O nouă peptidă derivată de Netrin-1-îmbunătățește protecția împotriva morții neuronale și atenuează hemoragia intracerebrală la șoareci Partea 2

În plus, am descoperit că peptida E1 a activat în mod specific căile de semnalizare FAK și SFK. Prin urmare, peptida E1 poate avea efecte foarte specifice și poate fi eficientă în procesul de recuperare după ICH.

Există o relație între specificitatea ridicată și memorie. Specificitatea ridicată se referă la activitatea mai puternică în anumite zone ale creierului atunci când oamenii îndeplinesc o sarcină. Memoria se referă la capacitatea oamenilor de a învăța și a-și aminti informații. Când învățăm să folosim specificitatea ridicată pentru a îndeplini o sarcină, memoria noastră va crește și ea.

Cercetările arată că atunci când avem abilități și experiență specializate într-o sarcină, creierul va construi treptat circuite neuronale specializate și modele de memorie. Aceste circuite și modele vor avea un efect specific asupra răspunsului la sarcină, îmbunătățind astfel eficiența sarcinii. În același timp, atunci când îndeplinim sarcini similare în viitor, aceste circuite și tipare vor fi, de asemenea, activate pentru a ne ajuta să ne amintim și să îndeplinim mai bine sarcina.

Sarcinile cu specificitate ridicată includ muzica, limbajul, sportul etc., iar învățarea acestor abilități ne poate îmbunătăți memoria. De exemplu, atunci când un pianist exersează cântatul, creierul va învăța abilitățile specifice pianului și va continua să consolideze aceste circuite în timpul procesului de practică. Înființarea și consolidarea acestor circuite va îmbunătăți, de asemenea, înțelegerea și memoria pianistului asupra muzicii.

Prin urmare, există o relație pozitivă între specificitatea ridicată și memorie. Învățarea abilităților și experiențelor specifice poate nu numai să ne îmbunătățească eficiența execuției, ci și să ne întărească memoria, ajutându-ne să învățăm și să ne amintim mai bine diverse informații. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece are efecte antioxidante, antiinflamatorii și anti-îmbătrânire, care pot ajuta la reducerea oxidarii și a reacțiilor inflamatorii din creier, protejând astfel sănătatea sistemul nervos. În plus, Cistanche poate promova, de asemenea, creșterea și repararea celulelor nervoase, sporind astfel conectivitatea și funcția rețelelor neuronale. Aceste efecte pot ajuta la îmbunătățirea memoriei, a capacității de învățare și a vitezei de gândire și pot preveni, de asemenea, apariția disfuncțiilor cognitive și a bolilor neurodegenerative.

Faceți clic pe cunoașteți suplimentele pentru a crește memoria

Spre deosebire de peptida E1, peptida E2 poate activa semnalizarea ERK, care promovează moartea neuronală. Acest lucru poate fi cauzat de un motiv Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G E2 care poate activa calea de semnalizare ERK [28].

Acest lucru indică faptul că diferite peptide derivate de Netrin-1-îndeplinesc funcții diferite. Principalii receptori ai Netrin-1 sunt DCC și membri ai familiei UNC5 [50]. Rolul DCC și UNC5H2 în ICH rămâne controversat [51,52].

Secvența de Netrin-1pe care am identificat-o este critică pentru interacțiunea Netrin-1 cu DCC [19]. Aceste rezultate sugerează că DCC poate participa la recuperarea funcțională indusă de Netrin-1-după ICH.

Sunt necesare studii suplimentare pentru a investiga mecanismele care stau la baza acestor procese și căile de semnalizare aferente. În experimentele viitoare, vom evalua proprietățile biologice ale peptidei E1 pentru a explora toxicitatea și timpul de înjumătățire pentru aplicare clinică.

4. Materiale și Metode

4.1. Animale

Laboratorul a fost un laborator specific fără agenți patogeni (SPF). Toți șoarecii au fost adăpostiți într-un ciclu lumină-întuneric de 12-h cu luminile aprinse între 6:00 și 18:00 și au oferit acces la hrană ad libitum. Șoarecii DCC+/− au fost generați așa cum s-a descris anterior [53].

Embriozoși de șoareci DCC+/- au fost utilizați pentru cultura neuronală corticală. Genotiparea a fost efectuată prin reacția în lanț a polimerazei (PCR), așa cum a fost descris anterior [53]. Șoarecii C57BL/6J au fost achiziționați de la Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd. (Beijing, China).

4.2. Construcții

Construcțiile de expresie care codifică DCC uman (HGNC: 2701), Netrin-1 umană (HGNC:8029) și UNC5A umană (HGNC:12567) au fost generate în laboratorul nostru [14,32,45].

pcDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-His a fost generat cu un kit Seamless AssemblyCloning (Clone Smarter, C5891, SUA). Secvența de ADNc a hNetrin-1 (∆407–443) a fost observată în tabelul suplimentar S2.

Secvențele de ADNc corespunzătoare domeniului FN5 al DCC și aminoacizii 407-443 ai Netrin-1 au fost construite prin ligatură în vectorul pGEX{-5x{-1 pentru a produce proteine ​​de fuziune GST.

