Îmbunătățirea proteomicei de sus în jos a țesutului cerebral cu FAIMS partea 2

Analiza datelor

Identificarea proteoformelor a fost efectuată cu TopPIC versiunea 1.3.53. Setările pentru TopPIC au inclus o fereastră precursoare de 3 m/z (pentru a ține cont de anvelopa izotopică), o toleranță la eroare de masă de 15 ppm, o deplasare de masă necunoscută max/min de 500 Da și un maxim. numărul de modificări necunoscute permise de 1.

În ultimii ani, tot mai multe studii au arătat că există o relație strânsă între morfologia proteinelor și memorie. Proteinele sunt moleculele de bază în activitățile vieții. Ele pot controla activitățile de viață ale celulelor și pot menține funcționarea normală a corpului uman. Studiile au descoperit că morfologia proteinelor nu numai că joacă un rol important în activitățile vieții celulare, dar are și o relație inseparabilă cu funcția de memorie din creier. Odată ce morfologia proteinelor se schimbă, aceasta va afecta conexiunea dintre neuroni, afectând astfel capacitatea de memorie a oamenilor.

În primele etape ale vieții, modificările morfologiei proteinelor joacă un rol vital în dezvoltarea și funcționarea creierului. Dacă morfologia proteinelor nu este așa cum ar trebui, va provoca o serie de probleme neurologice, ducând în cele din urmă la pierderea memoriei, afectarea cognitivă și așa mai departe.

Cu toate acestea, nu este nevoie să vă faceți griji. Tehnologia medicală modernă a permis oamenilor să ajusteze morfologia proteinelor prin dietă pentru a-și îmbunătăți memoria. O dietă bogată și variată este bogată în proteine, dar atunci când alegeți proteine, încercați să alegeți alimente cu conținut scăzut de grăsimi, colesterol și carbohidrați, pentru a evita efectele adverse ale aportului excesiv asupra organismului.

Pe scurt, morfologia proteinelor și memoria sunt inseparabile. Ar trebui să fim atenți la o dietă sănătoasă și la un aport echilibrat de proteine ​​pentru a menține sănătatea, păstrând în același timp o memorie bună. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece are efecte antioxidante, antiinflamatorii și anti-îmbătrânire, care pot ajuta la reducerea oxidarii și a reacțiilor inflamatorii din creier, protejând astfel sănătatea sistemul nervos. În plus, Cistanche poate promova, de asemenea, creșterea și repararea celulelor nervoase, sporind astfel conectivitatea și funcția rețelelor neuronale. Aceste efecte pot ajuta la îmbunătățirea memoriei, a capacității de învățare și a vitezei de gândire și pot preveni, de asemenea, apariția disfuncțiilor cognitive și a bolilor neurodegenerative.

Faceți clic pe Cunoaștere pentru a îmbunătăți memoria pe termen scurt

Spectrele MS2 au fost căutate într-o bază de date concatenată cu intrări de la Homo sapiens Swiss-Prot (20.352), Swiss-Prot splicevariants (22,000) și TrEMBL (54.436), precum și contaminanți obișnuiți. Proteoformele identificate au fost filtrate la o rată de descoperire falsă (FDR) de 1% prin TopPIC.

Analiza datelor din aval a fost efectuată în mediul R pentru calcularea statistică și generarea de figuri.54 În analiza în aval, proteoformele din aceeași genă cu aceiași aminoacizi de început și de sfârșit care s-au dovedit a fi în ±5 Da au fost combinate ca proteoformă unică pentru a crește stringența a misiunilor noastre.

Deși pragul 5Da este arbitrar, această abordare a compensat vârfurile monoizotopice atribuite incorect, ambiguitatea în schimbările de masă necunoscute și alte abateri artefactuale. Pentru a determina deviația standard relativă (RSD) a proteoformelor în cadrul replicilor, am folosit ieșirea de „intensitate caracteristică” de la TopPIC.

Hărțile de acoperire a secvenței de fragmentare și spectrele asociate au fost generate folosind software-ul LCMsSpectator.55

Setările specifice pentru LCMsSpectator au inclus o toleranță la ioni precursori de 10 ppm, o toleranță de producție de 10 ppm, un prag minim S/N de 1,5, un prag de corelație Pearson de 0,7, o uniformizare implicită de 9 puncte, și un prag de intensitate relativă a izotopului precursor de 0,1.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Adăugarea FAIMS mărește puternic acoperirea proteomului

Proba de țesut de cortex de la un pacient diagnosticat cu Alzheimer a fost procesată urmând fluxul de lucru, așa cum se arată în Figura 1. Am căutat mai întâi să analizăm performanța FAIMS pe diferite CV-uri în comparație cu cele fără FAIMS (denumite „Fără FAIMS”).

