O nouă peptidă derivată de netrină-1-îmbunătățește protecția împotriva morții neuronale și atenuează hemoragia intracerebrală la șoareci Partea 1

Abstract:

S-a raportat că Netrin-1 este implicat în neuroprotecție după leziuni ale sistemului nervos central. Cu toate acestea, domeniul funcțional minim al Netrin-1 care poate păstra neuroprotecția, dar poate evita efectele secundare majore ale Netrinului rămâne evaziv.

Sistemul nervos central este unul dintre cele mai importante sisteme nervoase din corpul uman, care controlează gândirea, sentimentele și acțiunile oamenilor. Când sistemul nervos central este deteriorat, memoria oamenilor va fi, de asemenea, afectată. Dar nu vă faceți griji, putem lua câteva modalități pozitive pentru a ajuta la restabilirea memoriei.

În primul rând, trebuie să înțelegeți impactul deteriorării memoriei. Deteriorarea sistemului nervos central poate afecta abilitățile cognitive ale oamenilor, procesele de gândire și atenția, toate acestea afectând în mod direct memoria oamenilor. În plus, deteriorarea sistemului nervos central poate provoca, de asemenea, instabilitate emoțională, făcând oamenii mai predispuși la panică, anxietate și depresie, afectând astfel recuperarea memoriei.

Cu toate acestea, deși afectarea sistemului nervos central poate aduce unele efecte negative, putem lua unele măsuri pozitive pentru a promova recuperarea memoriei. În primul rând, putem încerca unele antrenamente cognitive, cum ar fi cititul, scrisul și rezolvarea puzzle-urilor. Aceste activități pot stimula creierul să producă noi neuroni și pot ajuta creierul să-și construiască noi amintiri și moduri de gândire.

În al doilea rând, putem promova și recuperarea memoriei prin exerciții fizice. Studiile au arătat că exercițiile fizice adecvate pot stimula creierul să producă noi neuroni și conexiuni neuronale și să promoveze procesarea de către creier a informațiilor noi. Acesta este motivul pentru care unii oameni vin brusc cu o idee bună sau rezolvă o problemă dificilă în timp ce aleargă sau merg pe jos.

În sfârșit, trebuie să acordăm atenție rolului aportului alimentar corect asupra memoriei. Funcționarea normală a creierului necesită unele substanțe nutritive necesare, cum ar fi proteine, vitamine și oligoelemente. Dacă alimentele noastre lipsesc acești nutrienți, ne va afecta memoria și capacitatea de gândire. Prin urmare, ar trebui să alegem unele alimente bogate în acești nutrienți în dieta noastră, cum ar fi peștele, carnea slabă, legumele și fructele.

Pe scurt, afectarea sistemului nervos central va avea un anumit impact asupra memoriei oamenilor, dar putem promova recuperarea memoriei printr-un antrenament cognitiv adecvat, exerciții fizice și controlul dietei. Sper că toată lumea poate face față provocărilor vieții în mod pozitiv, să mențină o atitudine optimistă și să se străduiască să restabilească un sistem nervos central sănătos și o memorie bună. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece Cistanche este un medicament tradițional chinezesc cu multe efecte unice, dintre care unul este îmbunătățirea memoriei. Eficacitatea Cistanche vine din diferitele ingrediente active pe care le conține, inclusiv acid tanic, polizaharide, glicozide flavonoide etc., care pot promova sănătatea creierului în multe feluri.

Faceți clic pe Cunoaștere pentru a îmbunătăți memoria pe termen scurt

Aici, am investigat efectul neuroprotector al unei peptide E1 derivată din domeniul EGF3 al Netrin-10 (reziduurile 407-422). Am descoperit că interacționează cu carcinomul colorectal cu deleție (DCC) pentru a activa fosforilarea focală a kinazei de adeziune care prezintă neuroprotecție.

Administrarea peptidei E1 a fost capabilă să îmbunătățească recuperarea funcțională prin apoptoză redusă într-un model murin experimental de hemoragie intracerebrală (ICH).

În rezumat, dezvăluim o secvență funcțională de Netrin-1 care este implicată în procesul de recuperare după ICH și identificăm o peptidă candidată pentru tratamentul ICH.

Cuvinte cheie: hemoragie intracerebrală; hemin; neuroprotecție; Netrin-1; peptidă.

1. Introducere

Hemoragia intracerebrală (ICH) este un subtip devastator de accident vascular cerebral cu o rată ridicată de mortalitate și morbiditate [1–3] care implică ruptura anormală a vaselor de sânge cerebrale din creier [4,5].

