Doi triterpenoizi din frunzele de Rubus Fraxinifolius și activitățile lor inhibitoare ale tirozinazei și elastazei

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Numeroși compuși terapeutici au fost izolați din resurse organice abundente în mod natural, care pot oferi surse economice și durabile de compuși cu activități biologice sigure și eficiente. În industria cosmetică sunt căutați cu nerăbdare compușii naturali cu activități anti-îmbătrânire. Astfel, am preparat diverse extracte din frunze de Rubusfraxinifolius și am folosit teste de inhibiție enzimatică pentru a izola compuși cu efecte protectoare împotriva îmbătrânirii pielii. Două triterpenoide au fost izolate din Rubus fraxinifolius Poir. frunze. Structurile au fost caracterizate prin analize spectroscopice (LC-ESI-MS, 1D/2D RMN) și compararea cu datele raportate. Compușii 1 și 2 au fost determinati ca 2,3-O-etilen glicol,19-hidroxiuri-12-en{-23,28-acid dioic și 2,{{15} }O-propandiol,19-hidroxiuri-12-en-28-acid oic. Extractul metanolic și izolatele au fost evaluate pentru efectele lor inhibitoare asupra elastazei și tirozinazei. Compușii 1 și 2 au inhibat elastaza cu ICso 122,199 ug/mL și 98,22 ug/mL și, de asemenea, au inhibat tirozinaza cu ICso 207,79 ug/armată și, respectiv, 221,51 ug/mL. Andocarea moleculară a demonstrat că ambii compuși au afinități față de enzime.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Deși este dificil de realizat, substanțele naturale anti-îmbătrânire care sunt sigure pentru oameni pot fi recoltate economic și durabil din resurse naturale abundente. Aproximativ 700 de specii de Rubus (Rosaceae) sunt distribuite la nivel global, chiar dacă puține specii se găsesc la tropice. Acest gen conține substanțe nutritive (zahăr, vitamine etc.), metaboliți secundari (triterpenoide, flavonoide, polifenoli etc.) și are multe activități anti-îmbătrânire (antioxidant, elastază de furnici, tirozinaza de furnici, anti-colagenază, anti-UV, antiinflamatoare, vindecarea rănilor etc.)1. În plus, speciile Rubus au raportat că conţin diverse triterpene cu diverse activităţi biologice -'.

În Indonezia, R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) este distribuită în Java, Borneo etc. și este cunoscută în mod popular drept „urban.ce este cistancheMai mult, unii fermieri locali recoltează aceste plante, iar fructele de pădure sunt de obicei consumate fie proaspete, fie congelate. Studiul nostru anterior a demonstrat că extractul de tulpină de R. frascinifolius are activitate de a inhiba elastaza, tirozinaza și ca antioxidant8. Alte investigații au arătat, de asemenea, că frunzele și fructele de R. fraxinifolius au o activitate antioxidantă puternică?10. Cu toate acestea, studiul R. fraxinifolius a fost puțin cercetat și nu au fost raportate studii ale componentelor chimice.

Cistanche poate anti-imbatranire

Elastaza este o enzimă serin protează, care are un rol crucial în ridurile sau lasarea pielii prin degradarea fibrelor elastice dermice (elastină) și provoacă pierderea elasticității pielii. Una dintre acestea este elastaza derivată din fibroblastele pielii. Astfel, ca moderatori ai degradării fibrelor de elastină care provoacă îmbătrânirea pielii, inhibitorii de elastază au atras atenția ca agenți pentru preparatele cosmetice,12. Melanogeneza este mediată de tirozinază și reglează biosinteza melaninei printr-o reacție în două etape. În etapa inițială, L-tirozina este hidroxilată la L-3,{4-dihidroxifenilalanină (L-DOPA). În a doua etapă, L-DOPA este oxidată la O-chinonă corespunzătoare. Prin urmare, compușii naturali cu activitate inhibitoare a tirozinazei sunt utilizați în mod obișnuit în produsele cosmetice care inhibă hiperpigmentarea cu melanină și, prin urmare, favorizează albirea pielii.Cistanche anti-imbatranireInhibitorii enzimelor elastazei și tirozinazei ar putea fi dezvoltați ca agenți de albire a pielii, anti-îmbătrânire sau antirid pentru a trata tulburările dermatologice44.

