Timpul și efectele ischemiei asupra fibrozei renale după nefrectomia contralaterală

Introducere

Incidenta deleziune renală acută(AKI) a crescut dramatic la nivel mondial în ultimii ani [1]. AKI poate fi cauzată de transplant de organe, postoperator sub perfuzie, sângerare, deshidratare, șoc și sepsis în practica clinică [2]. Studii epidemiologice și experimentale recente au arătat că severitatea, frecvența și durata AKI sunt strâns asociate cu incidența ulterioară aboală cronică de rinichi(CKD). Fibroza renală după AKI poate duce la CKD sau chiarboală de rinichi în stadiu terminal(ESKD) [3–5], ceea ce implică faptul că AKI și CKD sunt sindroame legate [6]. Cu toate acestea, mecanismele care stau la baza tranziției de la AKI la CKD rămân necunoscute, în ciuda numeroaselor studii experimentale și clinice. Modelele animale sunt instrumente importante pentru investigarea mecanismelor prin care AKI duce la CKD. Leziunea de ischemie-reperfuzie renală (IRI) este una dintre cauzele majore ale AKI și au fost dezvoltate mai multe modele animale de AKI indusă de IRI [7], inclusiv modelul IRI bilateral (bIRI), modelul IRI unilateral cu rinichi contralateral intact. , modelul uIRI cu nefrectomie contralaterală simultană și modelul uIRI cu nefrectomie contralaterală întârziată.

Modelul bIRI este mai puțin consistent, deoarece atunci când leziunea ischemică a ambilor rinichi este prea ușoară, nu există modificări fibrotice semnificative pe termen lung. Când AKI este prea severă, șoarecii pot muri în faza de leziune acută. În plus, mici diferențe în afectarea celor doi rinichi pot duce la diferențe semnificative în patologia renală cronică a acestora după câteva săptămâni [8,9]. Modelul uIRI cu nefrotomie contralaterală simultană este similar cu modelul bIRI deoarece rămâne doar rinichiul lezat din cauza nefrectomiei celeilalte părți [10]. În modelul IRI cu un rinichi contralateral intact, fibroza rinichiului ischemic este severă [11,12]. Acest model este foarte consistent și fiabil pentru observarea pe termen lung de către cercetători. Cu toate acestea, din cauza prezenței unui rinichi nedeteriorat contralateral, acesta nu poate fi utilizat pentru evaluarea ratei estimate de filtrare glomerulară (eGFR), creatininei serice (SCr) și azotului ureic din sânge (BUN) [11-14]. În comparație cu cele două modele uIRI menționate mai sus, modelul uIRI cu nefrectomie contralaterală întârziată depășește aceste probleme și poate fi utilizat atât pentru observații pe termen lung după AKI, cât și pentru monitorizarea funcției renale. Prin urmare, acest model este potrivit pentru studierea tranziției AKI-CKD [15].

CLICK AICI PENTRU A OBȚI EXTRACT DE CISTANCHE PENTRULEZIUNEA RENALE ACUTĂ

Cu toate acestea, diferitele stări ischemice și intervalul dintre nefrectomia controlaterală și uIRI pot avea un impact semnificativ asupra progresiei și severității CKD după AKI. Studiile anterioare s-au concentrat asupra efectului duratei ischemice asupra fibrozei renale post-AKI și nu au acordat prea multă atenție temperaturii centrale a corpului în timpul ischemiei. De exemplu, Skrypnyk și colab. [12] a controlat temperatura ischemică la 38 C printr-un sistem de baie de apă, cu o durată ischemică de 30 min, iar rinichiul intact contralateral a fost îndepărtat la 8 zile după uIRI. Rezultatul a arătat că rinichiul ischemic a avut modificări fibrotice semnificative la 28 de zile după uIRI. Cu aceeași durată ischemică, Xiao și colab. [8] au arătat că modificări fibrotice semnificative au avut loc la 11 zile după uIRI când temperatura ischemică a fost controlată la 37 C 38 C și intervalul de timp dintre uIRI și nefrectomia contralaterală a fost de 10 zile. Unii cercetători, cum ar fi Colombaro et al. [14] și Li și colab. [16] nu au menționat temperatura ischemică în studiile lor.

