Tubulozidul B din salsa Cistanche salvează celulele neuronale PC12 din apoptoza indusă de ioni de 1-metil{-4-fenilpiridiniu și stresul oxidativ

Introducere

Din punct de vedere patologic, boala Parkinson (PD) sporadică este caracterizată de obicei printr-o pierdere a neuronilor catecolaminergici, în special a neuronilor dopaminergici ai substanței negre pars compacta (SNc) și prezența intraneuronei caracteristice| incluziuni numite corpi Lewy în regiunile cerebrale afectate. În ciuda faptului că o varietate de factori au fost implicați în patogeneza PD, mecanismele implicate în inițierea și progresia PD rămân incerte. Chiar dacă cauza PD rămâne un răspuns, mai multe linii de dovezi sugerează cu tărie implicarea stresului oxidativ, conducând în cele din urmă. la moarte neuronală sau apoptoză prin generarea excesivă de radicali liberi. Faptul că sistemul dopaminergic nigral poate produce niveluri ridicate de radicali liberi și are niveluri relativ scăzute de sistem de apărare oxidativă susține și mai mult această ipoteză. Atât studiile in vivo, cât și in vitro au arătat neurotoxicitatea mediată de stresul oxidativ a MPP+, un metabolit activ al l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridinei (MPTP) asupra neuronilor dopaminergici. Implicarea radicalilor liberi produși în mod excesiv de stresul oxidativ ca cauză imediată a tulburărilor neurodegenerative precum PD sugerează un rol esențial pentru antioxidanți. Tubulozidul B (Fig. l) a fost unul dintre compușii fenileta noid izolați din tulpinile salsa Cistanche. Studiile anterioare au descoperit că mulți feniletanoizi, inclusiv tubulozida B, au arătat o activitate puternică de captare a radicalilor liberi.

Având în vedere aceste constatări, am investigat în prezentul studiu efectul tubu]nside B asupra neurotoxicității induse de MPP+-in vitro, utilizând linia celulară PC12 a feocromocitomului nervos simpatic, care a fost utilizată cu succes de-a lungul anilor pentru a studia funcția neuronală.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU PREVENIREA BOLII PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiale și metode

Materiale

Tubuloside B de la Cistanche Salsa a fost cu amabilitate furnizat de Dr. Li Lei (Departamentul de Produse Naturale, Școala de Științe Farmaceutice, Universitatea Peking, Beijing, China). Puritatea compusului a fost mai mare de 98% prin analiza HPLC. Mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM), serul de cal și serul fetal de vițel au fost achiziționate de la GIBCO BRL, ion de 1-metil~-fenilpiridiniu (MPP+ ), poli-L-lizină, 3-(4,{ {8}}dimetil tiazol-2 -il){-2,5- bromură de difeniltetrazoliu (MTT), iodură de propidiu (PI), RNază A, proteinază K și 2; Diacetatul de 7’-diclorofluoresceină (DCFH-DA) a fost achiziționat de la Sigma.

Cultură de celule

Celulele PCI2 au fost menținute în DMEM suplimentat cu 10% ser de cal, 5% ser fetal de vițel, 100U/ml penicilină și 100ug/ml streptomicina. Celulele au fost cultivate într-un incubator umidificat aerat cu 95% aer și 5% CO2 la 37 de grade. Toate experimentele au fost efectuate la 24-48 ore după ce celulele au fost însămânțate. Celulele au fost recoltate în mod obișnuit prin tripsinizare 0,25% când celulele s-au apropiat de stadiul subconfluent și au fost placate în baloane de cultură de 25 cm împărțite la 1: 8.