Merită să ne amintim că interfața FAIMS produce o pierdere modestă a transmisiei ionilor, probabil datorită căii mai lungi a ionilor prin sursă.56 Prin urmare, pentru a reprezenta mai bine condițiile tipice și pentru a asigura comparații echitabile, datele „Fără FAIMS” au fost colectate folosind același eșantion fără instalat unitatea FAIMS.

Aceste date „Fără FAIMS” au fost colectate în trei exemplare și analizate în conformitate cu fluxul de lucru, așa cum se arată în Figura 1 cu o analiză de top 6 DDA MS2. Seturile de date „Fără FAIMS” au identificat în medie 754 ± 35 de proteoforme (Figura 2A și Tabelul S1) și au identificat colectiv 1073 de proteoforme unice (neredundante) (Figura 2B) derivate din 293 de gene unice (Figura 2C), acoperind 29.359 de aminoacizi în proteom (Figura 2D).

„Acoperirea proteomei” metrică (Figura 2D) este definită ca aminoacizi neredundanți acoperiți de secvența fiecărei proteoforme. În esență, această metrică ține cont atât de lungimea, cât și de diversitatea proteoformelor identificate.

Considerăm că aceasta este o măsură mai echilibrată în comparație cu numărul brut de proteoforme și gene, deoarece evită prejudecățile către proteoforme mai mici. Deși numărările simple de proteoforme sau gene sunt intuitive, aceste metrici par să fie puternic influențate de fragmente proteolitice scurte. Seturile de date FAIMS au fost colectate de la -50 la -20 CV scanate în pași de 5 V.

Fiecare dintre cele 7 CV-uri rezultate a fost colectat în trei exemplare. În ceea ce privește proteoformele și genele, FAIMS a depășit „Fără FAIMS” pentru toate CV-urile testate în intervalul -50 până la -30 CV (Figura 2A-C).

De exemplu, cele trei seturi de date la −50 CV au identificat 1833 ± 17 proteoforme, o creștere medie de ~ 140% per cursă în comparație cu „Fără FAIMS”. În mod colectiv, aceste trei seturi de date la -50 CV au identificat 2564 de proteoforme unice din 530 de gene unice care acoperă un total de 43437 de aminoacizi, o creștere de 95, 69 și, respectiv, 69% față de cele trei seturi de date "NoFAIMS", respectiv (Figura 2B-D și Tabelul S1).

De asemenea, deși FAIMS la -25V observă mai puține proteoforme și gene unice în comparație cu „Fără FAIMS”, proteoformele în sine sunt mult mai lungi în medie. Astfel, când se ia în considerare lungimea proteoformei, (Figura 2D), seturile de date -25 V acoperă aproape la fel de mulți aminoacizi din proteom (28.398) în comparație cu „Fără FAIMS” (29.359), făcând acest lucru cu doar jumătate din câte proteoforme (Figura 2B) ).

De asemenea, am investigat dacă FAIMS ar putea oferi o analiză la fel de robustă și reproductibilă în comparație cu fără FAIMS. Am evaluat reproductibilitatea cuantificării calculând RSD (echivalent cu coeficientul de variație) al intensității caracteristicii fiecărei proteoforme, cu condiția ca proteoforma să îndeplinească criteriul de a fi observată în toate cele trei seturi de date replicate pentru fiecare setare CV.

Deoarece seturile de date FAIMS și „Fără FAIMS” au fost toate colectate dintr-o singură probă biologică, variația între replici ar trebui atribuită exclusiv factorilor instrumentali.

Graficul cu casete din Figura 3 (precum și histogramele individuale din Figura S1) demonstrează cum se compară distribuțiile RSD-urilor între seturile de date FAIMS și „Fără FAIMS”.

Pe baza RSD mediană, adăugarea FAIMS a dus la o calitate de cuantificare similară sau ușor îmbunătățită în raport cu „Fără FAIMS”. Îmbunătățirea RSD-urilor între tensiuni mai mici (-20 până la -30 CV) poate fi legată de observația că mai puține proteoforme sunt transmise în acest interval, oferind spectre MS1 de calitate mai bună și, prin urmare, estimări mai bune ale intensității caracteristicilor.

În plus, este de remarcat faptul că RSD-urile determinate din aceste replici sunt similare cu experimentele anterioare de sus în jos55 și de jos în sus57,58 efectuate cu instrumente similare.

Luate împreună, aceste date demonstrează că adăugarea FAIMS la TDP crește în mod robust identificările de proteoforme, fără niciun sacrificiu al calității cuantificării.

Apoi am investigat suprapunerea identificărilor dintre CV-uri, care ar putea oferi cel mai mare set de observații neredundante.

Folosind coeficienții de suprapunere, definiți ca intersecția dintre două seturi împărțită la cea mai mică dintre cele două seturi, am determinat similitudinea dintre fiecare set de date. Coeficientul mediu global de suprapunere pentru ambele identificări ale genelor proteoformabile în cadrul fiecărui CV FAIMS a fost 0,76.