Acest studiu a izolat triterpenoizii ursan din frunzele de R.fraxinifolius și le-a elucidat structurile în analize spectroscopice utilizând spectroscopie de masă cu ionizare electrospray (ESI-MS) și „H RMN, |3CNMR și 2D RMN (DEPT, HSQC, HMQC și HMBC). Ulterior, am efectuat teste ale activităților inhibitoare ale elastazei și tirozinazei ale extractelor brute, fracțiilor și compușilor izolați.

Activitatea a doi compuși selectați a fost observată și prin metoda in silico în această cercetare. O abordare de andocare moleculară a fost efectuată cu DockThorl516. Macromoleculele utilizate în această cercetare au fost obținute din banca de date de proteine ​​(RCSB PDB, 2000) cu identități 2y9x și 3hgp pentru tirozinază și elastază, respectiv l718. Macromoleculele au fost optimizate în UCSF Chimera și rezultatele de andocare moleculară. au fost observate cu PyMOL1920.

rezultate si discutii

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 la sută în 100 ug/mL, în timp ce extractul de n-hexan nu a avut activitate (Fig. 1). Unii Rubus au prezentat, de asemenea, activitate inhibitoare a elastazei, cum ar fi R. Sanctus (inhibare procentuală 14.68-49.20 în 100 ug/mL), R.compactus,R. robustus etc.221. Prin urmare, am fracționat extractele active utilizând cromatografie lichidă în vid/VLC și am colectat 11 fracții din fiecare. Fracțiunile din extractul de acetat de etil au prezentat activități slabe de inhibiție a elastazei (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Izolatele au fost identificate și caracterizate folosind cromatografie lichidă-spectroscopie de masă (LCMS), „H și 13CNMR, DEPT, coerență cuantică unică heteronucleară (HSQC), corelație cuantică multiplă heteronucleară (HMQC) și corelație cu legături multiple heteronucleare (HMBC). Tabelul 1 a arătat datele spectrale RMN ale compușilor.

Compusul 1: a fost izolat ca o pulbere albă amorfă. Spectrele LCMS-ESI pentru acest compus au prezentat un vârf de ioni moleculari la m/z 543,32[MH]t, sugerând formula moleculară C32H48O- cu nouă echivalenți de nesaturare. Grupuri funcționale olefinice (1,684 cm-1). Mai mult, spectrele „H RMN ale compusului I au dezvăluit proton metin (CH) un semnal singlet la 2,6, un semnal caracteristic pentru H-18 de tip ursan triterpene cu 19-O-substituții. Triterpenul de tip 19a-hidroxi-ursan are, de asemenea, un semnal tipic de protoni în zona de aproximativ 2,6 ppm. Acest semnal deprotejat poate diferi semnificativ de alte semnale ordinale de protoni metilen, cu o schimbare caracteristică datorată unui proton olefinic (H12) la 5,28(t,J=6Hz).cistanche benefíciosAtribuțiile complete și neechivoce ale deplasării chimice H și l3C au fost asistate de spectrele HMQC(13Cx'H) și HMBC(15Cx'H). {5}}(Fig.2a). S-au găsit alte caractere specifice pentru cele cinci singlete de metil la 1,89,1.02,0,82,1,32,1,20(fiecare,H{24-27;29),un dublet de metil la og 0,92(d, J=6 Hz), iar semnalul protonului olefinic la 5,30 (t, J=7 Hz, H-12). Spectrele 13CNMR prezente prezintă 32 de rezonanțe de carbon și, cu spectre DEPT și HMQC, au afișat doi atomi de carbon carbonil (δC183.70,C-28 și 8-178.96,C{-23), un carbon olefinic la oc 127,23,C-12,un carbon cuaternar olefinic(oc139,49,C-13),un carbon cuaternar purtător de oxigen （o-72.7, C-19 ）, zece metilen alifatici și șase atomi de carbon metil. Cei doi atomi de carbon olefinic la δ-127,23（C-12） și 139,49(C{-13) au fost caracteristici tipului ursan-triterpenoid. Un alt semnal a indicat prezența etilenglicolului （-OCH-CH-O-） a fost indicat la semnale la δ4,62（d, J=11,5 Hz）, 4,05（d, J=11. 5 Hz）,3.52（d, J=11.5Hz）și 4.06（d, J{=11.5Hz）și suportat cu δ61.27（t） și 63.20（t）. Era situat la C-2și C{-3 pe baza prezenței corelației pe distanță lungă în spectrele HMBC. Prin urmare, compusul 1 a fost identificat ca acid 2,3-O-etilen glicol,19-hidroxiuri-12-en{-23,28-dioic (Fig. 3a).