Între timp, puțini oameni au cercetat efectul intervalului de timp dintre nefrectomia contralaterală și uIRI în acest model, rezultând rezultate foarte variate între diferite laboratoare, care au afectat, de asemenea, în mod dramatic experimentele ulterioare. În acest studiu, am investigat efectele factorilor principali care afectează fibroza renală după AKI, inclusiv intervalul de timp dintre nefrectomia contralaterală și uIRI, temperatura centrală a corpului în timpul ischemiei și durata ischemică. Ne-am propus să oferim o referință pentru a realiza un model animal adecvat pentru studiul tranziției AKI CKD

Materiale și metode Modele animale

Șoarecii masculi C57BL/6J (cu vârsta de 8-10 săptămâni, aproximativ 22 g greutate; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, China) au primit acces gratuit la hrană și apă în Centrul de experimente cu animale al Universității Medicale Shanxi. Condițiile de reproducere au fost următoarele: umiditate 40–70%, temperatură 23 C, clasă de puritate a aerului 7, ciclu controlat de 12-h lumină/întuneric în condiții lipsite de agenți patogeni, iradiere cu Co60 de furaj și apă purificată. Toate procedurile pentru acest studiu au fost aprobate de Comitetul de etică a animalelor al celui de-al doilea spital al Universității Medicale Shanxi (număr de etică: DW2022028).

Protocoale

Având în vedere că duratele ischemice, temperaturile centrale ale corpului în timpul ischemiei și momentele de rezecție a rinichiului nevătămat contralateral pot avea toate impactul asupra severității AKI și a fibrozei renale ulterioare, am investigat efectele celor trei factori de mai sus în mod individual, cu ceilalți doi fix. Au fost efectuate trei experimente după cum urmează.

Protocolul 1: Pentru a observa efectul intervalului dintre nefrectomia controlaterală și uIRI asupra funcției renale și a fibrozei post-AKI, timpul de ischemie a rinichiului stâng a fost fixat la 24 min și temperatura centrală a corpului a fost fixată la 37 C în timpul rinichiului. ischemie intre timp. Rezecția rinichiului drept a fost efectuată în ziua 7, ziua 10 și, respectiv, ziua 14 (n=8 per grup) după IRI de rinichi stâng. Am determinat durata ischemiei și a rezecției renale pe baza rezultatelor studiilor anterioare [8,10,12,15] și a rezultatelor noastre pre-experimentale. Consultați Figura 1 (A-C) pentru protocolul de studiu.

Protocolul 2: Pentru a observa efectul temperaturii centrale a corpului în timpul ischemiei asupra tranziției AKI-CKD, timpul ischemic al rinichiului stâng a fost fixat la 24 de minute, iar rinichiul drept a fost îndepărtat la 14 zile după IRI rinichiului stâng. Temperatura centrală a corpului a fost controlată la 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C, respectiv 38 C (n=8 per grup). Consultați Figura 1 (D) pentru protocolul de studiu.

Protocolul 3: Pentru a observa efectul duratelor ischemice ale rinichilor asupra tranziției de la AKI la CKD, temperatura corpului central a fost fixată la 37 C în timpul ischemiei, iar rinichiul drept a fost îndepărtat la 14 zile după IRI de rinichi stâng. Am ales acest punct de timp pentru că fibroza renală, care a fost schimbarea tipică după AKI la CKD, a fost foarte evidentă conform rapoartelor [8,10,12,15] și a rezultatelor noastre pre-experimentale. Timpul ischemic al rinichiului stâng a fost controlat la 21 min, 24 min, 27 min și, respectiv, 30 min (n=8 per grup). Consultați Figura 1(E) pentru protocolul de studiu.

Toți șoarecii au fost eutanasiați la 8 săptămâni după IRI a rinichiului stâng. O parte din țesutul rinichiului stâng a fost depozitată la 70 C pentru analiza ulterioară RT-PCR și Western blot, iar cealaltă parte a fost fixată în formol neutru pentru analiza histopatologică. Probele de sânge au fost colectate prin sinusul retro-orbital pentru testare biochimică.

Figura 1. Protocoale ale leziunii ischemie-reperfuzie unilaterală (uIRI) cu nefrectomie contralaterală întârziată. (A–C): Rinichiul stâng a fost supus IRI în ziua 0, iar rezecția rinichiului drept a fost efectuată la diferite momente (ziua 7, ziua 10 și ziua 14) cu durata ischemică fixat la 24 min cu temperatura corpului fixată la 37 C în timpul ischemiei renale. (D): Rinichiul stâng a fost supus IRI în ziua 0, iar rezecția rinichiului drept a fost efectuată la diferite temperaturi de bază ale corpului (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C și 38 C) cu ischemic timpul rinichiului stâng a fost fixat la 24 min, iar rinichiul drept a fost îndepărtat la 14 zile după IRI de rinichi stâng. (E): Rinichiul stâng a fost supus IRI în ziua 0, iar rezecția rinichiului drept a fost efectuată la diferite durate ischemice (21 min, 24 min, 27 min și 30 min) cu temperatura centrală a corpului fixată la 37 C în timpul rinichiului ischemie, iar rinichiul drept a fost îndepărtat la 14 zile după IRI de rinichi stâng. Greutatea rinichilor, funcția rinichilor, leziunea histologică a rinichilor și fibroza renală au fost evaluate până în ziua 56.