Analiza viabilității celulare

Viabilitatea celulară a fost determinată folosind un test MTT modificat așa cum s-a descris anterior [10]. Pe scurt, celulele PC12 au fost însămânțate în plăci de 96-godeuri la o densitate de I × 104 celule per godeu. Culturile au fost crescute timp de 48 de ore, apoi mediul a fost schimbat cu acela care conține diferite concentrații de burnside B sau MPP. După incubare timp de până la 48 ore și 72 de ore, soluția MTr (5 mg/ml în DMEM) a fost adăugată pe plăcile de godeuri și celulele au fost lăsate să incubeze timp de 4 ore la 37 de grade. După ce mediul a fost îndepărtat, cristalele celulare și colorante au fost alimentate solubile prin adăugarea a 200 μL de DMSO, iar absorbția a fost măsurată la 570 nm (540 nm ca referință) cu un cititor de microplăci model 550 (Bio-Rad). Viabilitatea celulară a fost, de asemenea, analizată utilizând metoda de excludere cu albastru tripan. Celulele au fost colectate, peletate ușor și colorate cu o soluție 0,6% de albastru tripan pentru 3 ploaie. Procentul de celule necolorate a fost ulterior evaluat în zece câmpuri ale microscopului selectate aleatoriu. Ca medicament pozitiv, a fost utilizat 100 ng／ml factor de creștere epidermică (EGF).

TUBULOSA NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ACTIVITATE LIBERĂ DE CUPERARE RADICALĂ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Detectarea apoptozei prin citometrie în flux

Celulele apoptotice au fost detectate prin citometrie în flux folosind iodură de propidiu (PI) [11]. Pe scurt, aproximativ 1 × 106 celule incubate cu substanțele de testat au fost recoltate prin centrifugare și au fost spălate o dată cu PBS. Celulele au fost fixate cu 70 % etanol timp de 24 de ore la - 20 grade și spălate o dată cu PBS. Celulele au fost apoi resuspendate în 300μL de PBS care conține 0,5 mg/ml RNaseA și 0,5 mg/ml PI. După incubare suplimentară timp de 30 de minute în întuneric, citometria în flux a fost efectuată cu un FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Germania).

Analiza fragmentării ADN-ului prin electroforeză

Am aplicat protocolul lui Moore [12] care a izolat doar ADN fragmentat, iar experimentele au fost normalizate prin utilizarea unui număr egal de culturi din fiecare grup de testare. Pe scurt, 3 × 106 neuroni din fiecare dintre probele tratate au fost spălați în soluția de sare echilibrată a lui Hank (1{000g timp de 10 minute), iar granulele formate la fundul tubului au fost omogenizate cu 1 ml tampon de liză (10 mM Tris la pH 7,4, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) timp de 20 min pe gheață. După centrifugare la 11,000 g pentru 20 de ploaie la 4 grade, supernatanții care conțineau ADN fragmentat au fost îndepărtați și digerați cu 20 mg/ml RNază A la 37 de grade timp de 1 oră și 0,1 mg/ml proteinază K la 56 de grade. pentru încă 1 oră. ADN-ul fragmentat a fost extras folosind fenol și cloroform și centrifugat la 10,000g pentru 1 ploaie la 4°C. Faza apoasă a fost transferată într-un tub Eppendorf nou, amestecat cu 2 volume de etanol rece ca gheața și apoi plasat la 20 de grade timp de cel puțin 1 oră pentru a precipita ADN-ul. După centrifugare la 15,000g timp de 20 de minute la 4 grade, supernatantele au fost îndepărtate și granulele de ADN au fost spălate o dată cu etanol 80% (15.000 g timp de 15 minute la 4 grade), uscate la aer și dizolvate în 20μL Tampon TE la pH 7,6. Întreaga probă a fost apoi supusă electroforezei pe un gel de agaroză 1,5% timp de 1 oră la 85 V. Gelul a fost examinat și fotografiat de un sistem de documentare cu produse ultraviolete pe gel (GELDOC-2000, Bio-Rad, SUA).

