Determinarea structurală RMN fără ambiguitate a (plus)-catechină-produșii de reacție dimerici lacazei ca potențiali markeri ai oxidării strugurilor și vinului

Pentru mai multe detalii, contactați:tina.xiang@wecistanche.com

Abstract:( plus )-Catechina—laccaseoxidareStandardele dimerice au fost hemisintetizate folosind lacaza de la Trametes Versicolor este o soluție apă-etanol la pH 3,6. Au fost detectate opt fracții corespunzătoare la opt potențiali produși dimerici de oxidare. Profilele fracțiilor au fost comparate cu profilele obținute cu alte două oxidoreductaze:polifenol oxidazaextras din struguri și lacază din Botrytis cinerea. Profilurile au fost foarte asemănătoare, deși unele diferențe minore au sugerat posibile diferențe în reactivitatea acestor enzime. Cinci fracții au fost apoi izolate și analizate prin spectroscopie RMN 1D și 2D. Adăugarea de urme de azotat de cadmiu în probele solubilizate în acetonă a condus la semnale RMN complet rezolvate ale protonilor fenolici, permițând determinarea structurală fără ambiguitate a șase produși de reacție, una dintre fracții conținând doi enantiomeri. Aceste produse pot fi utilizate în continuare ca markeri de oxidare pentru a investiga prezența și evoluția lor în vin în timpul vinificației și învechirii vinului.

Cuvinte cheie: marker de oxidare;( plus )-catechină; semnale RMN fenolice; lacază; azotat de cadmiu; polifenol oxidaza

Faceți clic pentru a obține mai multe informații

1. Introducere

Polifenolisunt o familie de compuși chimici prezenți pe scară largă în natură. Se găsesc în cantități semnificative în ceai [1], cacao [2,3], afine [4], struguri [5l și produse fermentate precum vinul [6]. Fiind ținte primare de oxidare J7,8], structurile chimice ale polifenolilor evoluează continuu. Aceste modificări afectează proprietățile organoleptice ale multor tipuri de alimente; sunt responsabili de fenomene precum rumenirea alimentelor [9] și modificări ale caracteristicilor senzoriale ale vinului [10,11. În enologie, acest fenomen de oxidare are loc în struguri sau vinuri. În ceea ce privește oxidarea enzimatică, principalele enzime responsabile de rumenire sunt oxidoreductazele, mai precis,polifenol oxidazaprezent în struguri și lacaza produsă de Botrytis cinerea [12].

Enzimaticoxidareapare în principal în mustul de struguri, dar rumenirea ulterioară a vinului se poate datora reacțiilor de oxidare chimică |7,13]sau lacazei Botrytis cinerea care poate fi foarte stabilă în timpul învechirii vinului14. Pe substraturile fenolice pot avea loc două activități enzimatice de oxidare: activitatea monofenol oxidazei caracterizată prin hidroxilarea unei poziții adiacente grupării hidroxil existente și activitatea difenol oxidazei corespunzătoare oxidării orto-dihidroxibenzenilor la orto-benzochinone.

Conform Comitetului de nomenclatură al Uniunii Internaționale de Biochimie și Biologie Moleculară (NC-IUBMB), aceste activități enzimatice sunt catalizate de enzimele din clasa EC1-care corespund oxidoreductazelor. Printre acestea, cele trei clase principale de oxidoreductaze care catalizează oxidarea polifenolului sunt EC1.14.18.1 (monofenol monooxigenază), EC1.11.1 (peroxidază/POD) și EC1.10.3 (oxidoreductaze care acționează asupra difenolilor).

Această ultimă clasă este împărțită în diferite subclase, iar două dintre ele au părut deosebit de interesante pentru acest studiu: EC1.10.3.1 (polifenol oxidază/PPO) și EC1.10.3.2 (laccază) (vezi Materialele suplimentare Figura S1).

PPO, lacaza și peroxidaza sunt oxidoreductazele responsabile în principal de rumenirea în timpul procesării strugurilor [13]. Rumenirea cauzată de POD este neglijabilă în fructe, dar poate crește degradarea fenolilor atunci când este combinată cu PPO[15]. PPO este prezent în mod natural în struguri și este capabil să catalizeze oxidarea monofenolilor în catecoli și a catecolilor în pigmenți bruni [8,13,16]. Lacazele, care apar la strugurii infectați cu Botrytis, au un spectru de acțiune mai larg|17|deoarece pot cataliza oxidarea multor substraturi diferite. Principalele ținte de oxidare ale lacazelor rămân 1-2 și 1-4 dihidroxibenzenul.