Procedura chirurgicala

Înainte de operație, toți șoarecii au ținut post timp de 12 ore cu acces liber la apă și au fost injectați intraperitoneal cu 3% pentobarbital sodiu 50 mg/kg. În timpul anesteziei, temperatura rectală a fost menținută la 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C, sau respectiv 38 C, în diferite grupuri experimentale. Pentru a realiza acest lucru, mouse-ul a fost așezat cu spatele pe o pernă de încălzire (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Zhejiang, China) într-o poziție cu capul și gâtul extinse pentru a se asigura că căile respiratorii rămân. neobstrucționate, iar ochii au fost acoperiți cu tifon cald salin pentru a evita uscarea în timpul procedurii. După anestezie, părul din spatele stâng al mouse-ului a fost bărbierit cu aparatul de tuns. Pielea din zona chirurgicală a fost apoi ștersă cu un tampon cu alcool de 75%. În general, temperatura corpului șoarecelui scade după bărbierit. Procedura chirurgicală a fost efectuată când temperatura corpului a devenit constantă, ceea ce ar putea dura aproximativ 15 minute. Rinichiul stâng a putut fi văzut prin tăierea pielii dorsale stângi la 0,5 cm lângă linia mediană și la 0,5 cm la marginea inferioară a cutiei toracice a șoarecelui. Apoi am strâns abdomenul stâng cu o mână pentru a scoate rinichiul stâng din cavitatea corpului, am ridicat rinichiul cu pensă curbată tocită (având grijă să nu leteriorăm rinichiul), am desprins pediculul rinichiului și l-am prins rapid și am plasat cel clampat. rinichi sub piele pentru a-l menține cald și hidratat. Ischemia de succes a fost caracterizată printr-o schimbare treptată a culorii rinichiului de la roșu la violet închis, care a durat 21 min, 24 min, 27 min și, respectiv, 30 min, în diferite grupuri experimentale. Culoarea rinichilor a revenit la roșu în 2-5 minute după eliberarea clemei. Apoi am închis cavitatea abdominală cu suturi stratificate. Pielea dorsală dreaptă și mușchiul s-au incizat în ziua 7, ziua 10 și, respectiv, ziua 14 după uIRI, în diferite grupuri experimentale, iar rinichiul drept a fost rezecat. Apoi închideți rana cu suturi standard. După fiecare intervenție chirurgicală, 500 lL soluție salină au fost injectate intraperitoneal pentru a compensa pierderea de lichid în timpul intervenției chirurgicale. În același timp, mouse-ul a fost ținut pe o pernă de încălzire timp de aproximativ 2-3 ore până când a căpătat conștiința deplină înainte de a fi transferat în cușcă. Grupul de simulare nu a fixat pediculul renal, iar restul operațiilor chirurgicale au fost aceleași cu cele ale grupului uIRI. Toate operatiile chirurgicale au fost efectuate de aceeasi persoana cu o experienta de peste 2 ani in operarea acestui model.

Testul funcției renale

Nivelurile SCr au fost măsurate cu ajutorul Kit-ului de creatinină (Metoda Jaffe, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). Nivelurile BUN au fost măsurate prin trusa de uree (Metoda urează-glutamat dehidrogenază, Biosino Biotechnology and Science).

Analiza greutății rinichilor

După urinare, greutățile corporale ale șoarecilor au fost măsurate cu un cântar electronic de precizie. Rinichii proaspeți au fost clătiți de trei ori în soluție salină pre-răcită, apoi excesul de apă de pe rinichi a fost șters cu hârtie de filtru. Capsulele renale au fost decojite pe gheață și rinichii au fost cântăriți imediat. Raportul dintre greutatea rinichilor și greutatea corporală a fost calculat pentru a evalua greutatea corectată a rinichilor în mg/g.