Compusul 2: a fost obţinut ca o pulbere amorfă albă. MS-ESI m/z 527,33 [MH]t (calculat pentru 528,3815). În spectrele LCMS-ESI, un pic de ion molecular este prezent la m/z 527,33 [MH]t, indicând formula moleculară CH Os, care a necesitat 8 grade de nesaturare." Spectrul IR conținea maxime de absorbție corespunzătoare hidroxil (2.927,8 cm{ {15}}) și grupări funcționale olefinice (1.686 cm-1). Mai mult, „spectrele RMN pentru compusul 2 au arătat un singlet de 2,42, care este caracteristic H18 al unei triterpene de tip ursan cu {{24} }}O-substituție.Extract de Cistanche Anti RadiațiiAlte spectre caracteristice specifice au inclus prezența a șase singlete de metil la og1.22 0.76,0.97,0.69,1.3{0și 1.17(fiecare, H -24-28,H{-30),un dublet de metil la 0,91 (d,J{=7Hz) și semnalul protonului olefinic la ou 5,37 (d, J{=7 Hz, H-12). L3 corespunzătoare (spectrele CNMR și DEPT arată 33 de rezonanțe de carbon, iar spectrele HSQC și HMQC indică prezența unui carbon carbonil (oc 182,23, C-28), a unui carbon olefinic （δ-129.36, C -12）, un carbon cuaternar olefinic （δ-140,24, C{-13）, un carbon cuaternar purtător de oxigen (oc73,68, C-19), unsprezece alifatic metilen și șapte metil atomi de carbon. Aceste date au indicat că compusul 2 poartă un schelet ursan-triterpenoid. Celelalte semnale indică prezența grupei funcționale 1,3-propandiol, la og 3,22(d,J{=11 0,5 Hz), 3,42 (d, J=10,5 Hz), 1,38 (m), 1,51 (m) și 4,02 (d, J{=11,5 Hz) și 3,36 (t, J{ {57}}.5Hz). Grupul său funcțional are o corelație pe distanță lungă cu C2-C3. Pe baza acestor rezultate, compusul 2 a fost astfel identificat ca 2,3-O-Propandiol,{{ 66}}hidroxirii-12-en{-28-acidul oic (Figurile 2b și 3b). Un compus similar este acidul 2,3-O-Isopropiliden torments, izolat din Rubus xanthocarpus.7

În tabelul 1, toate spectrele RMN „H și C” au fost comparate cu acidul de chinuri (TA/2a,3a,19-trihidroxi-12-ursen-28-acid oic)², care este un ursan triterpenoid care a fost găsit în mai multe specii Rubus-p Acidul tormentic a avut asemănări puternice cu compușii 1 și 2, cu excepția faptului că schimbările chimice legate de C-23 și C{31-33 au fost diferite. Această porțiune a fost, de asemenea, confirmată în Experimente DEPT, HMQC și HMBC (Fig.2).

