Astăzi, senescența celulară este considerată o reacție comună a aproape tuturor tipurilor de celule proliferante

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

AbstractEliminarea țintită a celulelor senescente, analiza, este una dintre tendințele de bază în terapia anti-îmbătrânire. S-a dovedit recent că glicozidele cardiace sunt senolitice cu spectru larg. Aici am testat proprietățile senolitice ale glicozidelor cardiace față de celulele stem mezenchimale umane (hMSC). Glicozidele cardiace nu au avut capacitatea senolitică față de hMSC senescente de diferite origini. Folosind abordări biologice și bioinformatice, comparăm dezvoltarea senescenței în HMSC-uri „sensibile la glicozide cardiace” A549 și „insensibile”. Sa constatat că absența analizei este mediată de importul eficient de potasiu și rezistența crescută la apoptoză în hMSC senescente. Slăbirea „apărării antiapoptotice” predispune hMSC la analiză. Am dezvăluit că rezistența la apoptoză, recunoscută anterior ca o caracteristică comună a senescenței, de fapt, nu este o caracteristică generală a celulelor senescente. Mai mult, numai celulele senescente de apoptoză-prolină sunt sensibile la analiza indusă de glicozide cardiace. Astfel, putem specula că eficacitatea analizei ar putea depinde de dacă celulele senescente devin într-adevăr rezistente la apoptoză în comparație cu omologii lor în proliferare.

Cuvinte cheieCelule stem. Senoliza·Senescenta·Apoptoza·Rezistenta la stres

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Introducere

Astăzi, senescența celulară este considerată o reacție comună a aproape tuturor tipurilor de celule în proliferare, inclusiv a celor canceroase și stem, precum și a unor celule post-mitotice la o varietate de stimuli stresanți [1-3]. Următoarele tipuri de senescență celulară pot fi distinse în funcție de originea factorului inductor: replicativă (datorită lezării ADN-ului la capetele telomerilor scurtate), indusă de oncogene (ca răspuns la activarea aberantă a semnalizării oncogene), indusă de stres ( mediată de deteriorarea ADN-ului cauzată de stresul oxidativ, șocul termic, radiațiile UV și Y etc.) și induse de chimioterapie (activată în celulele canceroase ca răspuns la medicamentele chimioterapeutice)[4-7]. Există eterogenitate în markerii exprimați de celulele senescente, în funcție atât de tipul de celulă, cât și de o insultă folosită pentru a induce senescența. Cu toate acestea, există câteva caracteristici comune tipice pentru majoritatea tipurilor de celule senescente. Caracteristica esențială a senescenței pentru orice tip de celulă în diviziune este pierderea ireversibilă de proliferare [8].extract de cistanche tubulosaIreversibilitatea opririi ciclului celular este controlată de inhibitorii de kinaza dependentă de ciclină (CDK) pl6 și p21 și este adesea reglată de proteina supresoare tumorală p53 [8,9]. Alte caracteristici importante ale celulelor senescente sunt activarea unui răspuns persistent de deteriorare a ADN-ului; hipertrofia celulară, care apare adesea ca urmare a afectarii biogenezei ribozomale și a sintezei proteinelor; perturbarea degradării lizozomale și disfuncția sistemelor de degradare în repaus; activitate crescută a enzimei lizozomale specifice- -galactozidazei asociate senescenței; diverse alterari mitocondriale; dobândirea fenotipului secretor asociat senescenței (SASP), compus din factori proinflamatori, enzime de degradare a matricei, specii reactive de oxigen etc.; modificări epigenetice și cromatinei peisajului, inclusiv formarea focarelor heterocromatice asociate senescenței și distensia sateliților asociată senescenței [8-10]. Cu alte cuvinte, celulele senescente păstrează activitatea metabolică și vitalitatea, dar funcționarea lor este modificată semnificativ în comparație cu celulele de origine.

