Îmbunătățirea proteomicei de sus în jos a țesutului cerebral cu FAIMS Partea 3

O observație imediată și aparentă este că cu cât percentila de abundență este mai mare, cu atât este mai mare probabilitatea de identificare cu TDP. Cu alte cuvinte, TDP identifică în principal proteine ​​foarte abundente.

Pe măsură ce îmbătrânim, mulți oameni constată că memoria lor s-a scăpat. Acesta este un fenomen comun, mai ales după ce am experimentat stres mental pe termen lung, lipsă de somn și diete dezechilibrate.

Dar știați că o modalitate de a ne ajuta să ne îmbunătățim memoria este să creștem aportul de proteine ​​cu abundență mare? Proteina cu abundență mare este bogată în aminoacizi, care pot sintetiza o moleculă numită neurotransmițător în creier și, de asemenea, pot promova creșterea și activitatea neuronilor. Neuronii sunt cele mai de bază unități din creier și sunt cheia abilităților noastre de învățare și memorie. Prin urmare, proteinele cu abundență mare ne pot îmbunătăți memoria prin îmbunătățirea funcției neuronilor.

Cercetările au demonstrat, de asemenea, relația dintre proteine ​​și memorie. De exemplu, un studiu a constatat că, în comparație cu o dietă bogată în proteine, o dietă săracă în proteine ​​a dus la o scădere a funcției creierului, inclusiv a atenției și a memoriei.

Deci, dacă vrei să-ți îmbunătățești memoria, s-ar putea să adaugi la fel de bine câteva alimente bogate în proteine ​​în dieta ta, cum ar fi pui, pește, carne de vită, ouă, tofu etc. Desigur, ar trebui să fii atent și la echilibru. și diversitatea dietei tale și nu poți mânca doar un fel de mâncare.

Pe scurt, proteinele cu abundență mare ne pot ajuta la îmbunătățirea memoriei. Dacă vrei să ai o memorie mai bună, ai putea la fel de bine să începi cu dieta și să încerci să mănânci cât mai multe alimente bogate în proteine! Acest lucru arată că trebuie să ne îmbunătățim memoria, iar Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece poate regla și echilibrul neurotransmițătorilor, cum ar fi creșterea nivelurilor de acetilcolină și a factorilor de creștere, care sunt foarte importanți pentru memorie și învățare. În plus, Cistanche poate, de asemenea, să îmbunătățească fluxul sanguin și să promoveze livrarea de oxigen, ceea ce poate asigura că creierul obține suficientă nutriție și energie, îmbunătățind astfel vitalitatea și rezistența creierului.

Faceți clic pe cunoașteți suplimentele pentru a crește memoria

Aproximativ jumătate dintre genele identificate din seturile de date de sus în jos (cu sau fără FAIMS) au fost conținute în primele 20% din containerele de abundență pentru analiza de jos în sus (Figura 6A). Dimpotrivă, 71 de gene au putut fi găsite doar în seturile de date de sus în jos („NA” bin) (Figura 6A).

Aceste gene par să reprezinte proteine ​​relativ scurte (<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis. 

De exemplu, incluse în partea de sus în jos, doar binul au fost proteine ​​histonice, cum ar fi H3C1, H4C1, H1–4 și H2BC12. S-a anticipat, am constatat că Faims ar putea îmbunătăți identificările în abordantpercentile inferioare față de „fără faimuri”, crescând adâncimea de adâncime a proteomului observabil.

Prin determinarea raportului dintre FAIMS și „Fără FAIMS” în toate percentilele, o creștere apreciabilă a identificărilor sub percentila 40 este evidentă în CV-urile în intervalul -40 până la -50 (Figura 6B).

Cu toate acestea, când se ia în considerare numărul absolut de gene, contribuția majoră a avantajului FAIMS este prin lărgirea spectrului de identificări în toate percentilele de abundență.

Relația dintre CV-ul FAIMS și Transmiterea Proteoformelor

Cu FAIMS, am observat, de asemenea, o tendință între FAIMS CV și greutatea moleculară a proteoformei (Figura 7). La -50 CV, masa mediană a proteoformei este de ~ 5 kDa și crește la ~ 15 kDa la -20 CV.