Îndepărtarea chirurgicală a hematoamelor este preferată pentru realizarea hemostazei și ameliorarea presiunii intracraniene [6]. Cu toate acestea, reziduurile hematice rămase și produsele de descompunere a sângelui pot încă promova leziuni cerebrale secundare după ICH, inducând leziuni neuronale și întârziind recuperarea funcțională [7-9].

Astfel, dezvoltarea unor strategii eficiente care vizează leziunile neuronale induse de leziuni cerebrale secundare ar fi benefică pentru tratamentul accidentului vascular cerebral. Netrina-1 este una dintre cele mai bine studiate proteine ​​care reglează ghidarea axonală și sinaptogeneza [10–12] prin interacțiunea cu receptorii săi. eliminate în cancerul colorectal (DCC) și UNC5H (omolog necoordonat-5) pentru a activa supraviețuirea, diferențierea și proliferarea celulelor [13-15].

Receptorii induc un semnal de moarte pentru a media apoptoza atunci când Netrin-1 este absent [16]. Se știe că legarea netrinei-1 cu DCC are ca rezultat dimerizarea DCC și inițiază fosforilarea tirozinei 861 a adeziunii kinazei focale (FAK) pentru a induce creșterea neuritei și ghidarea axonală [17,18].

Legarea Netrin-1 cu DCC implică domeniul EGF3 al Netrin-1 și domeniul FN5 al DCC în activarea căii de semnalizare Netrin-1 [19,20]. Recent, sa demonstrat că Netrin-1 exercită efecte neuroprotectoare în regiunile ischemice [21].

Nivelul de expresie al serului de Netrin-1, care inhibă apoptoza celulară și promovează regenerarea neuronală, este corelat pozitiv cu recuperarea pacientului după accidentul vascular cerebral ischemic [22,23].

Interesant este că transplantul de celule stem mezenchimale din măduva osoasă care secretă Netrin-1 în nervul sciatic de șobolan deteriorat inițiază regenerarea axonală [24] și reduce moartea neuronului motor [25]. Injectarea stereotaxică a proteinei Netrin-1 în ventriculi reduce moartea celulelor nervoase după hemoragia subarahnoidiană prin activarea semnalizării DCC/APPL1/AKT [26].

O polipeptidă derivată din domeniul EGF3 al Netrin-1 (aminoacizi 423–433) activează în mod semnificativ fosforilarea ERK și promovează producerea de NO, care are efecte cardioprotectoare [27,28]. Cu toate acestea, Netrin-1 a fost identificat ca un potențial biomarker pentru tumorigeneză [29–31], deoarece reglarea stării Netrin-1 găsită în mai multe tipuri de cancer derivate din țesuturi [32].

Când Netrin-1 este legat de receptorul său DCC sau Unc5H, receptorii transduc un semnal pozitiv care duce la supraviețuire, inflamație, angiogeneză și anti-apoptoză, care, la rândul său, reglează tumorigeneza [31].

Prin urmare, este foarte important să se identifice domeniul funcțional minim al Netrinei-1 care poate menține neuroprotecția și poate evita efectele secundare majore ale Netrinei-1. Aici, am descoperit că peptida E1 (reziduurile 407-422), care este derivat din domeniul EGF3 al Netrin-1, interacționează cu DCC pentru a proteja neuronii de toxicitatea indusă de hemină.

Într-un model experimental de șoareci ICH, aplicarea peptidei E1 a îmbunătățit recuperarea funcțională, determinată prin teste comportamentale. În plus, peptida E1 poate preveni degenerarea neuronilor după ICH.

Pe baza acestor rezultate, am identificat o secvență funcțională a Netrinei-1 care este implicată în recuperarea după ICH și am stabilit că această peptidă poate fi utilizată pentru tratamentul ICH.

2. Rezultate

2.1. Domeniul EGF3 este critic pentru interacțiunea Netrin-DCC

Netrin-1 constă dintr-un domeniu VI, trei repetări EGF și un domeniu C-terminal [33]. Structura cristalină a complexului Netrin-1/DCC uman dezvăluie că domeniul Netrin-1 EGF3 este crucial pentru interacțiunea Netrin{-1/DCC, dar nu și domeniile EGF1 și EGF2 [34].

Mutageneza resturilor cheie de aminoacizi (His407, Gln442 sau Gln443) la domeniul EGF3 a perturbat complet legarea Netrin-1/DCC [19]. Domeniile EGF1/2 sunt necesare pentru a comuta semnalizarea atractivă în semnalizare respingătoare atunci când Unc5 coexistă cu DCC [20].

