Cititorul ARN M6 A YTHDF2 controlează imunitatea antitumorală și antivirală a celulelor NK Partea 2

YTHDF2 este necesar pentru funcția antivirală a celulelor NK

Pentru a determina dacă deficiența Ythdf2 afectează activitatea antivirală a celulelor NK, am injectat 2,5 × 104 PFU de MCMV în șoareci Ythdf2WT și șoareci Ythdf2ΔNK.

Rezultatele au arătat că șoarecii Ythdf2ΔNK au fost mai sensibili la infecția cu MCMV, așa cum este reprezentat de pierderea semnificativă în greutate și titrurile virale crescute în sânge, splină și ficat, comparativ cu șoarecii Ythdf2WT (Fig. 3, A și B; și Fig. S2, A și B) .

De asemenea, am observat o reducere semnificativă a procentului și a numărului absolut de celule NK totale în splina și sângele șoarecilor Ythdf2ΔNK în comparație cu cele la șoarecii Ythdf2WT după infecție (Fig. 3, C și D; și Fig. S2, C și D). O analiză ulterioară a arătat că celulele NK de la șoarecii Ythdf2ΔNK au avut o expresie semnificativ mai mică a Ki67 decât șoarecii Ythdf2WT (Fig. 3, E-G).

Cu toate acestea, viabilitatea celulelor NK a fost similară între șoarecii Ythdf2WT și șoarecii Ythdf2ΔNK, așa cum se arată prin colorarea cu anexină V (Fig. S2 E). Aceste date indică faptul că deficiența de YTHDF2 în celulele NK are ca rezultat un defect în proliferarea celulară, mai degrabă decât supraviețuirea celulară în timpul infecției virale. Celulele NK inhibă infecția cu MCMV prin receptorii activatoriLy49H și Ly49D, iar procesul este caracterizat printr-un răspuns antiviral mediat de perforină sau IFN (Arase și colab., 2002; Lee și colab., 2009; Loh și colab., 2005; Orr. et al., 2010; Sumaria et al., 2009).

Am descoperit că șoarecii Ythdf2ΔNK au redus semnificativ celulele Ly49H+ și Ly49D+ NK în splină și sânge în comparație cu șoarecii Ythdf2WT după infecție (Fig. 3, H-J; și Fig. S2, F-K).

O analiză ulterioară a demonstrat că, deși în procente, numai celulele Ly49D+Ly49H+ au arătat o diferență la șoarecii Ythdf2ΔNK în comparație cu cea a șoarecilor Ythdf2WT, numărul absolut de celule ale celulelor Ly49D−Ly49H+ NK, Ly49D+Ly49H−Ly49H+ și celulele NK+Ly49H-Ly4H+ și celulele NK+Ly49, splina și sângele au fost toate semnificativ scăzute la șoarecii Ythdf2ΔNK în comparație cu șoarecii Ythdf2WT după infecție (Fig. S2, L-W).

Datele noastre sugerează că controlul infecției cu MCMV de către YTHDF2 pare să fie mediat în principal de celulele NK Ly49D+Ly49H+. Producția de granzime B și IFN de către celulele NK la șoarecii Ythdf2ΔNK a fost comparabilă cu cea a șoarecilor Ythdf2WT (Fig. S2, X și Y).

Am găsit o reducere semnificativă a producției de perforină de către șoarecii Ythdf2ΔNK în comparație cu cea a șoarecilor Ythdf2WT atât în ​​splină, cât și în sânge la 7 zile după infecție (Fig. 3, K–M), indicând faptul că YTHDF2 afectează în principal activitatea antivirală mediată de perforină împotriva MCMV în celulele NK. Aceste date. sugerează că YTHDF2 este critic pentru expansiunea celulelor NK și funcția efectoră în timpul infecției cu MCMV.

YTHDF2 controlează homeostazia celulelor NK și maturarea terminală într-o stare de echilibru

Descoperirile de mai sus că deficiența de Ythdf2 în celulele NK a îmbunătățit metastazele tumorale și a afectat capacitatea celulelor NK de a controla infecția cu MCMV ne-au încurajat să investigăm dacă YTHDF2 este necesar pentru menținerea celulelor NK într-o stare de echilibru.

Așa cum se arată în Fig. 4 A, frecvența și numărul absolut de celule NK au fost reduse semnificativ în sângele periferic, splina, ficat și plămâni, dar nu și în măduva osoasă (BM) a șoarecilor Ythdf2ΔNK, comparativ cu șoarecii Ythdf2WT.

Cu toate acestea, nu au existat modificări semnificative între progenitorul limfoid obișnuit, progenitorul celulelor pre-NK și progenitorul celulelor NK rafinate (NKP) în BM (Fathman și colab., 2011) între șoarecii Ythdf2WT și Ythdf2ΔNK (Fig. S3 A), indicând faptul că Este posibil ca YTHDF2 să nu afecteze dezvoltarea timpurie a celulelor NK în modelul nostru.

Pentru a explora mecanismele potențiale responsabile pentru scăderea celulelor NK la șoarecii Ythdf2ΔNK, am investigat proliferarea celulară, viabilitatea și capacitatea de trafic a celulelor NK după ștergerea Ythdf2 la starea de echilibru. Procentul de celule NK în proliferare a fost comparabil între șoarecii Ythdf2WT și Ythdf2ΔNK, așa cum este demonstrat de colorarea Ki67 (Fig. S3 B).