Acidul triterpenoid de chinuri este distribuit pe scară largă în alimentele naturale din plante. Are diverse bioactivități: efecte hipoglicemiante, proprietăți antiinflamatorii și anti-aterogene au redus proliferarea celulelor musculare netede vasculare și activități antiproliferative în liniile celulare de cancer renal, de prostată și melanom2426. Prin urmare, deoarece acești compuși au același schelet, ei nu au posibile activități potențiale adecvate.

Figura 4, reprezintă activitatea inhibitorie a elastazei și tirozinazei izolate. Datele obținute din testele de inhibare a enzimelor in vitro au fost exprimate ca abatere standard (SD). Compușii 1 și 2 au inhibat elastaza cu ICso 122,199 și 98,22 ug/mL și, de asemenea, au inhibat tirozinaza cu ICso 207,79 și, respectiv, 221,51 ug/mL. Unii triterpenoizi pentaciclici (acid ursolic și acid oleanolic) au raportat că au activitate de inhibare a elastazei2728. De asemenea, valoarea de inhibare a elastazei a compusului 2 este mai mică decât cea a compusului 1. Ambii compuși au avut o activitate de inhibare mai mică decât controlul pozitiv al acidului oleanolic, care a avut o valoare ICso de 90,39 ug/mL. În acord, studiile anterioare au arătat un ICso pentru acidul oleanolic de 76,5 ug/mL și o valoare ICso de 31,0 ug/ml pentru acidul ursolic28. Analizele cinetice raportate anterior ale triterpenelor pentaciclice au arătat că acești compuși inhibă competitiv și reversibil elastaza neutrofilă. În același studiu, experimentele de andocare moleculară au arătat că fragmentul molecular de schele 28-COOH și legăturile duble din triterpenele pentaciclice sunt esențiale pentru activitățile lor inhibitoare.

Una dintre problemele care apar odată cu înaintarea în vârstă este hiperpigmentarea.cistanche herbaPrin urmare, există o căutare continuă pentru agenți de iluminare a pielii sau noi depigmentări. Suprimarea tirozinazei poate acționa împotriva melanogenezei”. După cum se arată în Fig.4, extractul metanolic și compușii I și 2 au demonstrat activități moderate ca inhibitori ai tirozinazei.

În această cercetare, andocarea moleculară a fost, de asemenea, utilizată pentru a analiza activitățile de legare ale compușilor selectați la tirozinază și elastază ca ținte. Structurile cristaline utilizate au fost 2Y9X, o structură cristalină a tirozinazei din Agaricus bisporus cu inhibitor de tropolon; și BHGP, o structură cristalină a elastazei pancreatice porcine complexată cu un inhibitor peptidil puternic FR130180. Ambele au fost selectate deoarece au fost obținute din același organism utilizat pentru analiza in vitro a acestei cercetări. Macromoleculele sunt, de asemenea, legate de inhibitorii lor respectivi, astfel încât să poată fi obținută starea activă a conformațiilor enzimatice. Cocristalele au fost folosite ca centru al țintei de andocare moleculară pentru a restrânge probabilitățile de legare a compusului, astfel încât procesul de notare să devină mai eficient.

Din andocarea moleculară, s-au obținut afinități medii de legare pentru ambii compuși, așa cum se arată în Figurile 5 și 6. Predicția afinității este utilizată pentru a clasifica diferiți liganzi ținând cont de poziția de energie superioară a fiecărui compus, o predicție a unei poziții energetice mai bune este prezentată de scoruri mai mici ale afinităților de legare16. Redocking-ul de tropolonă inhibitor desemnat s-a făcut cu afinități medii de legare de -7,41 kcal/mol. Afinitățile medii de legare ale compușilor 1 și 2 la tirozinază au fost de -7,84 kcal/mol și, respectiv, de -8,37 kcal/mol (Tabelul 2). S-a prezis că ambii compuși au o afinitate mai bună decât inhibitorul.