Acesta este comparabil cu coeficientul de suprapunere din seturile de date „Fără FAIMS” (0,77), sugerând că replicile tehnice prezintă o reproductibilitate similară. O hartă termică care afișează coeficienții de suprapunere FAIMS ai proteoformelor și genelor este prezentată în figurile 4 și, respectiv, S2.

În special, suprapunerea identificărilor genelor în spațiul CV este mult mai mare față de proteoforme, deși este deosebit de vizibilă atunci când se compară cele mai lungi distanțe CV.

De exemplu, suprapunerea între -50 și -20 CV este 0,64 la nivel de genă și 0,06 la nivel de proteoforme. Acest lucru era de așteptat deoarece fiecare genă poate fi reprezentată de mai multe proteoforme.

Figura 4 demonstrează că, în timp ce o diferență de 5-10 V în CV produce coeficienți de suprapunere în mare parte peste 0,5, distanțe mai mari de 15 V produc grade mai mari de diferență și, prin urmare, sunt mai bine distanțate pentru a captura seturi suficient de diferite de proteoforme.

Cu aceste seturi de date, am urmărit apoi să determinăm care combinații de CV-uri sunt optime pentru a obține identificări maxime de gene, identificări de proteoforme și acoperire a secvenței cu constrângeri privind numărul de CV-uri pentru fiecare combinație.

În primul rând, am stabilit combinațiile optime pentru orice număr de CV-uri de la 1 la 7 utilizând valorile proteoformelor unice, genelor și acoperirii secvenței de proteom (Figura 5).

Folosind combinații limitate la trei CV-uri ca exemplu, Figura 5A, B detaliază modul în care -35, -40 și -50 V sunt ideale dacă se dorește să maximizeze numărul de proteoforme sau gene.

Proteoformele și genele identificate în aceste trei CV-uri (nouă seturi de date) acoperă 84% din totalul proteoformelor unice și 92% din totalul genelor pe întregul set de 21 de seturi de date.

Când se cântărește lungimea unei proteoforme cu acoperirea secvenței ca metrică, combinația ideală este de -30, -40 și -50 CV, acoperind 88% din aminoacizii unici din toate cele 21 de seturi de date FAIMS cu doar o pierdere modestă a identificărilor de proteoforme și gene ( 4221 proteoforme și 723 gene, Figura 5C). Cu toate acestea, aceste combinații includ toate replicile și reprezintă identificările maxime care ar putea fi realizate pentru o anumită combinație de CV-uri. Prin urmare, pentru a demonstra avantajul pasajului extern al CV-ului, am decis să investigăm ce numere ar putea fi atinse în mod rezonabil în medie cu doar trei runde, în care fiecare rundă este diferită de CV.

Folosind seturile de date -50, -40 și -30 V ca exemplu, am determinat proteoformele unice medii, genele unice și acoperirile secvenței de proteom pe baza celor 27 de combinații unice din cele trei replici diferite din fiecare CV.

Pe baza acestei analize, am putea obține 2986 (±46) proteoforme unice și 618 (±12) gene unice care acoperă 64.534 (±1089) aminoacizi în medie. În comparație cu seturile de date triplicate „Fără FAIMS”, care au identificat 1073 de proteoforme unice și 293 de gene unice care acoperă 29.359 de aminoacizi, pasul CV extern la -50, -40 și -30 V ar putea mai mult decât dubla fiecare metrică.

Cu toate acestea, combinația optimă de CV-uri va depinde, de asemenea, probabil de organismul și țesutul din care provine proba, etapele de pregătire a probei aplicate, precum și orice fracționare offline suplimentară implementată înainte de analiza LC-MS.

În general, atunci când sunt luate împreună cu analiza de suprapunere (Figura 4), sugerează că distanțe de 15 V sau mai mari între CV-uri oferă cea mai mică cantitate de suprapunere între proteoforme, în timp ce separarea de 5-10 V în cadrul -50 până la -30 CV maximizează genele, proteoformele și proteomul. acoperire a secvenței.

Pentru a determina în continuare impactul FAIMS asupra profunzimii acoperirii proteomului, am comparat genele identificate din seturile noastre de date de sus în jos cu o analiză tipică de jos în sus a creierului uman.

Seturi cuprinzătoare de date de jos în sus ale țesutului cerebral uman ne-au permis să estimăm abundența pentru 8528 de proteine ​​folosind numărarea spectrală ponderată.

Prin referințe încrucișate cu seturile noastre de date de sus în jos, am reușit să determinăm de unde provin genele și proteoformele și să clasăm în ceea ce privește abundența estimată a proteinelor (folosind numărătoarea spectrală normalizată de seturi de date) în creierul uman (Figura 6).

Genele care au fost găsite în analiza noastră de sus în jos, dar nu în setul de referință de jos în sus, au fost clasificate ca „NA”.

For more information:1950477648nn@gmail.com