Cistanche poate anti-imbatranire

Acum este clar că celulele senescente pot modifica micromediul înconjurător afectând atât celulele vecine, cât și nișele celulare, ceea ce poate duce la funcționarea defectuoasă a țesuturilor și, prin urmare, poate fi legată de progresia îmbătrânirii și a bolilor legate de vârstă [11,12]. Ținând cont de acest lucru, astăzi se acordă mai multă atenție strategiilor de „ucidere” țintită a celulelor senescente[13-15]. În acest scop, se dezvoltă activ o nouă clasă de medicamente numite senolitice. Senoliticele vizează căile de semnalizare care contribuie la rezistența celulelor senescente față de apoptoză, inducând astfel apoptoza în mod preferențial în celulele senescente[16]. Lista senoliticelor se completează în mod constant cu agenți noi. Cei mai cunoscuți compuși cu activitate senolitică declarată sunt navitoclax (inhibitorul familiei Bcl-2), o combinație de dasatinib (un inhibitor al multiplelor tirozin kinaze) și quercetină (un flavonol natural), inhibitori Hsp90, inhibitori MDM2, FOXO{ {8}}Peptidă de interferență p53, un degradator al proteinei din familia BET, CAR-T specific uPAR, navitoclax galacto-conjugat și diverși compuși naturali senolitici[16-24]. Recent, folosind screening-ul de droguri cu randament ridicat, două grupuri independente de cercetare au identificat glicozidele cardiace, în special ouabaina, digoxina și bufalina, ca senolitice cu spectru larg [25,26].comentarii cistanche tubulosaEste de menționat că aproape toate senoliticele declarate au limitări, cum ar fi efecte secundare nedorite sau ineficacitate față de unele tipuri de celule. Celulele stem mezenchimale (MSC), care se găsesc practic în toate organele/țesuturile postnatale, se caracterizează prin capacitatea de a se auto-reînnoi (diviziuni simetrice) și de a se diferenția, contribuind astfel la menținerea și regenerarea țesutului rezident [27]. Datorită acestor proprietăți unice, împreună cu funcțiile antiinflamatorii și imunosupresoare puternice, MSC-urile sunt aplicate pe scară largă în terapia de înlocuire celulară pentru tratamentul diferitelor boli, inclusiv diabetul zaharat, scleroza multiplă, infarctul miocardic și așa mai departe [28]. Cu toate acestea, similar descendenților lor diferențiați și altor celule unipotente, MSC-urile sunt capabile să senesceze fie replicativ, fie prematur, ca răspuns la activarea oncogenelor și stimuli stresanți [29, 30]. Senescența MSC-urilor are o mulțime de consecințe nedorite, printre care se numără epuizarea. a grupului de celule stem, întreținerea și regenerarea țesuturilor reduse, capacitatea de diferențiere afectată, răspândirea senescenței mediată de SASP, proprietăți angiogene reduse, modificarea nișei de celule stem [29,31-33]. Ținând cont de semnificația biologică a funcționării corecte a MSC-urilor, MSC-urile senescente ar putea fi considerate ținta crucială pentru analiză. În conformitate cu această sugestie, în ultimul an au fost publicate o serie de recenzii care evidențiază posibilele rezultate avantajoase ale îndepărtării MSC-urilor senescente [29, 31, 34, 35]. Cu toate acestea, există doar câteva date experimentale referitoare la această problemă [36-40].

În cadrul prezentului studiu, demonstrăm pentru prima dată că glicozidele cardiace, și anume ouabaina și bufalina, nu reușesc să prezinte activitate hemolitică față de MSC-urile umane (hMSC) derivate din endometru (END-MSC), țesutul adipos (AD-MSC), pulpă dentară (DP-MSCs) și Warton jeleu (WJ-MSCs). În plus, confirmăm că ambele glicozide cardiace sunt capabile să inducă apoptoza în mod preferențial în senecent A549 și SK-HEP-1, așa cum a fost descris anterior în studiile pilot [25,26]. Evaluând modificările homeostaziei ionice cauzate de blocarea Nat/K plus -ATPazei și nivelurile de expresie ale genelor înrudite, dezvăluim că absența analizei induse de ouabaină ar putea fi mediată de eficacitatea sporită a importului compensator de K plus în END-ul senescent. MSC-uri în comparație cu A549 senescent. Mai mult, folosind bioinformatica avansată, demonstrăm că senescența END-MSC-urilor, rezistente la analiza indusă de ouabaină, este însoțită de dobândirea fenotipului rezistent la apoptoză, în timp ce senescența A549 sensibilă la ouabaină nu este. Important, blocarea activității proteinei antiapoptotice MCL-1 înainte de tratamentul cu glicozide cardiace a dus la analiza END-MSC senescente rezistente la apoptoză. Prin urmare, oferim dovezi clare că rezistența la apoptoză nu este o caracteristică generală a celulelor senescente. Pe baza datelor obținute, concluzionăm că eficacitatea abordărilor analitice ar putea depinde de dacă celulele au devenit într-adevăr rezistente la apoptoză în timpul dezvoltării senescenței.

