ajutat la discutarea rezultatelor, iar SL și VM au scris manuscrisul.

Declarație de interese concurente

Autorii nu au conflicte de interese.

Mulțumiri

Această activitate a fost susținută de granturi de la Ministerul Spaniol al Științei SAF2015-66107-R și PID2019-104233RB-I{00 (SL), PI17/ 01513 (DRP) cofinanțate de European Fondul de dezvoltare regională, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 și RD16/0009/0016 (SL și DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid „NOVELREN” B2017/BMD3751 (SL și DRP), un grant în ajutor de la Societatea Spaniolă de Nefrologie (Fundacin Senefro 2017) către SL și FundacionRenal„Iigo Alvarez de Toledo” (SL) toate din Spania. CBMSO primește sprijin instituțional din partea Fundației „Ramn Areces”. VM a fost susținut de o bursă predoctorală a Programului FPI (BES- 2013-065986) de la Ministerul Spaniol al Științei.