Astfel, am generat mai întâi construcții cu lungime completă și EGF3-șters (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 (Figura 1A) și am exprimat tranzitoriu aceste constructe în celule HEK293T cultivate pentru GSTpulldown .

Legarea a fost observată pentru constructele care au exprimat Netrin-1 dar nu și Netrin-1(∆407–443) (Figura 1C). Aceste rezultate sugerează că domeniul EGF3 care conține aminoacizii 407–443 este responsabil pentru interacțiunea Netrin-1 cu DCC. Pentru a investiga rolul domeniului EGF3 în Netrin-DCC, am purificat mai întâi Netrin{{12} marcat cu myc. }} sau Netrin trunchiat-1 (∆407–443) (Figura 1B).

Apoi, celulele HEK293T au fost transfectate cu o plasmidă care poartă ADNc DCC și incubate cu proteina Netrin-1, iar apoi legarea Netrin-1 a fost evaluată prin imunocolorare.

Am descoperit că Netrin-1 de lungime completă, dar nu Netrin trunchiat-1, a putut să se lege de DCC la membrana plasmatică (Figura 1D). Pentru a determina dacă domeniul EGF3 poate interacționa cu DCC, am generat o construcție GST-EGF3 pentru a trage în jos celulele lizate care supraexprimă DCC. Am observat legarea specifică a DCC cu GST-EGF3 (Figura 1E).

Mai mult, am sintetizat peptida EGF3 marcată cu FITC și am confirmat că, la fel ca Netrin -1 de lungime completă, a fost capabil să se lege la DCC la membrana plasmatică (Figura 1F). Luate împreună, datele noastre indică faptul că domeniul EGF3 este responsabil pentru interacțiunea Netrin-1 cu DCC.

2.2. Domeniul EGF3 induce fosforilarea căilor din aval ale Netrinei-1

Interacțiunea Netrin-1 și DCC activează mai multe căi de semnalizare, inclusiv FAK, SFK și ERK [16,35]. Kinaza de adeziune focală (FAK) este una dintre activitățile majore de tirozinfosforilare legate de semnalizarea Netrin-1/DCC.

Netrin-1 activează fosforilarea FAK și fosforilarea proteinelor tirozin kinazelor din familia Src (SFKs) [17]. Atât căile de semnalizare FAK, cât și SFK joacă un rol esențial în stadiul de dezvoltare a sistemului nervos și repararea leziunilor [36,37]. În plus, Netrin-1 poate activa kinaza reglată de semnal extracelular-1/2 (ERK1/2), care mediază acțiunea căii proteinkinazei activate de mitogen (MAPK) [38-40].

Pentru a investiga dacă domeniul EGF3 este critic pentru activarea căilor de semnalizare din aval prin legarea Netrinei-1 la DCC, am examinat mai întâi efectul domeniului EGF3 asupra fosforilării tirozinei 861 a FAK (Figura 2A) . Am descoperit că ștergerea EGF3 a inhibat fosforilarea FAK în neuronii corticali de cultură (Figura 2B, C), confirmând astfel un rol esențial pentru EGF3 în calea de semnalizare a Netrin-1.

Apoi, neuronii corticali cultivați au fost stimulați cu proteina de fuziune GST-EGF3 timp de 20 de minute, iar western blot a confirmat în continuare că tratamentul cu proteina de fuziune GST-EGF3 a indus fosforilarea FAK, ERK și SFK (Figura 2D-G).

Aceste rezultate sugerează că domeniul EGF3 al Netrin-1 funcționează ca un puternic stimulator pentru a activa căile de semnalizare din aval.

Figura 1. Domeniul EGF3 al Netrin-1 este regiunea critică pentru interacțiunea Netrin-1/DCC. (A) Ilustrații ale structurilor Netrin-1. Construcțiile Netrin-1 sunt Netrin-1 de lungime completă, Netrin-1-(∆407–443) și GST-EGF3. (B) Netrină purificată-1-(∆407–443)-Myc/His au fost cuantificate printr-o comparație cu curba standard BSA. (C) Imunobtajarea fracției de trage în jos de către proteina de fuziune a domeniului GST-DCC FN5 și numai GST. (D) Imagini de imunofluorescență ale Flag-DCC care exprimă celule 293T incubate cu mediu de control, Netrin-1-myc/his și Netrin{-1-(∆407–443) -Myc/his timp de 30 de minute, respectiv, cantitativ analiză. Bară de scară, 10 µm. (E) Imunoblotting a fracțiunii pull-down de către proteina de fuziune GST-EGF3 și GST de-a lungul. (F) Imagini de imunofluorescență ale Flag-DCC care exprimă celule 293T incubate cu mediu de control și Pep EGF3 marcat FITC timp de 30 de minute, respectiv, și analiza cantitativă. Bară de scară, 10 µm.