Între timp, afinitățile medii de legare ale elastaseredocking-ului a fost de -7,84 kcal/mol. Afinitățile medii de legare ale compușilor 1 și 2 la elastază au fost de -7,58 kcal/mol și, respectiv, de -8,06 kcal/mol. Chiar dacă rezultatul a arătat că compusul 1 are afinități mai mici decât cocristalul, este ușor diferit (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Metode

Proceduri experimentale generale. Spectrele RMN „H și” au fost înregistrate la 500 MHz utilizând un instrument JEOL JNM-ECZ500R/S1. Spectrele infraroșu (IR) au fost măsurate cu un FTIR, IRPrestige-21, Shimadzu. Alte analize au fost efectuate folosind un instrument Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof, un cititor de microplăci VersaMax și un cititor de microplăci BioTek ELX800, foi de aluminiu acoperite cu tradiție TLC-Silicagel 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Germania) , cromatografia pe coloană (CC) a fost efectuată folosind silicagel 60 (Merck, Darmstadt, Germania) cu plasă 70-230 pentru cromatografia deschisă și 230-400 plasă pentru cromatografia în vid. Materiale vegetale. Frunzele de R. fraxinifolius au fost colectate dintr-o zonă de plantație din muntele Pangrango, Java de Vest, la înălțimea de 4.343 ft, în decembrie 2018. Exemplarul a fost identificat de un botanist (Dr. Joni Setijo) la Centrul de Cercetare pentru Biologie, Institutul Indonezian de Sciences, Indonezia, cu numărul de exemplar 033/IPH.1.01/If.07.Colectarea de material vegetal a primit permisiunea fermierului și a respectat reglementările și liniile directoare instituționale.

Extracție și izolare. Frunzele pulbere uscate la aer (2300 g) au fost extrase folosind un aparat Soxhlet cu gradient de solvent (n-hexan, EtOAc și MeOH) pentru a furniza extractele respective, apoi au fost evaporate cu un evaporator rotativ. si cuptor cu vid. Extractul metanolic (291 g) și extractul de acetat de etil (65 g) au fost adsorbite pe silicagel și au fost efectuate cromatografie lichidă în vid/VLC, eluând cu un gradient treptat de EtOAc: MeOH (de la 1:0 la 0:1) până la produce fracții pentru fiecare extract (Eal-Hall și M1-Mill și). Au fost combinate fracții similare care au avut reacții pozitive cu reactivii sulfuric de vanilină în TLC. Randamentul fracțiunii: Eal-3 (2,27 g);Ea4-6(8,47 g);Ea{7-8(12,9 g);Ea{9-11 (22,3 g); și M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02g);M8(166,42g);M9(10,53g);M{{38 }}(2,9 g). Toate fracțiile au fost trimise pentru activitatea inhibitorului elastazei, Fr. M8 a dat cel mai mare randament și a avut o activitate puternică. pr. M8 împărțind succesiv în continuare prin CC pe silicagel (eluent CH2Cl2/MeOH cu un gradient treptat) și purificat utilizând coloana Sephadex LH-20 (eluând cu CHCI{3-MeOH 100:10, v/v. Două fracții au arătat natură solidă și au fost cristalizate cu cloroform și metanol pentru a obține două izolate: compusul 1 (18 mg) și:2 (31 mg). Puritatea tuturor izolatelor a fost evaluată prin TLC bidimensional și vizualizarea spotului folosind 5% sulfuric. acid în metanol, urmată de încălzirea plăcilor la 110 grade timp de 5 min.

Cristalele au fost identificate și caracterizate folosind cromatografie lichidă-spectroscopie de masă (LCMS), LH și îmbunătățirea distorsiunilor „3C prin transfer de polarizare (DEPT) RMN, coerență cuantică unică heteronucleară (HSQC), corelație cuantică multiplă heteronucleară (HMQC) și multiplu heteronuclear. corelația legăturilor (HMBC).