Măsurarea formării intracelulare de ROS

Formarea peroxizilor intracelulari a fost detectată cu un microscop laser cu scanare confocală utilizând un compus non-fluorescent, 2"7"-diacetat de diclorofluoresceină (DCFH-DA) [13], care este deesterificat în celule de către esterazele endogene la cel liber ionizat. acid, 2;7"-diclorofluoresceină. 2",7-Diclorofluoresceina este capabilă să fie oxidată la 2"7"-diclorofluoresceină fluorescentă (DCF) de către hidroantioxidanți. Celulele au fost incubate cu 10 μM DCFH-DA timp de 30 de minute la 37 de grade. Culturile au fost spălate de două ori cu soluție de sare echilibrată a lui Hank și au fost fotografiate în același mediu. Imaginile au fost realizate folosind un microscop laser de scanare confocal, DCF a fost excitat la 488 nm și filtrul de emisie a fost un filtru de barieră de 510 nm. Pentru a oferi o comparație validă, au fost utilizați aceiași parametri de achiziție pentru toate observațiile. A fost stabilită poziția verticală optimă în mijlocul celulelor, iar apoi câmpul a fost scanat rapid. Deoarece iluminarea la lungimea de undă de excitație de 488 nm a cauzat fluorescență crescută din cauza oxidării acestui colorant, fiecare câmp a fost expus la lumină pentru același timp. Valorile inițiale de la celulele nestimulate au fost utilizate ca valori de control pentru a compara cu celulele tratate cu MPP+ în prezența sau absențatubulozid B. După scanare, intensitatea medie relativă a fluorescenței în 15-20 corpuri de celule neuronale per câmp de microscop a fost cuantificată în patru culturi separate pentru fiecare condiție de tratament.

analize statistice

Toate valorile obţinute au fost exprimate ca medii ± SD. Semnificația statistică a diferențelor dintre grupuri a fost determinată de testul t Student; Valorile p calculate mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative statistic.

Rezultate

După cum se arată în Fig. 2, MPP+ a produs o scădere dependentă de doză a viabilității celulelor PCI2. În schimb, EGF, un factor neurotrofic bine-cunoscut, a produs o protecție semnificativă a viabilității celulare la 100 ng/mL MPP, efectele citotoxice induse de s-au atenuat și în prezența tubulozidei B (5, 10, 50 sau 100 ug-ml{{12} }), deși cu potență mai mică decât referința

medicament (fig. 3). Tubulozida B la aceste concentrații a prezentat efecte citoprotectoare într-o manieră dependentă de doză, iar compusul singur nu a provocat nicio citotoxicitate aparentă (datele nu sunt prezentate). Electroforeza pe gel a extractului de ADN din celulele PCI 2 tratate cu 200 µM MPP+ timp de 48 de ore a arătat o scară de ADN. un semn distinctiv clasic al apoptozei, tubulozida B, la doze de 10 și 100μ g·ml-1formarea redusă a Scăderei ADN (Fig. 4) ． Fig.5 prezintă histograme tipice ale analizei citometrice în flux a morții celulare apoptotice induse de MPP＋ în celulele PC12 în prezența sau absența tubulozidei B. Cuantificarea profilului ciclului celular cu PI a relevat numărul de celule cu caracteristici subdiploide (regiunea M1) indică fragmentarea apoptotică a ADN-ului. În celulele netratate, fracția subdiploidă apoptotică a fost minimă până la 5．94% din totalul de 10000 de celule (Fig．5 A)．. După 48 de ore de expunere la MPP＋, procentul de apoptoză a crescut la 43．02;j;(Fig．5B)． Când se adaugă la cultura celulară, tubulozida Ba inhibat apoptoza indusă de MPP+-într-o manieră dependentă de doză. La o concentrație de 10 ug·ml-1protecția cu tubulozida B nu a fost semnificativă statistic, dar la 50 și 1 00ug·ml{-1, o scădere de 45 ％ și 63％, respectiv, a fost observat. creșterea procentului de celule de supraviețuire (Fig. 5D, E)．

Acumularea de ROS intracelular poate fi detectată prin utilizarea DCFH-DA. Celulele PC12 tratate cu 200 uM MPP＋ timp de 48 de ore au prezentat fluorescență intensă în interiorul celulei după colorarea cu colorant DCFH-DA (Fig. 6). Tratamentul simultan cu tubulozidă B (la doze de 10 și 100 ug·ml) a inhibat MPP＋一 a indus producția de ROS (procentajul redus a fost de 24．52％și, respectiv, 55．63％)．