Materiale și metode

Celulele

END-MSC, WJ-MSC, DP-MSC, AD-MSC, A549 și SK-Help au fost obținute din Colecția Rusă de Culturi de Celule (Institutul de Citologie, Saint-Petersburg, Rusia). Liniile A549 și SK-Help au fost autentificate prin teste de cariologie, tumorigenicitate, izoenzime (LDH și G6PD) și analiză STR. Celulele au fost cultivate în mediu complet DMEM F12 (Gibco BRL) suplimentat cu 10% FBS (HyClone), 1% penicilină-streptomicina (Gibco BRL) și 1% glutamic (Gibco BRL). Toate celulele au fost testate în mod obișnuit pentru contaminarea cu micoplasmă.

Condiții care induc senescența și stresul

Pentru senescența indusă de stres oxidativ, END-MSC/WJ-MSC au fost tratate cu 200 uM/100 uM HO (Sigma) timp de 1 oră. Pentru senescența indusă de doxorubicină, DP-MSC/A549 au fost tratate cu 1 μM de doxorubicină (Veropharm) timp de 3 zile. În fiecare caz, celulele au fost considerate senescente nu mai devreme de 14 zile după tratament. Pentru senescența replicativă, AD-MSC-urile anterioare celui de-al 4-lea pasaj au fost identificate ca celule de control și mai târziu de al 10-lea ca fiind senescente. Pentru senescența indusă de etoposide, A549/END-MSC/SK-Help au fost tratate cu 2 uM/5 uM/3 uM etoposidă (Veropharm) timp de 3 zile și analizate nu mai devreme de 7 zile după inducerea senescenței. În acest caz, designul tratamentului a coincis complet cu cele descrise în studiul din care provin datele ARN-seq (Wang et al., 2017). Două glicozide cardiace am aplicat ca compuși senolitici - Ouabain (Sigma) și Bufalin (Calbiochem).

Pentru a compara rezistența la stres între control și END-MSC-urile senescente sau A549, celulele au fost tratate fie cu 400/800 uM H O2(Sigma) timp de 1 oră, fie cu 0,3/1 uM staurosporină (Sigma). Viabilitatea celulară a fost analizată la 48 de ore după inducerea stresului.

Pentru a bloca activitatea MCL-1, END-MSC-urile au fost pretratate cu 10 uM de A-1210477(Sigma) timp de 3 zile.

Analiza citometriei în flux

Măsurătorile viabilității celulare, proliferării, mărimii celulei, auto-fluorescenței, ratelor de apoptoză, scindarea caspazei 3/7, potențialul membranei mitocondriale și depolarizarea membranei au fost efectuate prin citometrie în flux. Citometria în flux a fost efectuată utilizând CytoFLEX (Beckman Coulter) și datele obținute au fost analizate folosind software-ul CytExpert versiunea 2.0. Celulele aderente au fost clătite de două ori cu PBS și recoltate prin tripsinizare. Celulele detașate au fost reunite și resuspendate în mediu proaspăt și apoi numărate și analizate pentru autofluorescență. Pentru a accesa viabilitatea celulară, 50 ug/ml iodură de propidiu (Life Technologies) a fost adăugată la fiecare probă chiar înainte de analiză. Mărimea celulei a fost evaluată prin împrăștierea citometrică a luminii înainte a celulelor PI-negative. Inducerea apoptozei a fost verificată folosind co-colorarea cu Annexin-V-APC (Invitrogen) și DAPI (Sigma), urmând instrucțiunile producătorului. Activitatea caspazei a fost evaluată utilizând kitul de test CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay (Invitrogen) conform protocolului de fabricație. Pierderea potențialului membranei mitocondriale a fost evaluată folosind colorantul ratiometric JC-1 (Invitrogen). Procedura de colorare a fost efectuată în conformitate cu protocolul producătorului. Pentru depolarizarea membranei, am folosit o sondă fluorescentă DiBAC4(3) (Invitrogen).

Colorarea cu galactozidază asociată senescenței

Colorarea cu galactozidază (SA{2}}Gal) asociată senescenței a fost efectuată utilizând un kit de colorare cu galactozidază a senescenței (Cell Signaling Technology) conform instrucțiunilor producătorului. Analiza cantitativă a imaginilor a fost realizată cu aplicarea pachetului MatLab, conform algoritmului descris anterior[41]. Pentru fiecare punct experimental, au fost analizate nu mai puțin de 50 de celule selectate aleatoriu.