În vin, benzochinona produsă prin oxidare (PPO sau lacaze) poate suferi cu ușurință reacții ulterioare în funcție de proprietățile lor redox și de afinitățile electronice [15]. Aceștia pot fie să acționeze ca electrofili și să reacționeze cu derivați amino [18], fie să acționeze ca oxidanți și să reacționeze, printre altele, cu substraturi fenolice. În funcție de conformația lor chimică (chinonă sau semichinonă), benzochinona poate duce la diferiți produși de reacție de oxidare. La un pH neutru, (plus)-catechina va fi oxidată la chinonă pe poziţia inelului A C5 sau C7 şi va duce la formarea a şase posibili izomeri dimerici care implică o legătură între poziţia inelului B C2', C5' sau C6’ al unității superioare de catechine și poziția inelului A C6 sau C8 a unității inferioare [19,20]. Dehidrodicatechina este un produs binecunoscut al acestei cuplari [21]. Pozițiile de etichetare ale structurilor sunt afișate în Figura 1. În condiții acide, formele semi-chinonice pot fi prezente și pe inelul B (poziția OH3'sau OH4') și pot duce la patru posibili izomeri dimerici [20,22] cu unitatea superioară de catechine și inelul A al unității inferioare (poziția C6 sau C8). Oxidarea enzimatică a catechinei a fost investigată în studiile anterioare [22,23], iar produșii de oxidare asociați au fost caracterizați prin HPLC [24], deși mai rar izolați și niciodată complet caracterizați prin RMN.

Scopul acestei lucrări a fost în primul rând compararea prin UHPLC-MS a profilurilor produselor de oxidare dimerică( plus )-catechină în prezența a trei extracte de oxidoreductază, adică PPO extras din struguri, lacaza din ciuperca Botrytis cinerea prezentă în vinurile dulci botritizate. [14], iar lacaza din Trametes Versicolor.

Al doilea obiectiv a fost hemisinteza și caracterizarea structurilor unor produși de oxidare dimerică prin spectroscopie RMN obținută cu lacaza din Trametes Versicolor.

2. Rezultate și discuții

2.1. Comparația profilurilor produselor de reacție dimerică cu trei oxidoreductaze și (plus)-catechină diferite

(plus)-catechina a fost mai întâi oxidată în prezența lacazei din Trametes Versicolor la pH 3,6 în soluția de vin model. După separarea fracției dimerice de catechină reziduală (plus) și alte fracții polimerice, opt fracții majore au fost colectate și analizate prin UHPLC-UV-MS, notate de la N1 la N8 în ordinea crescătoare a timpului de retenție (Tabelul 1). Spectrele de masă electrospray în mod pozitiv au arătat vârfurile ionilor [M plus H] plus la m/z 579 pentru N1 până la N6, corespunzând ipotetic unui dimer format dintr-o legătură simplă între două unități de catechină și [M plus H] plus la m/577 pentru N7 și N8, sugerând ipotetic formarea unei legături suplimentare.

Aceste optoxidarefracțiile au fost potențial observate după depolimerizarea chimică a unei fracțiuni de tanin în lucrările anterioare [25,26] și ar putea fi, eventual, aceleași cu cele deja descrise de Guyot și colab. [20], chiar dacă condițiile experimentale au fost ușor diferite. Într-adevăr, în acest studiu anterior, un extract brut de PPO a fost utilizat la pH 3 și 6 pentru a obține opt fracții. În studiul de față, trei enzime diferite au fost comparate la pH 3,6 în soluția de vin model. Analiza comparativă LC-MS a fracțiilor majore de oxidare obținute cu cele trei enzime diferite (laccaza din Trametes Versicolor, lac-caza din Botrytis cinerea și polifenol oxidaza extrasă din struguri) sunt prezentate în Tabelul 2. Pentru fiecare dintre cele opt fracții, timpii de retenție au fost aproape identici cu diferitele enzime și m/z similare au fost determinate cu analiza MS. Aceste rezultate susțin ipoteza că s-au obținut aceleași fracții pentru fiecare enzimă, conținând produse cu structuri similare cu cele presupuse de Guyot și colab. [20]. Lopez-Serrano și Ros Barcel6 [27] au efectuat, de asemenea, un studiu comparativ al produselor de oxidare a (plus)-catechinei cu două enzime diferite: peroxidază și polifenol oxidază, ambele extrase din căpșuni. Ei au ajuns la concluzia că produsele obținute cu cele două enzime erau calitativ la fel. Un compus suplimentar numit N4' cu m/z=578 Th și Rt{=15.66 min a fost observat în experimente cu lacaza din Botrytis cinerea și a extras PPO, dar nu și cu lacaza din Trametes Versicolor, ceea ce sugerează posibile diferențe în reactivitate pentru aceste enzime.