Colorarea hematoxilină-eozină (HE) și scorul de leziune renală

Țesuturile renale neutre fixate cu formol au fost deshidratate în mod obișnuit, încorporate în parafină, secționate (3 ml) și colorate cu HE pentru a observa deteriorarea țesuturilor renale. Zece câmpuri selectate aleatoriu ale cortexului renal din fiecare secțiune au fost capturate cu microscopie luminoasă la o mărire de 400. Doi patologi au marcat separat leziunea glomerulului și a tubilor renali. Leziunea tubulară a fost punctată pe o scară de {{20}}–4 utilizând următoarele criterii [17]: 0, fără leziune; 1, afectând 1–25% din zona rinichilor; 2, care afectează 26–50% din zona rinichilor; 3, afectând 51–75% din zona rinichilor; și 4, care afectează 75–100% din zona rinichilor. Gradul de leziune tubulară a fost evaluat semicantitativ prin calcularea ariei leziunii tubulare renale. Leziunea glomerulară a fost evaluată și punctată pe o scară de la 0–4 în funcție de zona procentuală de expansiune mezangială sau scleroză folosind următoarele criterii [17]: 0, glomeruli normali; 1, 1–25% din zonă rănită; 2, 26–50% din zonă rănită; 3, 51–75% din zonă rănită; și 4, 76–100% din zonă rănită. Scorul final de afectare glomerulară ¼ 0 (% glomeruli de grad 0) þ 1 (% glomeruli de gradul 1) þ 2 (% glomeruli de gradul 2) þ 3 (% glomeruli de gradul 3) þ 4 (% glomeruli de gradul 4). S-au marcat peste 50 de glomeruli per șoarece.

Colorarea tricrom a lui Masson

Țesuturile renale neutre fixate cu formol au fost deshidratate în mod obișnuit, încorporate în parafină, secționate (3 ml) și colorate cu tricrom Masson pentru a observa fibroza renală. În feliile colorate cu tricrom ale lui Masson, douăzeci de câmpuri care nu se suprapun din cortexul renal au fost capturate la o mărire de 200. Software-ul de analiză a imaginilor Image-Pro Plus a fost utilizat pentru măsurarea și analiza automată. Procentul zonei fibrotice a fost utilizat pentru a determina nivelul de fibroză interstițială renală [8].

RT-PCR

ARNm total a fost extras din țesutul renal al fiecărui grup de către Trizol și concentrația acestuia a fost măsurată, apoi a fost convertit în cADN (Taka Reverse Transcription Kit). Metoda de fluorescență Taqman (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) a fost utilizată pentru a cuantifica expresiile ARN de fibronectină (FN) și colagen I (COL-I) în țesuturile renale. Primeri specifici au fost utilizați pentru FN (înainte: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 și invers: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30 ) și COL-I (înainte: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{{ {9}} și invers: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (furnizat de Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China). Condiţiile de amplificare sunt următoarele: 95 C pentru 30 s, 95 C pentru 5 s, 60 C pentru 30 s, 40 de cicluri; 95 C timp de 10 s, 65 C timp de 5 s și 95 C/5 C. După analizarea curbelor de amplificare și a curbelor de solubilitate ale produselor, nivelurile relative de ARNm au fost determinate prin metoda CT comparativă (2-DDCt) cu 18SrRNA (înainte: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 și invers: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) ca referință internă.

Western blot

Tampon de liză pentru testul de radio-imuno-precitare (RIPA) a fost utilizat pentru a liza țesuturile renale și concentrația de proteine ​​a fost determinată prin metoda BCA. Electroforeza pe gel cu gradient a fost utilizată pentru a separa proteinele din 50 lg de probe. Apoi proteinele au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză. După blocarea cu lapte degresat 5% timp de 2 ore, membranele au fost tamponate peste noapte la 4°C cu anticorp monoclonal de iepure anti-șoarece împotriva actinei a-musculare netede (a-SMA) (1:1000, No.19245, Cell Signaling Technology). ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam), sau respectiv COL-I (1:1000, No.72026, Cell Signaling Technology), respectiv. În ziua următoare, membranele au fost încălzite la temperatura camerei timp de 0,5 ore. După ce au fost spălate cu TBST, membranele au fost incubate cu HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-iepure IgG (H + L) (1:1000, No.BA1054, BOSTER Biological Technology) timp de 2 ore. După ce au fost spălate din nou cu TBST, au fost colorați cu reactiv de chemiluminiscență ECL de sensibilitate ultra-înaltă pentru a vizualiza imunoblot-urile. b-actina a fost măsurată pe aceeași membrană ca referința internă. Expresiile proteinelor au fost determinate prin cuantificarea expresiilor relative ale proteinelor țintă față de b-actina.

Date și analize statistice

Toate datele examinate sunt exprimate ca medie ± abatere standard. Comparațiile dintre cele două grupuri au fost accesate printr-un test t independent. Comparațiile dintre mai multe grupuri au fost accesate prin ANOVA unidirecțională atunci când distribuția datelor este normală și varianța este omogenă, ANOVA Welch a fost utilizată pentru a evalua semnificația statistică atunci când varianța a fost eterogenă, urmată de testul post-hoc al lui Tukey pentru comparații multiple. Toate analizele statistice au fost efectuate de software-ul GraphPad Prism 8.0. p < 0.05 a fost considerat a fi semnificativ statistic.