Western blot

Western blot a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [41]. Electroforeza SDS-PAGE, transferul pe o membrană de nitroceluloză și imunobtajarea cu detecție ECL (Thermo Scientific) au fost efectuate conform protocoalelor standard ale producătorului (Bio-Rad Laboratories). Au fost utilizați anticorpi împotriva următoarelor proteine: gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) (clona 14C10), fosfo-p53 (Ser15), p21 (clona 12D1), fosfo-Rb (Ser807/811) , HMGB1 (clona D3E5), precum și IgG de capră antiiepure conjugată cu peroxidază de hrean. Ratele de diluție au fost 1:1000 pentru toți anticorpii primari și 1:7000 pentru cei secundari. Toți anticorpii au fost achiziționați de la Cell Signaling. Scion Image 4.0 (Scion Corporation) a fost utilizat pentru a selecta și determina densitatea scăzută de fundal a benzilor din toate gelurile și petele.

Analiza transcriptomică

În analiză au fost utilizate probe din următoarele trei seturi de date Gene Expression Omnibus (GEO)ARN-seq: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 și GSM2742121-GSM2742122forcontrol și senescentA549cells, în consecință); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 și GSM3454500-GSM3454502 pentru celule de control și IMR-90 senescente, în consecință); și setul nostru de date GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 și GSM4877907-GSM4877910 pentru control și, respectiv, END-MSC senescente). Datele pentru toate seturile de date au fost prelucrate în același mod.

Datele de citire brute au fost supuse unor filtrari de calitate și decupări ale adaptorului prin scripturile FilterByTile și BBDuk din pachetul BBtools (versiunea 38.75) folosind opțiunile implicite. Citirile rămase au fost filtrate și tăiate suplimentar cu ajutorul unui script trimestrial din pachetul FastqPuri (versiunea 1.0.7).cistanche UKOperația de tăiere a fost aplicată pentru ambele capete ale citirilor dacă acestea conțineau N sau calitatea lor a fost sub pragul de calitate setat la 27, toate citirile mai scurte de 25 de baze au fost eliminate. Controlul calității tăierii a fost efectuat cu software-ul FastQC (versiunea 0.11.7) și scripturile FastqPuri. Citirile, după ce au trecut toate operațiunile, cuprind nu mai puțin de 90 la sută din datele inițiale.

Abundența transcripției a fost estimată utilizând maparea ușoară Salmon (versiunea 1.1.0) care rulează în modul de aliniere selectivă. Lista de momeli a fost generată pe baza genomului de referință uman Gencode GRCh38.p13 (ediția 33) și a fost utilizată în continuare pentru construirea indexului pe fișierele de referință concatenate ale transcriptomului și genomului Gencode (ediția 33) folosind o dimensiune kmer de 21. Operațiunile de cartografiere au fost executate cu steaguri suplimentare——numBootstraps 30——paiete——gcBias——validează mapările. Ratele de cartografiere rezultate au fost în jur de 70 la sută.

Prelucrarea ulterioară a datelor a fost efectuată utilizând versiunea R 3.6.3 cu colecția de pachete Tidyverse (versiunea 1.3.0). Numărul estimat de gene, metadatele și intervalele de transcriere au fost încărcate în R și rezumate la un nivel de genă folosind tximeta (versiunea 1.4.5). Matricea de numărare rezultată a fost filtrată pentru a conține rânduri având cel puțin 5 numărări estimate în toate probele, matricea rezultată conținea 20.400 de gene.