2.2. Studiul și optimizarea parametrilor fizico-chimici pe semnalele OH fenolice și alifatice 1H-RMN

Caracterizarea structurală a dimerilor de procianidine poate fi obținută prin analiză RMN. În special, poziția precisă a legăturii dintre unități poate fi determinată folosind spectre de corelație HMBC și/sau ROESY [28,29] (Figurile S2 și S3). În cazul unei legături de tip eter (COC), este necesară atribuirea protonilor semnal hidroxil. De asemenea, poate fi crucial în cazul legăturilor CC dacă unii protoni alifatici sau aromatici se suprapun sau dacă lipsesc unele corelații cheie. Cu toate acestea, chiar și într-un solvent aprotic, protonii hidroxil ai polifenolilor apar adesea ca semnale ample din care nu pot fi obținute informații structurale [30]. Această problemă a fost abordată provizoriu prin adăugarea de urme de

Cd(NO3)2 în soluțiile de probă. Într-adevăr, „H semnalele largi ale grupărilor OH se datorează schimbului intermolecular dintre acești protoni OH și alți protoni din solvent sau dizolvat. Prin reducerea legăturilor intermoleculare, prezența azotatului de cadmiu în probe poate scădea aceste schimburi, îmbunătățind astfel claritatea semnalelor de protoni OH.

2.2.1.Efectul adaosului de cadmiu

După liofilizare, cele cinci fracții N2, N3, N4, N6 și N8 au fost solubilizate în acetonă-dg. Apoi, spectrele RMN de protoni 1D au fost obținute la 25 de grade înainte (Figura 2A) și după adăugarea unor cantități mici de cadmiu (Figura 2B). În acetonă-d. pură, protonii OH fenolici din toate fracțiile au apărut ca vârfuri largi. După adăugarea de cadmiu, acești protoni au prezentat semnale foarte rezolvate în cazul fracțiilor N6 și N8, în timp ce pentru fracțiile N2, N3 și N4 semnalele au fost doar puțin mai clare. De asemenea, trebuie menționat că creșterea conținutului de Cd nu a avut niciun efect asupra rezoluției semnalului OH, deoarece nu s-a observat claritate sau lățime a lățimii de vârf atunci când s-au adăugat cantități mici succesive de Cd la probe (datele nu sunt prezentate).

Semnalele OH fenolice cu rezoluție ridicată din produsele N2, N3 și N4 au fost obținute datorită uscării și rezolubilizării suplimentare (Figura 2C, D).

Diferența de comportament la adăugarea Cd între fracții poate fi explicată prin puterea interacțiunilor moleculare: mai puternică în cazul N2, N3 și N4 comparativ cu N6 și N8, fiind necesar un pas suplimentar pentru a rupe aceste legături.

Acest pas suplimentar poate fi pasul cheie atunci când se utilizează Cd pentru a obține semnale OH fenolice cu rezoluție ridicată în orice situație, indiferent de originea probelor, reacția de sinteză sau produsele polifenolice naturale.

O lucrare anterioară care se ocupă de caracterizarea structurală fără ambiguitate apolifenoldimeri care utilizează semnale RMN fenolice OH cu rezoluție înaltă datorită adăugării de azotat de cadmiu a fost publicat în 1996[30]. După cunoștințele noastre, de atunci nu a fost publicată nicio altă lucrare de cercetare care să utilizeze această metodologie. Ulterior, alte investigații au fost întreprinse pentru a atinge acest obiectiv, fie prin adaosuri dozate cu acid picric [31], fie prin utilizarea unei temperaturi scăzute de achiziție [32]. Acest lucru poate fi explicat prin pasul suplimentar necesar pentru a obține un efect decisiv asupra clarității vârfului OH cu adăugare de Cd, așa cum este descris mai sus. Cu toate acestea, cadmiul pare a fi de mare valoare, deoarece semnalele cu rezoluție ridicată pot fi obținute fără a fi nevoie să adăugați cantități precise, în contrast cu achiziția de acid picric sau spectre RMN la temperaturi scăzute.

2.2.2. Efectul temperaturii

O scădere a temperaturii de la 25 grade C la 15 grade nu a avut niciun impact asupra clarității semnalelor OH fenolice sau OH alifatice. Cu toate acestea, deplasările în jos ale vârfurilor de protoni schimbabile ne-au permis să separăm unele semnale OH fenolice și alifatice suprapuse, făcând identificarea lor mai evidentă (Figura 3). Prin scăderea temperaturii, rata de schimb de protoni a fost redusă și s-ar putea aștepta la vârfuri OH alifatice mai ascuțite [31]. Temperatura de 15 grade nu este, evident, suficient de scăzută pentru a obține semnale OH alifatice bine rezolvate. Cu toate acestea, ne-a permis să identificăm în mod clar rezonanța a doi protoni OH alifatici din probele N3 și N6 și a unuia din proba N8. Spectrul eșantionului N2 a prezentat, de asemenea, două semnale de protoni alifatici OH, care se distingeau mai mult la 25 grade C decât la 15 grade (Figura 2E). spectre, indiferent dacă temperatura a fost setată la 25 de grade sau la 15 grade C, din cauza suprapunerii persistente (Figura 2E).

2.3. Caracterizarea structurală a standardelor dimerice - Analiza spectrului RMN

Spectrele RMN ale fracțiilor N2, N3, N4, N6 și N8 au arătat că produsele de oxidare au o puritate ridicată, deoarece intensitățile semnalului altor compuși detectați au fost mai mici de 10% în comparație cu cele ale acestor produse.