Testul de inhibare a elastazei. Testul de inhibare a elastazei a fost efectuat așa cum s-a descris anterior, cu unele modificări32. Pe scurt, în plăci de microtitrare Nunc-96, alicote de 20-μL de 0.{8-unități/mL PPE în tampon de bază de grad Trizma （pH 8.0 ） au fost amestecate cu probe de 20-μL, iar amestecurile au fost apoi diluate la 180 μL în tampon de bază de grad Trizma. Extractele de testare au fost preincubate cu enzimă timp de 15 minute și s-au adăugat alicote de 20-μL din substratul N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (A3PVN; 2,9 mM) și s-au incubat încă 15 minute. Martorul pozitiv și godeurile martor au conținut acid oleanolic și respectiv apă. Experimentele au fost efectuate în trei exemplare, iar ratele de inhibiție au fost determinate în funcție de absorbție; la 401 nm folosind un cititor de microplăci VersaMax. Procentul de inhibiție a fost calculat folosind următoarea ecuație:

unde E este absorbanța reacției enzimatice, Eb este absorbanța martorului de enzimă, T este absorbanța probei de testat și Tb este absorbanța martorului de testare. de asemenea, valorile au fost determinate dintr-un grafic liniar al procentului de inhibare a elastazei față de concentrație (50, 75,100,125,150 ug/mL). Test de inhibiție a tirozinazei. Inhibarea tirozinazei a fost determinată utilizând metoda de formare a DOPA-crom așa cum s-a descris anterior, cu ușoare modificări13. Pe scurt, în 96-plăci de godeuri, alicote de 20 μL de DMSO (martor) sau compuși de testat la concentrații diferite au fost amestecate cu alicote de 40 μL de tirozinază de ciuperci 30 U/mL (Sigma Aldrich) și 100-μL de 0.1-M tampon fosfat (pH 6,8). Au fost preincubate timp de 10 minute la temperatura camerei. Reacțiile au fost inițiate prin adăugarea de alicote de 4 μL de 10 mML-DOPA în fiecare godeu și incubarea la 37 de grade timp de 20 de minute. Activitatea tirozinazei a fost apoi determinată prin măsurarea absorbanței la 475 nm. Acidul Kojic a fost folosit ca martor pozitiv. Experimentele au fost efectuate în trei exemplare. Procentul de inhibare a tirozinazei a fost calculat folosind următoarea ecuație:

unde E este absorbanța reacției enzimatice, Eb este absorbanța martorului de enzimă, T este absorbanța probei de testat și Tb este absorbanța martorului de testare. de asemenea, valorile au fost determinate dintr-un grafic liniar al procentului de inhibare a elastazei față de concentrație (250,125,62,5,31,25,15,6 ug/mL).

Andocare moleculară. În această cercetare, activitatea farmacologică in silico a fost prezisă cu andocare moleculară folosind un medic. Andocarea moleculară țintită a fost realizată prin utilizarea unui ligand cocristalizat ca centru al situsului activ. Structura 2Y9X a fost utilizată pentru andocarea moleculară a tirozinazei cu tropolon, un inhibitor al tirozinazei de ciuperci, ca cocristal. Centrul site-ului de andocare moleculară este definit la -10.032;-28.769 și -43.467 ca dimensiuni X, Y și, respectiv, Z. Lanțul A a fost separat pentru utilizare și atomul de holmiu a fost îndepărtat din structură folosind UCSF Chimera.

Structura 3HGP, o elastază porcină a fost, de asemenea, utilizată în această cercetare. FR130180, deoarece cocristalul a fost folosit ca centru al locului de andocare moleculară. Coordonatele au fost 12.453, 9.237 și 1.199 pentru dimensiunile X, Y, Z, respectiv. Afinitatea de legare a fost analizată din cei mai buni zece conformeri ai fiecărui calcul de andocare moleculară.

Acest articol este extras din Scientifc Reports|(2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x