Care sunt diferența dintre Cistanche cultivat în mod sălbatic și Cistanche cultivat artificial în activitatea de îmbunătățire a imunității

Contact: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Zhao Bing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; Zhang Ailian

Abstract:

Obiectiv:Pentru a compara efectele de îmbunătățire a sistemului imunitar ale cistanchei în creștere sălbatică și ale polizaharidelor cistanche cultivate artificial din cistanche (de atunci: WCDPS și respectiv CCDPS).

Metode:Diferite doze (scăzute, medii și mari) de WCDPS și CCDPS și ovalbumină (OVA) au fost imunizate subcutanat cu șoareci ICR, anticorpi specifici OVA IgG și subtipurile de anticorpi IgGl și IgG2a au fost detectate prin ELISA și prin metoda MTT. Activitate de proliferare a limfocitelor specifice OVA, citometrie în flux pentru a detecta nivelul de expresie al celulelor CD4 plus T și al celulelor CD8 plus T.

Rezultate:Atât WCDPS, cât și CCDPS pot crește semnificativ nivelurile de expresie ale IgG anticorpilor specifici OVA și IgG1 și IgG2a tip anticorpi (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); WCDPS și CCDPS pot crește semnificativ, de asemenea, procentul de subconținut de celule CD4 plus T și CD8 plus T (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), WCDPS și CCDPS nu au avut niciun efect asupra greutății șoarecilor imunizați.

Concluzie:Atât WCDSP, cât și CCDPS pot îmbunătăți în mod semnificativ răspunsurile imune umorale și celulare specifice OVA și nu există nicio diferență semnificativă statistic între cele două și au o siguranță bună.

Cuvinte cheie: cistanche; polizaharide din cistanche; ovalbumină; adjuvant

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),cunoscută și sub numele de Cunyun și Dayun, este o plantă erbacee parazită a Lydanaceae de mulți ani. Este un material medicinal chinezesc rar și prețios. Ingredientele sale principale includ polizaharide din cistanche, compuși glicozidici feniletanoizi Cistanche, acizi organici, alcaloizi etc.⑷, au funcții multiple, cum ar fi hrănirea esenței și a sângelui, asistarea yangului și tonifierea rinichilor și ameliorarea îmbătrânirii⑸. Datorită valorii medicinale extrem de ridicate a cistanchei, supraexploatarea speciilor sălbatice este pe cale de dispariție, iar cistanche-ul cultivat artificial a avut succes. Cercetătorii din țară și din străinătate au făcut o mulțime de cercetări privind componentele chimice și ingredientele active ale cistanchei în creștere sălbatică și ale cistanchei cultivate artificial, dar există puține rapoarte despre compararea polizaharidelor de cistanche sălbatice și cultivate din activitatea adjuvantului de cistanche (WCDPS/CCDPS). . Un număr mare de studii au arătat că polizaharidele vegetale din cistanche ca adjuvant pot regla răspunsul imun al organismului. Mulți cercetători au folosit medicina chineză pe bază de plante ca adjuvant pentru vaccin și au făcut progrese bune”.

Acest studiu se bazează pe cercetările anterioare (6) pentru a comparaimuno-intensificatoareactivitățile Xinjiang WCDPS și CCDPS. În principal prin experimente de imunizare la șoareci, diferite doze de WCDPS și CCDPS au fost imunizate subcutanat cu OVA la șoareci ICR și efectele acestora asupra nivelului umoral.imunitateși imunitatea celulară indusă de OVA după imunizare au fost testate. Comparaţiecresc sălbatic cistancheșicistanche cultivate artificialpolizaharide Activitatea de îmbunătățire a sistemului imunitar a polizaharidelor din citrice poate oferi o referință pentru o mai bună dezvoltare și utilizare a cistanchelor cultivate artificial în Xinjiang.