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU TRATAREA BOLII PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Discuţie

Patogenia PD implică stres oxidativ puternic, niveluri reduse de antioxidanți și defecte mitocondriale. toate cunoscute că induc apoptoza în mai multe sisteme celulare. În special, s-a demonstrat că radicalii liberi declanșează moartea activă a celulelor în neuroni[14]. MPTP produce un sindrom asemănător parkinsonian ireversibil și sever, care provoacă degenerarea selectivă a neuronilor dopaminergici nigrostriatali la om. Această neurotoxină a fost folosită pentru a crea. Consumat modele animale de PD[15]．MPTP este convertit de monoaminoxidaza B în Mpp＋, care se acumulează în mitocondrii. unde inhibă complexul I mitocondrial și acea disfuncție mitocondrială. funcția cauzează apoptoza[16]． Prin urmare, neurotoxicitatea indusă de MPP+一 în neuronii dopaminergici a fost utilizată extensiv ca model etiologic al PD pentru screeningul agenților neuroprotectori.

În studiul de față, am demonstrat că moartea celulară indusă de MPP+-prin stresul oxidativ în celulele PC12 a fost redusă de tubulozida B. În plus, am demonstrat că tubulozida B a protejat, de asemenea, într-o manieră dependentă de doză împotriva MPP{{ 3}}scările ADN-ului induse și apoptoza, măsurate folosind electroforeza pe gel ADN și analiza citometrică în flux. Mai mult, tratamentul simultan cu concentrații mai mari de tubulozidă B a inhibat producția de ROS indusă de MPP. Astfel, tubulozida B a demonstrat efecte neuro-protectoare multifuncțional. Mai multe mecanisme, separat sau în asociere, pot fi implicate în acțiunile tubulozidei B. Efectul antioxidant este un posibil mecanism pentru neuroprotecția mediată de tubulozide B. Xiong Q a descoperit că tubulozida B a arătat o activitate puternică de captare a radicalilor liberi asupra radicalului 1,1-difenil{-2-picrilhidrazil și xantin]xantin oxidaza generată de radicalul anion superoxid.

S-a raportat recent că mai mulți feniletanoizi posedă proprietăți de captare a radicalilor liberi și protejează leziunile toxice induse de stresul oxidativ. ROS produs de MPP+, cum ar fi peroxidul de hidrogen, anionul superoxid și radicalul hidroxil, dăunează ușor moleculelor biologice, ceea ce poate duce în cele din urmă la moartea celulelor apoptotice sau necrotice. Astfel, tubulozida B poate avea efecte directe de captare împotriva ROS. Deși datele noastre nu stabilesc locul exact în care tubulozidul B acționează pentru a suprima acumularea de ROS, ele sugerează că mecanismul neuroprotector implică stimularea căilor antioxidante. Un studiu al structurii moleculare a tubulozidei B indică, de asemenea, că aceasta posedă o capacitate puternică pentrueliminarea radicalilor liberi(comunicare personala).

Alte mecanisme ar putea fi, de asemenea, pertinente. De exemplu, tubulozida B poate avea capacitatea de a contracara toxicitatea MPP prin inhibarea deschiderii porilor de tranziție a permeabilității mitocondriale și a disfuncției. În plus, trebuie luat în considerare dacă tubulozidul B are un efect direct de promovare a creșterii asupra celulelor neuronale. Mecanismul exact al acțiunii neuroprotectoare a tubulozidei B rămâne neclar. Sunt necesare studii suplimentare pentru a elucida imaginea completă a efectului său neuroprotector.

În concluzie, tubulozid B dinExtract de salsa de Cistancheare efecte protectoare evidente asupra apoptozei induse de MPP+-și stresului oxidativ. Efectele sale neuroprotective împotriva MPP + toxicitate ar putea fi importante și sugerează că ar putea avea potențial terapeutic în prevenirea și tratamentul PD.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU TRATAREA BOLII PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%