4.3. Colecție de medii condiționate Netrin-1

Mediul condiționat-1-netrină a fost colectat și validat așa cum este descris în raportul nostru anterior [13,14]. Pe scurt, netrina umană marcată cu Myc-His-1 a fost exprimată în celulele HEK293T.

După 24 de ore, celulele au fost spălate de 3 ori cu Opti-MEM (Invitrogen, 31985070, Carlsbad, CA, SUA) și apoi incubate timp de trei zile în Opti-MEM fără ser.

Mediul a fost îmbogățit prin filtrare centrifugă (Millipore, UFC903096, Billerica, MA, SUA) și depozitat la -80 ◦C. Netrin îmbogățit-1 a fost imunoblotat cu anti-His și cuantificat prin comparație cu BSA ca control de încărcare.

Efectul Netrinei{{0}} a fost apoi evaluat prin fosforilarea FAK. În mod normal, 0,1 mg/mL de Netrin-1 a indus eficient fosforilarea FAK, iar această concentrație a fost utilizată în studiile noastre. Durata stimulării cu Netrin-1a fost de 20 de minute în toate experimentele, dacă nu se indică altfel.

4.4. Analiza Western Blot

Western blot a fost efectuat așa cum a fost descris anterior [54]. Probele au fost analizate în tampon de liză (1% Nonidet P-40, 0,5% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCI, 10% glicerol, 1% Triton X-100, 100 mM NaF, 1 mM vanadat și inhibitori de protează) pentru a liza celulele și țesutul cerebral proaspăt.

Anticorpii primari utilizați au fost: șoarece anti-DCC (1:500, #554223, BD, San Jose, CA, SUA), șoarece anti-His (1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, Beijing, China ), mouse anti-myc (1:1000, 22E8, Sungene Biotech, Tianjin, China), mouse anti-Netrin-1 (1:1000, ALX804838, Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York, SUA ), mouse anti-steag (1:1000, F3165, Sigma Aldrich, St Louis, MO, SUA), iepure anti-fosfo-FAK (pTyr861) (1:1000, F9176, Sigma Aldrich, St Louis, MO, SUA), iepure anti-FAK (1:200, sc-557, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, SUA), iepure anti-fosfoSRC (Tyr418) (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) , iepure anti-SRC Family (1:1000, #2123, CST, Danvers, MA, SUA), șoarece anti-GAPDH (1:5000, TransGene Biotech, Beijing, China), șoarece anti-beta actină (1:3000, A5441, Sigma Aldrich, St Louis, MO, SUA), iepure anti-fosfo-ERK (Thr202/Tyr204) (1:1000, #9101, CST, Danvers, MA, SUA), iepure anti-ERK (1:1000, # 4695, CST, Danvers, MA, SUA), anticorpi secundari conjugați cu HRP împotriva șoarecelui, caprei sau iepurilor au fost achiziționați de la Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, SUA).

4.5. Legarea suprafeței celulare

Celulele HEK293 placate pe lame de acoperire au fost transfectate cu plasmide Flag-DCC folosind metoda fosfatului de calciu așa cum a fost descris anterior [55]. La aproximativ 40 ore după transfecție, celulele au fost incubate cu 100 µg/mL myc-Netrin-1 sau myc-Netrin-1 (∆407–443) timp de 30 min înainte de a fi spălat timp de 5 minute cu HBHA (20 mM HEPES, pH 7,0 și 0,5 mg/mLBSA în HBSS), clătit cu 1 x PBS și fixat secvenţial cu 4% paraformaldehidă în PBS timp de 10 minute. Anticorpii primari care au fost utilizați au fost anticorpi de iepure anti-myc (1:200, Abcam, ab9106, Cambridge, MA, SUA) și anticorpi anti-flag de șoarece (1:100, Sigma Aldrich, F3165).

Anticorpii secundari care au fost utilizați au fost anticorpi Alexa Fluor 488-conjugați de măgar anti-iepure (1:1000; Invitrogen, A21206) și Alexa Fluor 546-anticorpi conjugați de capră anti-șoarece (1:1000; Invitrogen, A10036). . Nucleii au fost colorați cu 40,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (Thermo Fisher, Waltham, MA, SUA). Toate imaginile au fost obținute cu un microscop confocal Zeiss LSM 880.

4.6. GST Pull-down

Proteina de fuziune GST-DCC a fost purificată cu perle glutation-SepharoseTM 4B (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Marea Britanie) prin protocolul producătorului.

Aproximativ 500 ug de lizat de celule din celule HEK293T transfectate cu plasmidele indicate au fost incubate cu 2-5 ug de proteină de fuziune GST-DCC-FN5 în tampon RIPA la 4 °C peste noapte. Glutathi-one-SepharoseTM 4B au fost folosite pentru a captura proteina de fuziune GST-DCC-FN5 și proteinele sale care interacționează. Proteinele legate au fost eliberate în tamponul de încărcare cu proteine ​​prin denaturare la căldură.