În toate spectrele, pot fi distinse patru regiuni de deplasare chimică lH tipice unităților de catechine (Figura 2C): semnalele protonilor alifatici ai inelelor piran (inele C) se găsesc în regiunea de la 2,3 la 5.0 ppm, și cei ai protonilor semnal aromatici ai inelelor de resorcinol (inele A) și ai inelelor catecol (Aduce) de la 5,5 la 6,3 ppm și, respectiv, de la 6,3 la 7,1 ppm. Semnalele OH fenol ale inelelor A și B au apărut de la 7,1 la 10 ppm. Spectrele RMN ale ambelor fracții au arătat prezența unor seturi distincte de semnale de unități de catechine într-un raport de intensitate constant: au fost observate două seturi de semnale în spectrele fracțiilor N2, N3, N6 și N8 în conformitate cu prezența dimerilor și patru seturi în spectrele N4, care pot corespunde unui tetramer, doi dimeri sau un amestec de oligomeri diferiți, adică un trimer plus un monomer. Pentru a determina gradul de oligomerizare a produselor prezente în fracția N4, s-a efectuat un experiment 'H DOSY folosind un amestec care conține alicote din ambele fracții N4 și N2. Coeficienții de difuzie ai tuturor semnalelor au afișat valori similare (Figura 4), indicând prezența a doi dimeri ai catechinei în fracția N4.

Datorită semnalelor de fenol OH complet rezolvate, care oferă rezultate cantitative fiabile, tipul de legătură dintre unitățile de catechine poate fi dedus direct din integrarea suprafeței de vârf. Astfel, pentru ambele fracții, N3 și N6, lipsa unui OHfenol (aparținând fie resorcinolului, fie unui inel catecol) și lipsa unui proton aromatic resorcinol au indicat o legătură interflavanică (IFL) de tip eter care implică o Opoziție într-un A. sau inel B și o poziție C6 sau C8 într-un inel A. În cazul probei N2, doi protoni aromatici au lipsit, unul de inel B și unul de inel A, implicând un CA-CB IFL. Spectrul 1D 'H al fracției N4 a arătat că lipseau doi protoni ai inelului B, precum și doi protoni ai inelului A. Legăturile dintre unitățile dimer ale fracției N4 sunt astfel ambele tipuri de CC. Spectrele fracției N8 au fost destul de diferite de celelalte patru. Unele semnale erau tipice pentru unitățile de catechine, în care lipseau trei fenoli OH, un inel aromatic A și un protoni inel B, precum și un OH alifatic. Pe de altă parte, alte semnale RMN sunt atipice pentru o unitate de catechine: metilen cu deplasări chimice 13C deblocate (~ 40 ppm) și o grupare cetonă (~ 192 ppm).

Sistemele de spin de protoni ale inelelor C, A și B au fost determinate folosind ambele spectre 'H 1D și 1H 2D TOCSY (neprezentate). Au fost observate două sisteme de spin ABMX C-ring (tipic catechinei) în spectrele fracțiilor N2, N3, N6 și N8 și patru pentru fracția N4. În spectrele fracțiilor N2, N3, N6 și N8, două dublete meta-cuplate (J~2Hz) și unul singur în regiunea inelului aromatic A au fost atribuiți, respectiv, protonilor inelului A ai unității catechinei nelegate. și la protonul rezidual al inelului A al unității catechinei legate de C6-sau C8-. În spectrele N4, datorită prezenței a doi dimeri, patru dublete meta-cuplate și două singlete au fost detectate și alocate așa cum este descris mai sus. Sistemele de protoni inelului B au fost, de asemenea, determinate cu ușurință din aceste spectre și ne-au permis să identificăm două sisteme de spin de protoni ABM pentru dimerii fracțiilor N3 și N6, în timp ce un sistem de spin de protoni ABM și unul AB au fost detectate pentru dimerul N2 și unul ABM și un sistem de spin de proton AM pentru dimerul N4. Dimerul N8 a prezentat doar un sistem de spin ABM B-ring tipic unui monomer de catechină.

2.3.1. Determinarea poziției inelului A a IFL a dimerilor fracțiilor N2, N3, N4 și N6

Stabilirea punții situate pe inelul A de dimeri (adică, poziția C6A sau C8A) necesită atribuirea protonului HA rezidual al unității de catechine legate de CA. Datorită semnalelor OH fenolice cu rezoluție ridicată, un punct de plecare ușor a fost identificarea celor doi protoni OHfenol ai unităților legate de inel A, adică inelul A care

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm） care au fost atribuite cu ușurință C7A și, respectiv, C8A. Odată ce C6A și C8A sunt atribuite, protonul HA rezidual poate fi atribuit direct spectrelor HSQC. S-a constatat astfel că acest proton HA rezidual a fost H6A pentru toate fracțiile N2, N3, N4, N6. IFL-ul dintre unitățile de catechine a implicat astfel o poziție C8A pentru toți dimerii.