Viabilitatea celulelor NK a fost, de asemenea, echivalentă între șoarecii Ythdf2WT și Ythdf2ΔNK, așa cum se arată prin colorarea anexinei V (Fig. S3 C). Pentru a verifica dacă YTHDF2 afectează ieșirea celulelor NK din BM la periferie, șoarecii Ythdf2WT și Ythdf2ΔNK au fost injectați iv cu un anticorp antiCD45 pentru a marca celulele imune și sacrificați după 2 minute, iar celulele lor BM au fost analizate.

Acest lucru ne-a permis să cuantificăm numărul de celule NK din regiunile sinusoidale versus parenchimatoase ale BM, un indicator al traficului de celule NK de la BM la sângele periferic în stare de echilibru (Leong et al., 2015). Rezultatele au arătat o reducere semnificativă a frecvenței celulelor CD45+ NK în Ythdf2ΔNK în comparație cu șoarecii Ythdf2WT în sinusoide (Fig. 4 B), indicând faptul că deficiența Ythdf2 afectează ieșirea celulelor NK din BM în sistemul de circulație in vivo .

Celulele imune sunt supuse proliferării homeostatice în timpul limfopeniei induse de anumite infecții virale sau cauzate de chimioterapie (Sun și colab., 2011). Deși am constatat că YTHDF2 este dispensabil pentru proliferarea celulelor NK la o stare de echilibru, am observat o scădere semnificativă a proliferării celulare în timpul infecției cu MCMV (Fig. 3, E-G). Prin urmare, am investigat rolul YTHDF2 în reglarea proliferării homeostatice a celulelor NK într-un cadru limfopenic in vivo.

Am cotransferat un număr egal de celule NK splenice de la șoareci CD45.2 Ythdf2ΔNK sau șoarecii congenici CD45.1 cu deficit de limfocite Rag2-/-Il2rg-/-. Rezultatele au arătat că o proporție mai mare de celule NK au fost derivate de la șoarecii de control CD45.1WT decât de la șoarecii CD45.2 Ythdf2ΔNK în ziua 3 după transferul de celule (Fig. S3 D).

O analiză ulterioară a demonstrat că reducerea celulelor NK de la șoarecii Ythdf2ΔNK s-a datorat proliferării celulare afectate (Fig. S3 E), dar nu apoptozei celulare (Fig. S3 F), sugerând că YTHDF2 conduce proliferarea homeostatică a celulelor NK in vivo în condiții limfopenice.

Diferențierea ulterioară a celulelor NK murine poate fi clasificată în stadii imature (CD11b-CD27+), mature intermediare (CD11b+CD{27+) și mature terminale (CD11b+CD27-) pe baza nivelurilor CD11b și CD27 ( Chiossone și colab., 2009; Geiger și Sun, 2016).

Am descoperit că expresia Ythdf2 a crescut odată cu maturarea și că CD11b-CD27+, CD11b+CD{27+, CD11b+CD27− au afișat nivelurile de expresie cele mai scăzute, intermediare și, respectiv, cele mai ridicate ale Ythdf2 (Fig. S3 G), indicând faptul că YTHDF2 poate fi implicat în maturarea celulelor NK. Prin urmare, am investigat rolul YTHDF2 în maturarea celulelor NK definită de markerii de suprafață celulară CD11b și CD27.

Am descoperit că pierderea Ythdf2 în celulele NK a dus la o scădere semnificativă a frecvenței celulelor NK mature terminale și/sau o creștere a celulelor NK mature imature și intermediare în splină, ficat, plămân și sânge, dar nu și în BM (Fig. 4 C și Fig. S3 H), indicând faptul că YTHDF2 reglează pozitiv maturarea celulelor NK terminale. În conformitate cu aceste date, nivelurile de KLRG1, care este markerul de maturare a celulelor NK aterminale, au fost semnificativ mai scăzute la șoarecii Ythdf2ΔNK în splină, ficat și plămân, dar nu BM în comparație cu cea a șoarecilor Ythdf2WT în organele corespunzătoare sau compartimentele de țesut (Fig. 4 D).

Pentru a determina dacă numărul scăzut de celule NK mature prin deficiența Ythdf2 este intrinsecă celulară, am creat himere la șoarecii Rag2−/−Il2rg−/− prin injectarea de celule BM de la șoareci CD45.1 WT și CD45.2 Ythdf2ΔNK, amestecate la un raport de 1:1. raport. După cum se arată prin citometria în flux la 8 săptămâni după transplant, o proporție redusă de celule NK mature terminale a fost derivată din celulele CD45.2 Ythdf2ΔNK BM decât cele din celulele de control CD45.1 WT (Fig. 4 E), sugerând că maturarea terminală a celulei NK este controlată de YTHDF2 este intrinsecă celulară.

Factorii de transcripție T-box Eomes și Tbet sunt critici pentru maturarea celulelor NK (Daussy și colab., 2014; Gordon și colab., 2012). Colorarea intracelulară a relevat o reducere semnificativă a nivelurilor de proteine ​​ale Eomes în celulele NK de la șoarecii Ythdf2ΔNK în comparație cu șoarecii Ythdf2WT (Fig. S3 I). În plus, am constatat că reducerea nivelurilor de proteine ​​și ARNm ale Eomilor a avut loc în mod specific în celulele NK mature terminale (CD11b+CD27-) (Fig. S3, J-L).

Cu toate acestea, spre deosebire de Eomes, expresia Tbet a fost echivalentă în celulele NK între șoarecii Ythdf2ΔNK și Ythdf2WT (Fig. S3, I și K), indicând faptul că YTHDF2 reglează eventual maturarea terminală a celulei NK prin țintirea Eomes.