Pe baza acestor distribuții de masă (Figura 7), CV-urile mai mici de -50 V par bine potrivite pentru experimentele proteomice de sus în jos sau de mijloc în jos, în timp ce CV-urile mai mari de -50 V pot beneficia de experimente peptidomice sau de jos în sus.

Tendința observată a greutății moleculare se extinde probabil dincolo de -20 CV; cu toate acestea, ne-am limitat căutarea la -20 CV pe baza scăderii identificărilor de proteoforme și gene, ceea ce a condus la scăderea acoperirii secvenței proteomului pe rundă.

Ar trebui să remarcăm că o lucrare anterioară care folosea FAIMS a găsit +40 CV ca fiind tensiunea ideală pentru transmiterea unui lanț greu de mAb NIST (~51kDa) și -20 CV a fost cea mai bună pentru lanțul ușor corespunzător (~23 kDa), susținând ideea. că tendinţa pe care o observăm se extinde în CV-uri FAIMS pozitive.45

Interesant, deși multe spectre care identifică o singură proteoformă s-au limitat la a fi găsite într-un interval de 10 V (3599 din 5165), au fost observate șapte proteoforme în întregul interval CV de la -50 la -20. Probabil, acest lucru poate fi atribuit abundenței lor ridicate în probă, în special în cazul ubiquitinei (UBB), proteinei de bază a mielinei și proteinei de legare a acilCoA.

Cu toate acestea, este, de asemenea, probabil ca diferitele stări de încărcare ale acestor proteoforme să adopte mai multe conformații în fază gazoasă în funcție de izomerizarea protonilor, impactând mobilitățile acestora.42

These seven proteoforms allowed us to investigate how thecharge state envelope is differentially transmitted through the modulation of CV. Ca proxy pentru distribuția stării de încărcare la fiecare CV, am folosit starea medie de încărcare bazată pe potrivirile de spectru proteoform (PrSM) identificate la fiecare CV și am urmărit modul în care această valoare s-a schimbat în funcție de CV începând de la -50 CV.

Scanările MS1 din Figura S3 demonstrează cum starea medie de încărcare PrSM urmărește distribuția stării de încărcare a UBB. Dintre aceste șapte proteoforme, patru au urmat o relație inversă, cu starea medie de sarcină observată crescând pe măsură ce CV a fost scăzut (Figura 8).

Este de remarcat faptul că această tendință a fost observată în general cu peptide și proteine ​​mici.56,62–64 În mod surprinzător, trei proteoforme au arătat relația opusă în care scăderea CV a scăzut stările mediane de încărcare observate (Figura 8).

O examinare superficială a masei medii a precursorilor dintre cele două grupuri sugerează că precursorii mai mari sunt mai susceptibili de a favoriza stări de încărcare mai ridicate pe măsură ce CV este scăzut.

Pentru a valida aceste relații în continuare, am extins această analiză pentru a include proteoforme care au fost identificate într-un interval mai modest, dar totuși larg, de 20-30 CV (n=256 proteoforme). Aici, proteoforme a căror sarcină mediană s-a deplasat mai mult de o sarcină în Gama EntreCV a fost legată în două grupuri diferite, în funcție de direcția ThatShift.

Cei care au schimbat mai puțin de o taxă au fost considerați „neutri” în ceea ce privește schimbarea CV-ului. Similar cu rezultatele anterioare, precursorii mai mari au fost semnificativ mai probabil să fie asociați cu o relație inversă între stările de încărcare observate și CV (Tabelul S2).

Odată cu scăderea CV, majoritatea proteoformelor par să transmită în stări de încărcare mai scăzută (n=177) în comparație cu cele care favorizează stări de încărcare mai ridicată (n=39). Restul (n=40) au fost considerați „neutre” în ceea ce privește modificările CV-ului.

Proteoformele combinate în grupul neutru au demonstrat o masă medie de precursor între grupurile inverse și directe, sugerând încă o dată că masa proteoformei este legată intrinsec de acest comportament.