2.3.2. Determinarea poziției inelului B a IFL

Dimeri ai fracțiilor N2 și N4. Spectrele fracției N2 au arătat două tipuri diferite de sisteme de spin de protoni inel B: unul AMX corespunzător inelului B al unității nelegate și unul AM cu o constantă de cuplare de aproximativ 8 Hz, caracteristică pentru H6'B și H5' B a unei unități C2'B-legate. Legătura dintre unitățile dimerului N2 este astfel C2'B-C8A. Spectrele RMN ale fracției N4 au arătat, de asemenea, diferite sisteme de spin B: două AMX, corespunzătoare inelului B nelegat și două sisteme AXspin, ambele afișând constante de cuplare de aproximativ 2 Hz, care sunt caracteristice pentru H2'B și H6' protoni B ai unităților legate de C5'B. Prezența corelațiilor H/13C pe distanță lungă între banda H6 și C8A, care au fost observate în spectrele HMBC ale celor doi dimeri, sunt în conformitate cu o legătură C5/'B-C8A (Figura 5).

Dimeri ai fracțiilor N3 și N6. Spectrele fracțiilor N3 și N6 au arătat prezența a două sisteme de protoni AMX B-ring și lipsa unui semnal OH fenol. Deoarece toți protonii fenolici OHA ai unităților dimer au fost identificați (așa cum este descris mai sus), semnalul OH fenolic lipsă poate fi fie cel al OH3'B, fie cel al OH4'B.

Poziția OH (3'B sau 4'B) poate fi determinată cu ușurință prin corelații ROE cu H2'Bor H5'B, respectiv, sau folosind corelații HMBC pe distanță lungă, așa cum este ilustrat în Figura 5.

Atribuirea OH rezidual al inelelor B a fost efectuată cu ușurință folosind fie corelații HMBC sau ROESY pe distanță lungă, așa cum este ilustrat în Figura 5. În cazul dimerului N3, a fost observată o corelație ROE între H5'B și OH rezidual. „B al unității de catechină legată prin inelul său B. Acest OH a fost astfel identificat ca OH4'B. În cazul fracției N6, OH'B rezidual a fost atribuit OH3'B, deoarece s-a observat o corelație ROE între acest OH și H2'B. Corelațiile HMBC pe termen lung sunt în concordanță cu aceste atribuții. Pozițiile de legătură ale acestor doi dimeri au fost apoi determinate după cum urmează: CO3'B-C8A și CO4'B-C8A pentru N3 și N6. respectiv.

Fracția N8. Analiza spectrală a dimerului N8 a arătat că o unitate a acestui dimer este catechina cu două poziții de legătură una inelul A, una la C8A și cealaltă la poziția C-O7A, deoarece protonii H8A și OH7A sunt dispărut. Cealaltă unitate a acestui dimer a prezentat caracteristici spectrale singulare, indicând pierderea aromaticității inelului B și prezența mai multor poziții de legătură pe ambele inele B și C.

Semnalele'H RMN care decurg din inelul B au fost două dublete la 2,49 și 2,71 ppm, prezentând o cuplare geminală de ~15 Hz (12,03 ppm) tipică unei grupări metilen și un singlet la 6,38 ppm care rezultă dintr-un proton etilenic. Deoarece acești protoni de metilen și etilenă nu au fost cuplati, este probabil ca aceștia să fie în pozițiile 2'B și 5'B. Spectrul HIMBC a arătat toate corelațiile, permițând atribuirea precisă a acestor atomi de carbon din inelul B, așa cum este ilustrat în Figura 5. H2C al acestei unități a dat trei corelații cu carbonii din inelul B: unul este carbonul metilen la ~45 ppm, care a fost astfel atribuit C2'B și restul doi, cu atomi de carbon rezonând la ~90 ppm și ~162 ppm, care pot fi alocați lui C1'B și C6'B.H5'B au dat doar corelații puternice 3J cu doi atomi de carbon cuaternari ai acestui inel B : unul este carbonul atribuit anterior lui C3'B(~95 ppm), iar celălalt, care a rezonat la ~90 ppm, ar putea fi astfel atribuit lui C1'B. Carbonul la ~162 ppm a fost apoi dedus ca fiind C6'B.

Prezența unui OH alifatic (~5,8 ppm) în poziția C3'B (~95 ppm) a fost determinată prin corelația sa ROE cu ambii protoni H2'B. Mai mult, OH3/B a dat corelație HMBC cu un carbon cuaternar la ~ 192,5 ppm, caracteristică unei grupări cetonice în poziția C4'B.

Ecranarea acestui C1'B de aproximativ 40 ppm este în conformitate cu o pierdere a aromaticității inelului B. În plus, lipsa OH la poziția C7A a celeilalte unități este în acord cu o legătură eterică C1'BO-C7A.

Datele RMN au arătat că inelul C al acestei unități nu are OH3C. Prezența unei legături C3C-O-C3'B este în conformitate cu ecranarea C3C de aproximativ 1,5 ppm, precum și cu deplasarea chimică a C3'B, care este tipică carbonului hemicetal (95 ppm).