Materiale și Metodă

Materiale experimentale:

Cultivați cistanche în mod sălbatic și cistanche cultivate (disponibil în comerț). Mediul de cultură RPMI 1640 a fost cumpărat de la GIBCO; Serul fetal bovin a fost achiziționat de la Israel Bioind; Anticorpi de citometrie în flux: PE șobolan-anti-șoarece CD3, APC șobolan-anti-șoarece CD4, FITC șobolan-anti-șoarece CD8a au fost achiziționați de la compania americană BD, produs Sigma Protein albușului de ou (Ovalbumin, OVA), capră anti-șoarece marcat cu peroxid de hrean IgG, IgGl și IgG2a au fost achiziționate de la Southbiotech, SUA. Ceilalți reactivi chimici experimentali sunt toți reactivi analitici domestici.

Animale experimentale:

Șoareci femele ICR de calitate curată (6-8 săptămâni, 18-22 g) au fost achiziționați de la Centrul pentru animale experimentale al Universității Medicale din Xinjiang. Animalele au fost ținute în camera de animale a laboratorului nostru, iar experimentul a început la 7 zile după aclimatizarea animalelor.

Pregătirea WCDPS și CCDPS:

Referința [17] folosește metoda de extracție a apei și precipitarea alcoolului. Pașii scurti sunt următorii: luați pulbere uscată de cistanche cultivată și sălbatică din Xinjiang, adăugați de 10 ori volumul de vaselină și etanol absolut la ultrasunete timp de 1 oră; după filtrarea prin aspirație, se păstrează reziduul de medicament și se usucă, se adaugă de 10 ori volumul de apă distilată 37T Ultrasunete de două ori, se centrifugă la 4 000 r/min timp de 10 min, se combină supernatantele, se evaporă rotativ și se concentrează și se precipită peste noapte cu alcool; după filtrare în vid și uscare, se obține pulberea de extract brut; Metoda Savage ⑻ elimină proteinele din WCDPS și CCDPS. Conținutul de polizaharide din cistanche în WCDPS și CCDPS determinat prin metoda ceapă-acid sulfuric a fost de 76,82 la sută, respectiv 59,58 la sută.

Imunizarea șoarecilor și colectarea serului:

Șoarecii femele ICR în vârstă de {{0}} săptămâni au fost utilizați ca modele animale experimentale. Experimentul a fost împărțit în 9 grupuri, câte 5 în fiecare grup: 0,9 procente NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 net, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 net. Se dizolvă cu 0,9% NaCl înainte de imunizare și se imunizează șoarecii subcutanat de două ori cu un interval de 2 săptămâni. Sângele este colectat înainte de imunizare, iar serul-80Y este pregătit și depozitat pentru utilizare ulterioară.

Efectele WCDPS și CCDPS asupra creșterii șoarecilor:

Pentru a observa efectele WCDPS și CCDPS asupra creșterii șoarecilor, greutățile șoarecilor din fiecare grup au fost cântărite la 0 zile înainte de imunizarea inițială, 14 zile și 21 zile după imunizare.

Detectarea IgG a anticorpului seric de șoarece și tiparea după imunizarea cu WCDPS și CCDPS:

Metoda ELISA indirectă a fost utilizată pentru determinarea anticorpilor serici. Acoperit placa ELISA cu 2,5 jig/ml OVA, 4Y peste noapte; spălat cu PBST de 3 ori și apoi adăugat 5% lapte praf degresat 37L pentru blocare timp de 1 oră; spălat de 3 ori cu PBST, şi adăugat anticorpul primar la şoareci după imunizare în fiecare grup de ser, raportul de diluare a anticorpului primar este 1: 100, 100 comprimate per godeu, 37Tl h; după spălare de 3 ori cu PBST, se adaugă anticorpi secundari: capră anti-șoarece IgG, IgGl, IgG2a (l: 5 000) marcate cu HRP 37 Se incubează balaurul timp de 1 oră; după spălare de 4 ori cu PBST, adăugați soluție de substrat de tetrametilbenzidină (TMB) pentru a evita lumina timp de 15 min. Se adaugă 50 în fiecare godeu pentru a opri reacția cu 2 mol/L H2SO4 și se măsoară valoarea A45O/655. Comparați nivelurile de anticorpi din fiecare grup.