4.7. Cultura neuronului cortical primar

Neuronii corticali primari au fost cultivați așa cum s-a descris anterior [56]. Pe scurt, embrionii (E17) au fost îndepărtați de la șoareci gestante anesteziați. Cortexele cerebrale au fost separate și tăiate în bucăți mici.

După incubare în {{0}}, 125% Trypsin Plus cu 0,05% ADNază în HBSS la 37 ◦ C timp de 20 de minute, celulele au fost triturate cu pipete Pasteur din sticlă lustruită și filtrate cu un filtru de 40 µm.

Celulele disociate au fost suspendate în DMEM cu 10% FBS și placate pe vase acoperite cu poli-D-lizină sau lamele de sticlă la 37 ◦ C într-o atmosferă de 5% CO2. După 4 ore, mediul a fost înlocuit cu un mediu neurobazal suplimentat cu B27 și GlutaMAX.

4.8. Cultură celulară NLT și protocoale de tratament

Celulele neuronale care exprimă GnRH de șoarece (NLT) au fost întreținute de laboratorul nostru. Celulele NLT au fost crescute în DMEM (Sigma Aldrich, St Louis, MO, SUA) care conține 10% FBS (BiologicalIndustries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) și 1% penicilină/streptomicina (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, SUA) la 37 ◦ C sub o atmosferă umidificată de 95% aer și 5% CO2.

Pentru a determina neurotoxicitatea heminei, diferite concentrații (0, 10, 30, 60, 90 și 120 pM) de hemină (Sigma-Aldrich) au fost adăugate la celulele NLT și tratate timp de 6 ore. Dintre aceste concentrații, 60 pM (LD50) a fost selectat și utilizat în experimentele ulterioare.

Grupurile de control au fost tratate numai cu vehicul (DMSO). Viabilitatea celulară și colorarea Live/Deadstaining au fost efectuate la 6 ore după tratament. Au fost utilizate trei godeuri pentru fiecare grup. Experimentele au fost repetate de cel puțin 3 ori.

4.9. Model in vitro al morții celulare induse de hemin

Moartea celulară a fost indusă în neuronii corticali primari și celulele NLT prin tratament cu 50µM și, respectiv, 60 µM hemină, așa cum s-a descris anterior [57,58]. Hemina a fost dizolvată în NaOH 0,1 M pentru a genera o soluție stoc. Pentru studiile de neuroprotecție, celulele au fost tratate cu hemină 6h în prezența agenților desemnați sau selenitul de sodiu dizolvat în apă dublu distilată.

4.10. Test CCK-8

Viabilitatea celulară a fost măsurată prin testul CCK-8 (CK04, Dojindo, Kumamoto, Japonia) așa cum a fost descris anterior [59]. Pe scurt, Neuronal au fost însămânțați în plăci de 96-godeuri la o densitate de 6000 celule/godeu în 100 µL mediu de cultură și alimentat în incubator peste noapte.

Celulele au fost tratate cu Hemin timp de 6 ore. Celulele neuronale au fost spălate în reactiv PBS preîncălzit (37 ◦C) și CCK-8 (10 µL per 100 µL mediu) în fiecare godeu.

După aceea, am incubat plăcile timp de 2 ore într-o atmosferă de 5% CO2, iar absorbanța la 450 nm a fost măsurată folosind un cititor de microplacă. Viabilitatea celulară a fost reprezentată ca procent din martor (celule netratate).

4.11. Vii/Mort Colorare

Capacitatea testului CCK-8 de a măsura viabilitatea a fost verificată prin colorarea cu calceinAM/PI în PBS (Live/Dead Assay, KeyGEN BioTECH, Nanjing, China) conform instrucțiunilor producătorului.

Soluția de colorare a constat din 2 uM reactiv AM calceină și 8 uM reactiv PI amestecat în PBS. Probele au fost incubate timp de 30 de minute și au fost fotografiate folosind o lentilă cu 20 de obiective a unui microscop cu fluorescență (Olympus FSX100, Tokyo, Japonia). Au fost utilizate minimum 3 culturi de celule independente pentru modelul in vitro al morții celulare induse de hemină.

4.12. Sinteza și administrarea peptidelor

Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep E2 (NH{2- CPCKDGVTGIT-CONH2), Tat (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2),TE1 (NH{2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC etichetat TE1 (NH{2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC etichetat (Pep{{F3) 27}}HPVGAAGKTCNQTTGQCPCKDGVTGITCNRCAKGYQQ-CONH2), semnalizator etichetat Pep Ctrl(NH2-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-TPCRCGKTYDVGI-CONH2), marcaj etichetat Pep E1 (NH2-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-TPCRCGKTYDVGI-CONH2), marcaj etichetat Pep E1 (NH2-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS) TTGQ-CONH2) și etichetat Flag Peptidele Pep E2 (NH2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) cu 99% puritate au fost achiziționate de compania Shanghai GL Biochem (Shanghai, China) și compania Wuhan Bioyeargene Biosciences (Wuhan, China).

For more information:1950477648nn@gmail.com