În total, datele spectrale RMN ne permit să concluzionam că acest dimer corespunde dehidrocatechinei A descrisă mai devreme de Winges et al.[33] iar apoi de Guyot et al.[20].

Structurile celor șase compuși dimerici determinați prin aceste analize RMN sunt prezentate în Figura 6, N2, N3, N6 și N8 fiind produse pure și N4 fiind un amestec de doi izomeri.

3. Materiale și Metode

3.1.Produse chimice

(plus)-hidrat de catechină Mai mare sau egal cu 98 la sută; lacaza din Trametes Versicolor(0,94 U·mg-1); fosfat de sodiu dihidrat dibazic Mai mare sau egal cu 98 %; acid citric (reactiv ACS, azotat de cadmiu tetrahidrat 99,997 la sută; acidul formic și Amberlite XAD7HP au fost obținute de la Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, SUA). Acetonă-dgwa este achiziționată de la Euriso-top (Saarbrüicken, Germania) și trifluoracetic acid (TFA) de la Roth Labo (Karlsruhe, Germania). Apa LC-MS, acetonitril LC-MS (ACN) și metanol LC-MS (MeOH) au fost toate de la VWR (Radnor, PA, SUA).

3.2. Prepararea Soluției Model de Vin

Soluția de vin model a fost o soluție de etanol/apă (12/88;o/o) cu acid tartric 0,033 M, ajustată la pH 3,6 cu NaOH 1 M [34].

3.3. Extracte brute de struguri PPO

Extractul PPO a fost preparat așa cum a fost descris anterior de Singleton și colab.[35]. Strugurii congelați au fost mai întâi amestecați într-un tampon acetat (1,5 M, pH5; 10 gL-I acid ascorbic). Amestecul a fost apoi filtrat şi centrifugat (3000 g; 10 min). Reziduul a fost în final spălat cu acetonă (80 la sută) şi uscat la aer.

3.4.Lacaza din Botrytis Cinerea

Laccaza din Botrytis cinerea a fost obținută așa cum este descris de Quijada-Morin și colab.[36]. A fost produs din tulpina VA612 (colectată în 2005 într-o podgorie din Hautvillers, Champagne, Franța, din soiul Pinot Noir). Pe scurt, culturile pe mediu solid de drojdie de malț au fost lăsate timp de o săptămână la 24 de grade sub lumină albastră. Sporii au fost apoi răzuiți și inoculați într-un balon Erlenmeyer de 50{0 mL care conținea 125 mL de mediu de cultură (4{{30}} gL-1glucoză, 7 gL{{1{0}}glicerol, 0,5 g·L{-1L-histidină, 0,1 g:L{-1 CuSO,1,8g{-1 NaNO3,0,5g:L -1 KCl, 0,5 gL-1 CaCl2·H2O, 0,05 g: L{-1 FeSO4,7H2O, 1,0 g L{-1KH2PO4 și 0,7 g{-1 MgSO 4-7H2O). După 3 zile de incubare și 2 zile de creștere în același mediu anterior, acid galic (2 gL-1) a fost adăugat la pre-culturi. După 5 zile, mediul lichid a fost filtrat, iar supernatantul a fost supus la filtrare tangenţială într-un sistem de filtrare Quixstand (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England) echipat cu o greutate moleculară de 30 kDa tăiată membrana. Concentratul a fost supus în final la o diafiltrare împotriva apei distilate și s-au păstrat doar fracțiile care au prezentat activitate oxidantă împotriva ABTS (-80 grad ).

3.5.Procedura de oxidare

O soluție de lacază (1 gL-1) în tampon fosfat-citrat a fost pregătită anterior și adăugată la o soluție de 6 g.L{-1( plus )-catechină (vin model) pentru a obține o concentrație finală de lacază de { {6}}.3 gL-1. Soluţia obţinută a fost apoi agitată lent (180 rpm) la temperatura camerei timp de 2 ore. Concentrațiile au fost optimizate anterior, iar experimentarea a fost efectuată în trei exemplare.

3.6. Oprirea reacției pe rășină Amberlite XAD7HP

O coloană ambră lite a fost condiționată cu etanol (absolut) și clătită cu două volume de coloană de apă mili-O. Mediul de reacție lacază/(plus)-catechină anterior a fost picurat pe coloană și mai întâi eluat cu două volume de coloană de milli-Qwater [37]. Coloana a fost apoi eluată cu etanol până când fracţiunea colectată a fost necolorată. Doar fracțiile de etanol au fost păstrate, evaporate și liofilizate. Pulberea a fost păstrată la -80 grade până la utilizare.