Detectarea proliferării limfocitelor splenice de șoarece după imunizarea cu WCDPS și CCDPS:

Metoda MTT a fost utilizată pentru a detecta proliferarea limfocitelor în splina șoarecilor imunizați cu CCDPS și WCDPS. Splina șoarecilor a fost izolată în condiții aseptice la 21 de zile după imunizarea inițială, iar celulele splinei au fost diluate cu 10 procente mediu RPMI 1640 care conține FBS pentru a face celule individuale Suspensie, numărare și ajustare a celulelor (r celule/ml se răspândesc într-o placă de cultură celulară 96-godeuri, se adaugă 20 OVA (concentrație finală 10 |xg/ml) și respectiv ConA (concentrație finală 5 porc/ml), respectiv Stimulați, setați un control de celule goale și un ser gol control în același timp, se pune într-un incubator cu celule 37Y timp de 48 de ore, se adaugă 20 MTT în fiecare godeu, 37^ și se continuă incubarea timp de 4 ore, se adaugă 100|±1 DMSO în fiecare godeu pentru a se dizolva și a testa inima 0 / 63. Valoare, se calculează indicele de stimulare (SI) al fiecărui grup de șoareci.

Expresia CD4 și CD8 pe celulele CD3 plus T după imunizarea cu WCDPS și CCDPS:

Citometria în flux a fost utilizată pentru a detecta expresia celulelor CD4 plus T și CD8*T pe suprafața celulelor CD3 plus T. Splina de șoarece a fost izolată în condiții aseptice la 21 de zile după imunizarea primară, iar splina a fost tratată cu mediu RPMI 1640 care conține 10% FBS. Pregătiți o singură suspensie de celule, numărați și ajustați numărul de celule la 1x106 celule/probă, efectuați colorarea CD4 și CD8 pe suprafața celulelor CD3 plus T, protejați de lumină la temperatura camerei timp de 25 de minute și utilizați 10 ml de un soluție tamponată cu fosfat care conține 0,5% FBS (soluție tamponată cu fosfat). ser fiziologic, PBS) 1 200 r/min 7 min. se spală o dată, se adaugă 250 |jil PBS, se trece ochiuri de cupru de 200 mesh, citometrie în flux pentru a detecta expresia CD4 și CD8 pe suprafața celulelor CD3*T.

Metode statistice:

Software-ul Flowjo 7.6 procesează rezultatele testelor de citometrie în flux; GraphPad Prism 5.0 este utilizat pentru analiza datelor, iar toate datele se bazează pe medie ± abaterea standard. Utilizați Student și testați pentru a compara datele dintre grupurile experimentale. P<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Rezultat

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. Efectul WCDPS și CCDPS asupra IgG anticorpului specific OVA: WCDPS și CCDPS au fost imunizate subcutanat cu OVA pentru a detecta expresia IgG anticorp specific OVA în ser după 14 zile și 21 de zile de imunizare. Rezultatele sunt prezentate în Figura 1, WCDPS și CCDPS au promovat expresia anticorpului IgG în ser într-o manieră dependentă de doză; OVA plus WCDPS 50 p,g în comparație cu OVA plus CCDPS 50 |xg poate promova semnificativ anticorpii specifici OVA în comparație cu OVA plus CCDPS 50 |xg. Expresia IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. Efectul WCDPS și CCDPS asupra tipării anticorpilor specifici OVA: la 21 de zile după imunizare, a fost detectată expresia anticorpului specific OVA care tipează IgG1 și IgG2a în ser. Rezultatele sunt prezentate în Figura 2. OVA-WCDPS 50 jig și OVA-WCDPS 100 |xg Mumu au promovat semnificativ expresia anticorpului IgG2a în ser decât grupul OVA singur (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. Efectul WCDPS și CCDPS asupra proliferării limfocitelor specifice OVA de șoarece: pentru a detecta efectul WCDPS și CCDPS asupra limfocitelor splenice, polizaharidele din cistanche au fost imunizate subcutanat cu OVA, iar celulele splinei au fost separate la 21 de zile după imunizare , iar metoda MTT a fost folosită pentru a le detecta. Promovarea proliferării limfocitelor specifice OVA. Rezultatele sunt prezentate în Figura 3. WCDPS și CCDPS au sporit proliferarea limfocitelor specifice OVA într-o manieră dependentă de doză. Combinația de WCDPS și CCDPS cu grupul OVA poate promova semnificativ proliferarea limfocitelor specifice OVA în comparație cu grupul OVA singur. Proliferarea limfocitelor (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. Efectul WCDPS și CCDPS asupra celulelor CD3 plus CD4 plus T și CD3 plus CD8 plus T: la 21 de zile după ce WCDPS și CCDPS au fost imunizate subcutanat cu OVA, expresia CD4 și CD8 în celulele CD3 plus T a fost detectată prin citometrie în flux , așa cum se arată în Figura 4A. Se arată că OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 jig și OVA-WCDPS 100 pot promova în mod semnificativ proliferarea celulelor CD3 plus CD4 plus T (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