Pentru reprezentarea PCA și hărțile termice, numărul de citire a fost normalizat folosind transformarea jurnalului din pachetul DESeq2 (versiunea 1.26.0).cistanche wirkungHărțile termice au fost construite folosind pachetele filtru genetic (versiunea 1.38.0) și hărțile (versiunea 1.0.12)R. Validarea eșantioanelor de diviziune în funcție de variabila de senescență a fost efectuată prin subsetarea numărătorilor de citire normalizate după gene legate de termenul de ontologie genică „senescență celulară” (GO 0090398). Analiza expresiei diferențiale și estimarea modificărilor log fold au fost calculate utilizând DESeq2 pentru ultima variabilă din formula de proiectare de control pentru starea senescenței celulelor, reacția la tratamentul cu ouabain și interacțiunea factorilor indicați. Pentru a consolida testarea expresiei diferențiale, s-a aplicat corecția modificării log fold folosind o combinație de estimator de contracție adaptiv din pachetul palm (versiunea 1.8.0) și specificând un prag suplimentar de modificare log fold egal cu 0,667. Estimările reduse rezultate au fost utilizate în continuare pentru clasarea genelor și pentru rularea analizei de îmbogățire a seturilor de gene utilizând pachetele de profil cluster (versiunea 3.14.3) și fuze (versiunea 1.12.0) R cu valorile p ajustate pentru comparații multiple conform metodei Benjamin-Hochberg. Probele de microarray Affymetrix pentru control și AD-MSC-uri senescente au fost obținute din baza de date GEO (GSE66236) și procesate cu aplicația web Phantasus cu normalizare log2 și cuantile. Analiza îmbogățirii setului de gene a fost efectuată cu ajutorul unui pachet de siguranță (versiunea 1.12.0)R.

Extracția ARN, transcrierea inversă și PCR în timp real

Extracția ARN, transcripția inversă și PCR în timp real au fost efectuate așa cum este descris în studiul nostru anterior [32]. Reactivi pentru extracția ARN (reactiv ExtractRNA), transcrierea inversă (kit MMLV RT) și PCR în timp real (kit HS SYBR) au fost obținuți de la Evrogen. Nivelurile de expresie genică au fost evaluate utilizând amplificatorul PCR BioRad CFX-96 în timp real (BioRad) cu următorul program de rulare pentru toate genele investigate: 40 de cicluri de topire timp de 10 s la 95 grade, recoacere timp de 15 s la 57,5 ​​grade , și sinteza timp de 15 s la 72 de grade . Analiza curbelor de topire a fost aplicată pentru a controla specificitatea reacțiilor. Următoarea analiză a datelor obținute a fost efectuată folosind software-ul Bio-Rad CFX Manager (BioRad) cu metoda standard de cuantificare 2deltaCt cu utilizarea expresiei GAPDH ca referință. Secvențele de primer sunt enumerate în tabelul 1.

analize statistice

Pentru a obține semnificația diferenței dintre cele două grupuri a fost aplicat testul t Student sau testul t Welch. Pentru comparații multiple între grupuri, a fost utilizat ANOVA cu HSD Tukey. Dacă nu se indică altfel, toate datele cantitative sunt afișate ca medie ± SD, iar asteriscurile indică diferențe semnificative după cum urmează: ns, nesemnificativ,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Rezultate

END-MSC tratate cu H2O2-intră în senescență prematură

În cadrul prezentului studiu, am folosit celule stem mezenchimale umane izolate din endometrul descuamat (END-MSCs), care îndeplinesc criteriile minime sugerate de ISCT pentru definirea hMSCs [41]. Anterior, am dezvoltat un model experimental de încredere pentru a studia diferite aspecte ale senescenței premature a END-MSC [30]. Și anume, am arătat că END-MSC-urile supuse stresului oxidativ subletal au dobândit treptat toate trăsăturile tipice ale celulelor senescente, inclusiv focarele persistente de deteriorare a ADN-ului și răspunsul activ la deteriorarea ADN-ului, oprirea ireversibilă a ciclului celular mediată de p53/p21/Rb clasic. cale, pierderea proliferării, hipertrofia celulară, apariția colorării SA- -Gal și dezvoltarea fenotipului secretor asociat senescenței [30, 32, 42]. Aici am aplicat modelul proiectat pentru a studia efectul senolitic al ouabainei, precum și pentru a dezvălui modificările intracelulare subiacente în homeostazia ionică. Inițial, prin estimarea celor mai comuni parametri, am confirmat că tratamentul cu doză unică (1 oră, 200 μM) H2O a fost suficient pentru a induce senescența în END-MSC. Important, END-MSC stresate au fost considerate senescente la două săptămâni după stresul oxidativ; prin urmare, toți markerii de senescență au fost evaluați nu mai devreme de 14 zile după tratamentul cu H-Oz. Într-adevăr, tratamentul cu H-Oz al END-MSC a condus la blocarea proliferării, hipertrofia celulară, așa cum este indicată de mărimea celulelor crescute, acumularea de lipofuscină detectată prin creșterea autofluorescenței, apariția SA- -Gal, activarea Calea p21/Rb și pierderea HMGB1 împreună susțin stabilirea senescenței în condițiile experimentale alese (Fig. ac, e, f).