3.7.Procedura de purificare a fracției dimerice folosind cromatografia rapidă

Pulberea liofilizată a fost mai întâi purificată utilizând un sistem de cromatografie rapidă puriflash430 echipat cu un detector UV setat la 280 nm și o coloană Puriflash diol 50 um f0025. Faza mobilă binară a constat din acetonitril (solvent A) și metanol (solvent B), ambele acidulate cu 0,1% TFA. S-au efectuat o serie de injecţii la un debit constant de 20 mL·min-1, folosind următorul gradient: 100 la sută A timp de 4,4 min; 0-10 procente B în 10 minute; 10 procente B timp de 5 minute; 10-90 procente B în 5 minute; 90 procente B timp de 3 minute;90-10 procente B în 2 minute; 10 procente B timp de 10 minute. Volumul de injectare a fost de 1 ml (300 mg pulbere liofilizată dizolvată în 1 ml de solvent A). Au fost colectate de fiecare dată trei fracții distincte. Primul corespundea catechinei reziduale (plus), iar al treilea a fost un amestec de polifenoli cu greutate moleculară mare. A doua fracție eluată, care conține un amestec de produși de oxidare dimerică, a fost evaporată și liofilizată înainte de a doua etapă de purificare.

3.8. Procedura de purificare a produselor de oxidare din fracția dimerică folosind un sistem cromatografic de semipreparare

Fracția care conține produși de oxidare dimerică a fost purificată folosind un sistem de cromatografie la presiune medie Bio-Rad NGC 10 echipat cu o coloană Microsorb cu fază inversă Varian Dynamax C18 (250 × 21,2 mm; 3 um). Faza mobilă binară a constat din apă mili-O (solvent A) și 80% acetonitril, 20% apă Milli-Q (solvent B), ambele acidulate cu 0,05% TFA. O serie de injecții (300 uL) de pulbere liofilizată (20 mg dizolvate în 200 uL de solvent A și 100 uL de ACN) au fost efectuate în următoarele condiții de eluție: 100 la sută A timp de 4 min; 0-35 procente B în 46 de minute;35-100 procente B în 2 minute; 100 la sută B timp de 5 minute. Opt fracții distincte au fost colectate de fiecare dată, corespunzătoare semnalelor UPLC pure la 280 nm. Fiecare fracție a fost evaporată și liofilizată înainte de analiza RMN.

3.9.Pregătirea probei pentru analiza RMN

Aproximativ 1 mg din fiecare pulbere liofilizată cântărită în tuburi Eppendorf a fost dizolvată în 500 μL de acetonă-dg. Apoi, la probe s-au adăugat ~10 uL dintr-o soluție concentrată de azotat de cadmiu în acetonă-d, iar soluțiile rezultate au fost transferate în tuburi RMN de 5 mm pentru analiza RMN. O etapă suplimentară a fost efectuată pentru unele probe: după solubilizarea pulberilor liofilizate în acetonă-dg în prezența urmelor de cadmiu, probele au fost evaporate la sec și apoi resolubilizate în acetonă-d fără adaos suplimentar de Cd.

3.10.Specificațiile instrumentului

Analiza UPLC-MS. Reacțiile au fost monitorizate folosind două sisteme UPLC-MS. Primul a fost folosit pentru a identifica cu precizie timpii de retenție a produselor folosind o metodă de gradient lung. adică, cromatografia lichidă cu performanță ultra-înaltă Waters cu fază inversă cuplată la spectrometria de masă (UHPLC-MS). Sistemul de cromatografie lichidă a fost un Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, SUA) echipat cu un detector cu matrice de fotodiode. Am folosit o coloană Acquity UPLC HSS T3 (1,8 um, 2,1 × 150 mm). Temperatura coloanei a fost de 25 de grade. Faza mobilă binară a constat din 0,1% acid formic în apă (solvent A) și acetonitril (solvent B). Separarea a fost efectuată la un debit constant de 0.25mL·min-1, folosind următorul gradient:8-11 procente B în 2 min; 11 procente B timp de 8 min; 11-25 procente B în 15 min;25-55 procente Bin 5 min;55-99 procente Bin 1 min;99 la sută B pentru 4 min;99-8 procente Bin1 min;8 la sută B timp de 4 min. Volumul de injectare a fost de 5 μL. Spectrometrul de masă a fost un quadrupol simplu Waters Acquity QDa cu ionizare prin electrospray (ESI) (Waters, Milford, MA, SUA). Tensiunea capilară a fost setată la 0,8 kV. Spectrele de masă au fost obținute pe un interval de masă de 200-900 subțire modul ion pozitiv.

Al doilea sistem UHPLC-MS, folosit pentru verificarea rapidă în timpul etapelor de purificare, a fost același cu cel descris anterior, cu o coloană Acquity UHPLC HSS T3 （1,8 μm, 2,1×100 mm） încălzită la 38 de grade. Separarea a fost efectuată la un debit constant de 0,55 mL·min-1, folosind următorul gradient rapid: 0,1-40 procent B în 5 min; 40-99 procente B în 2 minute; 99 la sută B timp de 1 min; 99-0,1 la sută B în 1 min. Volumul de injectare a fost de 2 μL. Spectrometrul de masă a fost o capcană de ionizare cu electrospray (ESI) Bruker Amazon X (Bruker Daltonics, Bremen, Germania). Tensiunea capilară a fost setată la -5,5 kV. Spectrele de masă au fost obținute pe un interval de masă de 50-2000 subțire modul ion pozitiv.