Cu toate acestea, alți parametri bazați pe secvență primară, cum ar fi compoziția aminoacizilor bazici/acizi și indicele alifatic, nu au fost corelați semnificativ (Tabelul S2).

Deși proteinele care sunt introduse în faza gazoasă sunt probabil denaturate, factorii asociați în mod obișnuit cu proteinele native, cum ar fi momentul dipol sau secțiunea transversală de coliziune, pot avea o valoare predictivă mai bună față de acest fenomen. masses, and how a protein's charge stateenvelope can be differentially transmitted through FAIMS as well.

Utilitatea fragmentelor de proteine ​​în experimentele TDP

În mod surprinzător, un număr semnificativ de proteoforme pe care le-am identificat au fost fragmente de proteine ​​mai mari. Am descoperit că doar 25% dintre proteoformele unice identificate acoperă mai mult de jumătate din secvența proteinei din care au fost derivate.

Acești 25% au avut o masă medie de 11,4 kDa, comparativ cu restul de 75% care au avut o masă medie de 5,7 kDa. La această observație pot contribui mai mulți factori, dintre care unii sunt independenți de FAIMS.

De exemplu, aceste fragmente ele însele pot fi produse de scindare proteolitică produse în condiții homeostatice normale ca parte a „degradului” celular67 sau în ciuda diferitelor precauții luate, introduse în timpul intervalului post-mortem și manipulării probei.

Țesutul de sistem centralnevous este o sursă bogată de peptide de semnalizare cunoscute sub numele de „neuropeptide” care sunt derivate în mod obișnuit și din proteine ​​precursoare mult mai mari.68

Prin încrucișarea identificărilor noastre de proteoforme cu o bază de date de neuropeptide stabilită (NeuroPedia),69 am reușit să identificăm mai multe astfel de neuropeptide, inclusiv vasostatina-1, secretoneurina, desnonopeptida colecistochinină-58 și neuropeptida y și multe variante de secvență non-canonice. derivate din genele cunoscute producătoare de neuropeptide.

Dincolo de factorii biologici, anumiți parametri ai instrumentului pot influența și observarea fragmentelor de proteine. De exemplu, tensiunile scăzute de „fragmentare” în sursă (între 10 și 20 V) pot fi utilizate în mod obișnuit pentru a elimina aductii și a desolvata ionii de proteine, în timp ce tensiunile mai mari pot fi utilizate. produce disociere indusă de sursă.

Cu toate acestea, susceptibilitatea legăturilor amidice la disociere variază foarte mult și, pe măsură ce dimensiunea unei proteine ​​crește, crește probabilitatea ca aceasta să conțină legături amidice labile, cum ar fi Xaa-Pro. mecanism, chiar și la tensiuni surse scăzute, am decis să evităm aplicarea tensiunii sursei pentru a reduce șansa de a introduce ioni de fragment în instrument.

De asemenea, este posibil ca proteinele să fie susceptibile la evenimentele de fragmentare pe măsură ce trec prin câmpurile electrice create în FAIMS. Cu toate acestea, aceste fragmente nu ar fi de așteptat să aibă aceeași mobilitate ca ionul părinte, cu avertismentul că acest lucru este probabil dependent de dimensiunea fragmentului în raport cu ionul precursor.

În cele din urmă, merită să subliniem câțiva factori care pot influența observarea unor proteoforme mai mici (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74 

Această răspândire a semnalului poate fi atribuită în mare măsură anvelopei stării de încărcare și distribuțiilor izotopice ale fiecărei stări de încărcare. Specific configurației noastre experimentale a fost utilizarea unui filtru MWCO de dimensiune 3K ca pas final de filtrare în prepararea probei noastre, care în acest caz a fost ales pentru a se asigura că proteoformele beta amiloid mai mici ar putea fi capturate eficient dacă ar fi prezente.

General instrumental factors can create a biastoward small proteoforms as well, including the tuning of the quadrupole, electrodynamiccapture, and collisions with residual gas molecules in the Orbitrap cell that lead to quickerdecay of the transient for larger molecules.75 Irrespective of these biases or the exactorigin dintre fragmente, ele pot încă oferi informații despre proteom.