Se crede că cele mai dăunătoare efecte ale celulelor senescente la nivel de țesut și organism sunt consecința vitalității lor prelungite. În conformitate cu acest punct, END-MSC-urile tratate cu HO5 și-au păstrat o viabilitate ridicată chiar și în etapele târzii ale dezvoltării senescenței (viabilitatea END-MSC senescente a fost evaluată la 17 zile (14 zile + 3 zile) după stresul oxidativ inițial) (Fig. 1d ). În concluzie, tratamentul subletal HO2- al END-MSC-urilor este modelul adecvat al senescenței premature și este relevant pentru a investiga efectele compușilor senolitici asupra END-MSC.

Glicozidul cardiac ouabain nu are activitate senolitică față de END-MSC senescente într-un interval larg de concentrații

Dovezi recente sugerează că glicozidele cardiace, inclusiv ouabaina, digoxina și bufalina, reprezintă o familie de compuși cu activitate hemolitică [25,26]. Chiar dacă astăzi glicozidele cardiace sunt considerate senolitice cu spectru larg, lipsesc datele privind efectele lor asupra hMSC senescente. Prin urmare, aici am testat dacă ouabaina are potențialul de a induce moartea selectiv în END-MSC senescente. Pentru a face acest lucru, am evaluat viabilitatea controlului și a END-MSC-urilor senescente după tratamentul cu ouabain la un interval larg de concentrații (de la 10-' la 10 ~ M). Interesant, nicio concentrație aplicată nu a condus la o scădere vizibilă a viabilității atât a celulelor de control, cât și a celulelor senescente în prima zi după aplicarea ouabainului (Fig.2 și Suplimentar Fig.S1).

Cu toate acestea, în a treia zi după tratamentul cu ouabain, am dezvăluit o scădere semnificativă dependentă de doză a viabilității END-MSC-urilor de control (Fig. 2a și Suplimentar Fig. S1). În mod neașteptat, celulele senescente s-au dovedit a fi mai rezistente la ouabaină la fiecare concentrație testată. În conformitate cu acest rezultat,10-M ouabaina a condus la moartea apoptotică mai predispusă în celulele de control (20,75 la sută An plus /PI-și 36,47 la sută An plus /PI plus) în comparație cu cele senescente (15,01 la sută An+/PI). -și 12,15 la sută An plus /PI plus )(Fig.2b). Rezultatele obținute demonstrează în mod clar că, în contextul END-MSC senescente, ouabainul nu are activitate senolitică.

Pentru a exclude posibilele efecte asociate cu variabilitatea stimulilor care induc senescența asupra acțiunii senolitice a ouabainei, am efectuat un set suplimentar de experimente. Și anume, am tratat END-MSC-urile cu etoposidă în loc de stres oxidativ pentru a induce senescența prematură.bioflavonoide din citriceEND-MSC-urile tratate cu etoposidă au afișat toate caracteristicile tipice pentru celulele senescente (Fig. 3a-e).

Este important că ouabainul nu a avut acțiune hemolitică față de END-MSC senescente tratate cu etoposidă (Fig. 3f și Supple-mental Fig. S2). Aceste date oferă o confirmare suplimentară pentru rezultatele de mai sus și dovezi că lipsa analizei induse de ouabaină nu este consecința declanșatorului concret de senescență utilizat pentru a induce senescența.

Fig.1 Validarea modelului de senescență prematură a END-MSC induse de stresul oxidativ. END-MSC senescente a proliferare laxă, b suferă hipertrofie, c dobândesc autofluorescență crescută, păstrează viabilitate celulară ridicată și e afișează activitate SA- -Gal în comparație cu cele de control. f Nivelurile de fosforilare ale p53 și Rb și nivelurile de expresie ale proteinelor p21 și HMGBI în control și senescent END-Ouabain nu are acțiune hemolitică față de celulele stem mezenchimale umane de diverse origini Pentru a extinde observațiile noastre cu privire la absența analizei induse de ouabaină în END-MSC , am analizat efectele ouabainului asupra hMSC-urilor izolate din alte surse, inclusiv țesutul adipos, pulpa dentară și jeleul Wharton. Pentru a consolida în plus datele noastre, am aplicat diferite modele de senescență - senescență replicativă pentru AD-MSC, senescență indusă de doxorubicină pentru DP-MSC și senescență indusă de stres oxidativ pentru WJ-MSC (Fig. 4a-f).