Toate analizele UPLC-MS au fost efectuate în trei exemplare.

Instrumentare RMN. Toate spectrele RMN au fost înregistrate pe un spectrometru Agilent DD{{0}} MHz (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA), care funcționează la 500,05 și 125,74 MHz pentru nucleele de protoni și carbon-13, respectiv, folosind o sondă de detecție indirectă de 5 mm echipată cu o bobină de gradient.1D'H și 13C, 2Dhomonuclear1H TOCSY și ROESY și heteronuclear lH/13C HSQC și HMBC. Experimentele au fost efectuate folosind secvențe de puls clasice și analizate atât folosind VNMRJ4.2, cât și MestReNova 14. .1 software (Mestrelab Research, Spania). Măsurătorile DOSY au fost achiziționate și procesate așa cum s-a descris anterior 38]. Parametrii de achiziție ai secvenței de impulsuri DgcsteSL au fost următorii: timpul de întârziere a difuziei și lățimea impulsului de gradient au fost setate la 50 ms și, respectiv, 2 ms, intensitatea gradientului (g) a fost crescută în 16 pași, cu o distanță egală de g2 de la 0,3 la 32G·cm-I. După corecția de fază, spectrele 2D DOSY au fost construite din măsurarea înălțimii de vârf folosind software-ul VNMRJ4.2.

Toate spectrele au fost raportate la semnalele solvent acetonă-dg (semnal rezidual 'H la 2,05 ppm şi semnal 13C la 29,92 ppm).

4. Concluzii

S-a investigat acțiunea a trei oxidoreductaze diferite (polifenol oxidaza extrasă din struguri, lacaza din Botrytis cinerea și lacaza din Trametes Versicolor) asupra (plus)-catechinei, iar profilele rezultate LC-UV-MS au fost foarte asemănătoare, deși unele diferențe minore. a sugerat posibile diferențe în reactivitatea acestor enzime.

Structurile a șase produse de oxidare catechină-lacază (folosind lacaza de la Trametes Versicolor) au fost obținute pe baza semnăturilor RMN specifice (patru produse pure, adică N2, N3, N6 și N8 și N4, corespunzător unui amestec de doi izomeri). Atribuirea completă a semnalelor fenolice OH a fost posibilă datorită adăugării azotatului de cadmiu cu o procedură de preparare a probei care a permis atribuirea fără ambiguitate a legăturilor dintre unitățile de catechine pentru unii dintre compușii de interes. Această procedură va simplifica foarte mult analiza RMN a amestecurilor de polifenoli, fie sintetizate, fie extrase din produse naturale.

Standardele obținute în această lucrare pot fi folosite în viitor ca markeri de oxidare pentru a investiga prezența și evoluția lor în timpul maturării strugurilor și învechirii vinului. Pe lângă catechină, alți compuși polifenoli, inclusiv flavonoide și non-flavonoide, pot fi utilizați și ca substraturi ale lacazei pentru a obține noi standarde suplimentare.

Abrevieri

RMN: rezonanță magnetică nucleară,

Cd: cadmiu,

TOCSY: spectroscopie de corelație totală,

ROESY: Spectroscopie cu efect Overhauser nuclear cu cadru rotativ,

HSQC: experiment de corelație cuantică unică heteronucleară,

HMBC: conectivitate multi-bandă heteronucleară,

DOSY: spectroscopie ordonată prin difuzie.

Referințe

1. Khan, N.; Mukhtar, H. Polifenoli de ceai pentru promovarea sănătății. Life Sci. 2007, 81, 519–533. [CrossRef]

2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Caracterizarea New Flavan-3-Ol Derivatives in Fermented Cocoa Beans. Food Chim. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]

3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE Polifenoli din cacao și sănătate vasculară - O revizuire critică. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]

4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Concentrații de polifenoli din extract de tescovină de afine folosind nanofiltrare. Alimente Bioprod. Proces. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]

5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Caracterizarea polifenolilor și evaluarea capacității antioxidante în tescovină de struguri din Cv. Malbec. Food Chim. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]

6. Saucier, C. Cum evoluează polifenolii vinului în timpul învechirii vinului? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]

7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AMS Mecanisme de oxidare care apar în vinuri. Alimentare Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]

8. Singleton, VL Oxigen cu fenoli și reacții înrudite în musturi, vinuri și sisteme model: observații și implicații practice. A.m. J. Enol. Vitic. 1987, 38, 69–77.

9. Mathew, AG; Parpia, HAB Rumenirea alimentelor ca reacție polifenolică. In Advances in Food Research; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, Eds.; Presa academică: Cambridge, MA, SUA, 1971; Volumul 19, p. 75–145. [CrossRef]

10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Evoluția compușilor fenolici și astringența în timpul învechirii vinului roșu: efectul expunerii la oxigen înainte și după îmbuteliere. J. Agric. Food Chim. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]