Discuţie

Numeroase studii au arătat că medicina pe bază de plante chineză are funcție imunomodulatorie „Da] și, de asemenea, există un număr mare de rapoarte care demonstrează că polizaharidele din plante medicinale chinezești din cistanche pot fi utilizate ca adjuvant pentru a spori efectul imunitar al vaccinurilor”3], și carnea deșertului Xinjiang din Congrong selectată în acest studiu este un material medicinal unic în Xinjiang, iar speciile sălbatice sunt pe cale de dispariție, combinate cu valoarea lor medicinală mai mare, cultivarea speciilor cultivate este deosebit de importantă pentru dezvoltarea și utilizarea resurselor de plante medicinale. . Noile vaccinuri de pe piața actuală au o specificitate bună pentru antigen, dar o imunogenitate slabă. Polizaharidele vegetale din cistanche pot compensa această deficiență. țara mea are un mare avantaj în cercetarea plantelor medicinale chinezești. Analizăm adjuvanții de vaccin din plante medicinale chinezești naturale. Fezabilitate ridicată. Studiile au arătat că polizaharidele din plante chinezești din cistanche au grade diferite de reglare asupra imunității specifice și imunității nespecifice, cum ar fi polizaharidele Ganoderma din cistanche, polizaharidele Radixisatidis din cistanche, polizaharidele Poria cocos din cistanche koji, polizaharidele inulinice din cistanche etc. Poate spori efectul imunitar al vaccinului.

Datorită creșterii rapide a cererii de cistanche, speciile sale sălbatice au dispărut minate și sunt acum listate ca plante pe cale de dispariție și protejate în țara mea. Pe baza succesului plantării artificiale a deșertului Caulis Carlsbad, se așteaptă ca speciile cultivate să înlocuiască speciile sălbatice. În acest experiment, cistanche cultivate în mod sălbatic și polizaharide de cistanche cultivate artificiale cultivate au fost utilizate ca adjuvanți OVA pentru a efectua experimente de imunizare in vivo la șoarece. Prin testarea diferiților indicatori, a fost evaluat inițial efectul imunitar al cistanchei sălbatice și cultivate, ceea ce a oferit o referință pentru utilizarea eficientă a cistanchei cultivate în Xinjiang.

Pentru a înțelege siguranța crește sălbatic cistanche și cultivate cultivate artificialzaharide cistanchedin cistanche, experimentele de imunizare in vivo a animalelor au observat caracteristicile de aspect ale șoarecilor și au constatat că șoarecii nu au diaree, păr erect sau lacrimi după imunizare, iar activitățile și respirația lor sunt normale și nu există contracții musculare. Nu a existat nicio diferență semnificativă în greutatea corporală a șoarecilor din fiecare grup din cauza fenomenului de tulburare, ceea ce indică faptul că imunizarea cu WCDPS și CCDPS nu a afectat creșterea șoarecilor și au un anumit grad de siguranță. IgG anticorpilor și rezultatele testelor de tipizare arată: WCDPS și CCDPS pot crește semnificativ expresia IgG anticorpului specific OVA după co-imunizarea cu OVA, iar efectul este echivalent cu adjuvantul de aluminiu; poate îmbunătăți în mod semnificativ expresia anticorpului specific OVA tip IgG2a și IgGl, arată că polizaharidele din cistanche îmbunătățesc răspunsul imun Th1 și Th2 în același timp și nu există nicio diferență semnificativă între WCDPS și CCDPS. Rezultatele tipării anticorpilor IgG2a au descoperit că grupul de co-imunizare WCDPS și CCDPS și OVA poate îmbunătăți în mod semnificativ expresia IgG2a în comparație cu grupul de adjuvant de aluminiu, un adjuvant de aluminiu este mai slab în promovarea expresiei celulelor T, ceea ce demonstrează că sunt utilizate WCDPS și CCDPS. ca adjuvanţi Capacitatea de a promova imunitatea celulară este semnificativ mai mare decât cea a adjuvanţilor de aluminiu.