Aceste fragmente sunt deosebit de utile în contextul bolii neurodegenerative, unde întreruperile inproteostazei sunt în mod obișnuit legate de patologie.76,77

Într -adevăr, fragmentele de tau sunt deseori consolidate pentru a fi neurotoxice și joacă un rol în progresia tauopatiilor, cum ar fi AD.23-26 general, fragmentele pe care le observăm sunt mult mai mari decât peptidele triptice și în mai multe cascade unde există multe fragmente pentru o proteină particulară , observăm o acoperire considerabilă a secvenței.

Acest lucru este exemplificat prin examinarea fragmentelor care asigură acoperire pentru lanțul B tubulinalfa-1 de ~50 kDa (TUBA1B) și sinapsina-1 de ~70 kDa (SYN1), așa cum se arată în Figura 9A, B, ambele mari. Proteine ​​care altfel ar fi dificil de observat în forma lor de lungime întreagă INTDP a unui eșantion complex.

Identificarea proteoformelor cu relevanță pentru bolile neurodegenerative

Utilizarea FAIMS cu analiza noastră de sus în jos a permis identificarea mai multor variante unice de îmbinare Swiss-Prot și intrări TrEMBL, cu 267 de variante de îmbinare unice și 96 de intrări TrEMBL (Tabelul S3).

În special, observăm mai multe PrSM-uri care identifică fără ambiguitate o izoformă ORF alternativă (A{{0}}A0D9SF30) pentru molecula de adeziune a celulelor neuronale1 (NCAM1). Am observat, de asemenea, proteoforme derivate din gene care au rol cunoscut în mai multe boli neurodegenerative, în special -sinucleina și PARK7.

În ambele cazuri, proteoformele predominante conțin secvența de lungime completă. Interesant este că temajoritatea -senucleină, sinucleină și (într -o măsură mai mică) -sinucleină PRSM -urile au fost întemeiate care conțin o schimbare de masă necunoscută de 177 da în apropierea C -terminusului (lungime -lungime -synucleinspectru cu o modificare necunoscută, așa cum se arată în figura S4A) .

Această schimbare de masă a fost observată anterior în căutările în bazele de date deschise și se găsește în general la Asp sau Gluresidues.78 O explicație potențială care se potrivește îndeaproape cu masa medie și monoizotopică a modificării constă dintr-un oxigen cu trei atomi de fier, precum și din pierderea a șapte atomi de hidrogen ( pe baza aderării Unimod #1971).

Comparația vârfurilor izotopice ale ionului fragment ay242+ din -sinucleină (Figura S4B) cu un spectru simulat care conține elementele menționate mai sus despre care se crede că aparțin modificării necunoscute (Figura S4C) demonstrează similitudinea dintre cele două distribuții izotopice, cu multe dintre vârfurile izotopice care se aliniază la 2 ppm unul de celălalt.

De asemenea, trebuie subliniat că vârfurile izotopice cele mai din stânga sunt unice pentru izotopii de fier natural, iar absența acestor vârfuri este ușor evidentă atunci când spectrul este simulat fără a conține cei trei atomi de fier (Figura S4D), sugerând cu tărie că această modificare necunoscută este foarte probabil compusă. a elementelor propuse.

Studiile anterioare au descris, de asemenea, afinitatea ridicată a -sinucleinei pentru diverși ioni metalici, iar regiunea pe care observăm că conține această modificare se suprapune cu resturi cunoscute a fi implicate în legarea - în special motivul 119DPDNEA124 (Figura S5).79–81.

Datele noastre sugerează, de asemenea, că regiunile C-terminale ale -sinucleinei și -sinucleinei au roluri similare în legarea metalelor, deoarece spectre multiple cu aceeași schimbare de masă necunoscută au fost corelate cu secvențe similare din cadrul acestor proteine.

Despre proteina mitocondrială PARK7, am observat o schimbare a masei Da de ~ 116.0 pe reziduul Cys al site-ului activ unic, C106 (Figura S6). O explicație potențială cu o succinilare similară a masei delta, o modificare care este atribuită stresului mitocondrial și se formează datorită adăugării de fumarat de către Michael pe un grup Cys tiol.82

For more information:1950477648nn@gmail.com