După cum se arată în Fig. 4g, diferite tipuri de hMSC au fost diferite în ceea ce privește viabilitatea la tratamentul cu ouabain, de exemplu, atât controlul, cât și cel senescent, DP-MSC-urile au fost mult mai rezistente la acțiunea ouabainului decât WJ-MSC (Fig. 4g și Fig. Suplimentar S3b, c). Cu toate acestea, ouabain nu a fost capabil să inducă senoliza în niciunul dintre tipurile de hMSC senescente (Fig. 4g și Suplimentar Fig. S3). Împreună, datele obținute demonstrează că absența analizei induse de ouabaină este o caracteristică comună pentru diferite tipuri de hMSC. MSC-uri. Valorile prezentate sunt medii±SD. Pentru comparații de grupuri multiple la a și d, s-a aplicat ANOVA unidirecțional, n=3, ns nu este semnificativ,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH a fost folosit ca control al încărcării

Bubalinul glicozid cardiac nu reușește să omoare END-MSCS senescent

Pentru a verifica absența acțiunii senolitice a glicozidelor cardiace față de hMSC, am aplicat bufalină, un alt compus cu activitate senolitică declarată aparținând familiei glicozidelor cardiace [25]. Bufalina nu a avut aproape niciun efect asupra viabilității controlului și a MSC-urilor END-secencente tratate cu H2O2-într-un interval larg de concentrații (de la 10-7 la 10-5 M) (Fig. 5a și Suplimentar) Fig. S4a).

Similar cu ceea ce am observat pentru tratamentul cu ouabain, absența analizei asupra bufalinei a fost independentă de stimulii care inducă senescența, deoarece viabilitatea ESC care au senescență fie ca răspuns la stresul oxidativ, fie la etoposidă nu a fost afectată (Fig. 5a, b, Fig. Suplimentar). S4a, b). Rezultatele descrise mai sus confirmă că glicozidele cardiace s-au dovedit a fi ineficiente pentru inducerea țintită a morții în END-MSC senescente. MSC-uri. Valorile prezentate sunt medii±SD. Pentru comparații de grupuri multiple la a și d, s-a aplicat ANOVA unidirecțional, n=3, ns nu este semnificativ,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Bubalinul glicozid cardiac nu reușește să omoare END-MSCS senescent

Pentru a verifica absența acțiunii senolitice a glicozidelor cardiace față de hMSC, am aplicat bufalină, un alt compus cu activitate senolitică declarată aparținând familiei glicozidelor cardiace [25]. Bufalina nu a avut aproape niciun efect asupra viabilității controlului și a MSC-urilor END-secencente tratate cu H2O2-într-un interval larg de concentrații (de la 10-7 la 10-5 M) (Fig. 5a și Suplimentar) Fig. S4a).

Similar cu ceea ce am observat pentru tratamentul cu ouabain, absența analizei asupra bufalinei a fost independentă de stimulii care inducă senescența, deoarece viabilitatea ESC care au senescență fie ca răspuns la stresul oxidativ, fie la etoposidă nu a fost afectată (Fig. 5a, b, Fig. Suplimentar). S4a, b). Rezultatele descrise mai sus confirmă că glicozidele cardiace s-au dovedit a fi ineficiente pentru inducerea țintită a morții în END-MSC senescente.

Fig.2 Ouabain nu are activitate hemolitică față de END-MSC-urile tratate cu HO2-senescent într-un interval larg de concentrații. Viabilitatea relativă a celulelor (procentaj) a END-MSC-urilor de control și senescente în 3 zile după tratamentul cu 1077,10~6,10-5 M ouabain. b Inducerea apoptozei în END-MSC după 10-6 M ouabaină evaluată prin dublă colorare cu anexină V/DAPI. n=3 experimente independente. Toate datele corespund cu media ± SD. Semnificația statistică a fost evaluată prin testul t al lui Welch: ns nu este semnificativ,***p<>

Atât glicozide cardiace, ouabain, cât și bufalină, sunt capabile să inducă moartea celulară în mod selectiv în celulele senescente A549 și SK-Hep1.