Rezultatele detectării proliferării limfocitelor prin metoda MTT au arătat că celulele splinei ale șoarecilor din fiecare grup au fost stimulate de OVA. Indicele de stimulare (SI) al proliferării limfocitelor în WCDPS și CCDPS combinat cu OVA a fost semnificativ mai mare decât cel din grupul de imunizare numai OVA. OVA- Indicele de stimulare al grupului de jig WCDPS 50 Ah și OVA-CCDPS 50 a fost semnificativ mai mare decât cel al grupului de adjuvant din aluminiu; indică faptul că WCDPS și CCDPS combinate cu grupul OVA pot crește semnificativ proliferarea limfocitelor specifice OVA în comparație cu grupul OVA și grupul adjuvant de aluminiu.

Există diferite subgrupe de limfocite T. CD3 este molecula de suprafață a tuturor limfocitelor T. În funcție de diferite fenotipuri, acestea pot fi împărțite în celule T CD8 plus și celule T CD4. Moleculele CD4 plus pot fi formate sub acțiunea moleculelor MHC fl, care sunt utilizate în principal ca celule helper (Th) după activare. Moleculele CD8 plus trebuie formate sub acțiunea moleculelor MHC I. După activare, ele devin celule ucigașe (TC sau CTL), care joacă un rol important în imunitatea împotriva infecțiilor virale și a imunității tumorale. 3". Citometria în flux detectează expresia celulelor CD3PD4 plus T și CD3 plus CD8 plus T, rezultatele arată că WCDPS și CCDPS pot promova în mod semnificativ proliferarea celulelor CD4 plus T și CD8 plus T într-un anumit interval de doză și nu există o doză semnificativă. diferență între WCDPS și CCDPS la aceeași doză.Combinația de CCDPS și OVA poate stimula expresia celulelor CD3 plus CD4 plus T și CD3 plus CD8 plus T, iar cele două efecte sunt echivalente.

În rezumat, WCDPS și CCDPS sunt sigure ca adjuvanți. După ce au fost imunizați cu OVA, pot crește simultan imunitatea umorală specifică și imunitatea celulară. În comparație cu adjuvanții de aluminiu, WCDPS și CCDPS au efecte mai bune asupra îmbunătățirii imunității celulare și nu există nicio diferență în efectele de îmbunătățire ale celor două polizaharide din cistanche. Aceste rezultate ale cercetării oferă referințe materiale pentru polizaharidele cistanche cultivate artificial din Xinjiang din cistanche ca adjuvanți și oferă, de asemenea, baza materială pentru screeningul adjuvanților imunitari siguri și eficienți din deșertul Xinjiang.cistanche.

Referințe

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, și colab. Răspunsul imun adjuvant al polizaharidelor din Atractylodis macrocephalus Koidz la puii vaccinați împotriva bolii Newcastle (ND) [J]. Carbohydr Polym, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. carb pop. 2016. 01.033.

[2]Li J, Wang X, Wang W, și colab. Extractul de apă cu ferulat de Pleurotus îmbunătățește maturarea și funcția celulelor dendritice derivate din măduva osoasă murine prin calea de semnalizare TLR4 [J]. Vaccin, 2015, 33(16) : 1923-1933. DOI: 10.1016/j. vaccin.2015.02. 063.

[3]Zhao H, Luo Y, Lu C și colab. Răspunsul imun enteric al mucoasei ar putea declanșa activitatea de imunomodulare a polizaharidei Ganoderma la șoareci [J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.