Ținând cont de faptul că rezultatele noastre nu corespund cu dovezile publicate recent privind acțiunea senolitică cu spectru larg a glicozidelor cardiace, am decis să reproducem acest efect folosind modelul celular descris în studiile relevante [25,26]. Astfel, am efectuat o serie de experimente folosind celule de carcinom pulmonar A549 de control și senescente. Senescența în celulele A549 a fost indusă prin tratamentul cu etopozidă. Senescența indusă de etoposide a celulelor A549 este un model frecvent utilizat și, prin urmare, bine caracterizat de senescență indusă de terapie [4]. De asemenea, sa demonstrat că ouabainul ucide selectiv celulele A549 senescente tratate cu etoposidă[25]. Pentru a dovedi senescența în A549, am evaluat rata de proliferare, dimensiunea celulei, acumularea de lipo-fină, colorarea SA- -Gal, starea de activare. a căii p53/p21/Rb și nivelul de expresie al HMGB1 (Fig. 6a-e).

Pentru a verifica activitatea hemolitică a ouabainului față de celulele canceroase senescente, am estimat mai întâi viabilitatea celulară dependentă de doză. În conformitate cu rezultatele noastre descrise mai sus, nu am reușit să detectăm nicio scădere semnificativă a numărului de celule A549 de control viabile sau senescente în 24 de ore după aplicarea ouabainului (Figura suplimentară S5a). Cu toate acestea, în 3 zile după tratament, ouabain a redus semnificativ viabilitatea celulelor senescente A549 într-o manieră dependentă de doză, în timp ce numărul de celule de control A549 a scăzut într-o măsură mult mai mică (Fig. 7a și Suplimentar Fig. S5a). Și anume, aproximativ 90% din celulele de control și-au păstrat viabilitatea la 10- M ouabain, comparativ cu 50% din celulele A549 senescente tratate cu aceeași doză (Fig.7a). Mai mult, celulele A549 senescente au fost mai predispuse la moartea celulelor induse de bufalină decât omologii lor de control (Fig. 7b) (Fig. 5b și Suplimentar Fig. S5b).

Conform datelor publicate, ouabain a declanșat apoptoza dependentă de caspază-3-în celulele A549 senescente [26]. Într-adevăr, am dezvăluit o creștere semnificativă a fracțiunii duble pozitive și/sau PI în celulele canceroase senescente tratate cu 10-6M ouabain (Fig.7c). În plus, folosind testul fluorescent, am observat activarea caspazei -3 în celulele A549 senescente tratate cu ouabain (Fig. 7d). Luate împreună, aceste rezultate sunt complet în concordanță cu datele descrise de alți autori și confirmă activitatea hemolitică a ouabainei față de A549.

De asemenea, am folosit doxorubicină în loc de etoposidă pentru a provoca senescența în A549 (Fig.8a-e). Așa cum era de așteptat, A549 senescent tratat cu doxorubicină, precum și tratat cu etoposidă au demonstrat o sensibilitate mai mare atât la ouabaină, cât și la bufalină, comparativ cu omologii lor de control (Fig. 8g și Suplimentar Fig. S6). Acesta din urmă confirmă că efectele senolitice ale glicozidelor cardiace sunt independente de stimulii care induc senescența. Astfel, glicozidele cardiace au într-adevăr senolitic

Fig.3 Ouabain nu poate induce senoliza în END-MSC senescente tratate cu etoposidă. Validarea modelului de senescență indusă de episod pentru END-MSC: o capacitate de proliferare, dimensiunea celulei b, niveluri de autofluorescență c și activitate d SA- -Gal, e nivelul de fosforilare al Rb și nivelurile de expresie ale proteinelor p21 și HMGBI. f Viabilitatea relativă celulară (procent) a celulelor martor și senescente după tratamentul cu 10-6 ouabaină. Valorile sunt medii±SD. Pentru mai multe grupuri au fost aplicate comparații la o ANOVA unidirecțională, n=3, ns nesemnificativ,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

În cele din urmă, am decis să reproducem experimente de analiză pe celulele canceroase hepatice tratate cu etoposidă SK-Help, un alt model celular cu efecte senolitice dovedite ale glicozidelor cardiace conform Guerrero și colab. studiul [25] (Fig.9a-e). Senescentul SK-Help tratat cu etoposid a demonstrat o sensibilitate mai mare la ambii agenți în comparație cu omologii lor de control, dovedind acțiunea hemolitică a glicozidelor cardiace față de acest tip de celulă (Fig.9f și Suplimentar Fig. S7).

Împreună, aceste date demonstrează că selectivitatea hemolizei indusă de glicozidele cardiace se bazează mai mult pe natura celulară decât pe declanșarea concretă a senescenței.

Acest articol este extras din Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x