Figura 2. Domeniul EGF3 activează căile în aval ale Netrin-1. (A) Procedura experimentală. (B) Neuronii corticali (E17 și DIV3) au fost stimulați cu Netrin-1, Netrin{-1-(∆4{07–443) sau mediu de control timp de 20 min. Lizatele celulare au fost incubate cu un anticorp anti-p-FAK-861 pentru a confirma activitatea Netrin-1. (C) Analiza cantitativă a rezultatelor Western blot este prezentată în (B). n=3. (D) Neuronii corticali (DIV3) au fost tratați cu 1,5 pM GST (+), 1,5 pM proteină de fuziune GST-EGF3 (+) sau 1,5 pMNetrin-1 (+) mediu timp de 20 de minute. Lizatele celulare au fost incubate cu anti-p-FAK-861, anti-p-SFK{-418 și anti-p-ERK-202/204.(E-G) Analiza cantitativă a westernului blot rezultatele prezentate în (D). n=3. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru toate analizele statistice prezentate în această figură (* p < 0,05, ** p < 0,01; ns, nesemnificativ). Detaliile analizei datelor sunt văzute în tabelul suplimentar S1.

2.3peptidele E1 și E2 interacționează cu DCC pentru a activa calea de semnalizare în aval a netrinei-1

După cum s-a descris anterior, o peptidă mică derivată din domeniul EGF3 al Netrin-1(aminoacizii 423-433) a indus fosforilarea ERK [27]. Am sintetizat peptidele E1 (reziduurile 407-422) și E2 (residuurile 423-433) care au fost derivate din domeniul EGF3 al Netrin-1 (Figura 3A).

Am descoperit că incubarea peptidei E1 a crescut nivelurile de FAK și SFK fosforilate (Figura 3B, D, E) în celulele culturii într-o manieră dependentă de doză, dar nu a modificat nivelurile de ERK fosforilat (Figura 3B, F).

Spre deosebire de peptida E1, peptida E2 nu numai că a indus fosforilarea tirozinei FAK (Figura 3C, G) și fosforilarea tirozinei SFK (Figura 3C, H), dar a indus și fosforilarea tirozinei a ERK (Figura 3C, I) în neuronii corticali cultivați.

Peptida de control (Pep Ctrl) nu a avut niciun efect detectabil asupra fosforilării tirozinei FAK, SFK și ERK (Figura S1). În plus, am observat că fosforilarea componentelor căii de semnalizare FAK indusă de peptida E1 a fost dependentă de timp (Figura S1). S2). Aceste rezultate indică faptul că E1 și E2 sunt peptidele funcționale minime ale Netrinei-1.

Figura 3. Secvențele minime ale domeniului EGF3 activează căile în aval ale Netrin-1. (A) Ilustrații ale peptidelor. (B) Neuronii corticali (DIV3) au fost stimulați cu concentrații de gradient de peptidă E1. Lizatele celulare au fost incubate cu anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 și anti-p-ERK-202/204. (C) Neuronii corticali cultivați au fost tratați cu concentrații în gradient de peptidă E2.

Lizatele au fost colectate și incubate cu anticorpii indicați pentru a măsura fosforilarea FAK, SFK și ERK. (D-F) Cuantificarea extinderii fosforilării FAK, SFK și ERK indusă de peptida E1 în neuroni este prezentată în (B). n=3. (G-I) Cuantificarea extinderii fosforilării FAK, SFK și ERK indusă de peptida E2 este prezentată în (C). n=3. (J) Neuronii corticali derivați de la DCC de tip sălbatic și embrioni mutante homozigoți au fost stimulați cu peptide derivate de Netrin-1 sau Netrin-1-și au fost lizați.

Lizatele rezultate au fost supuse imunoblotării. (K) Cuantificarea nivelurilor FAK PY{{0}} și DCC în neuronii mutanți DCC este prezentată în (J). n=3. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru toate analizele statistice prezentate în această figură (* p < 0,05; ns, nesemnificativ). Detaliile analizei datelor sunt văzute în tabelul suplimentar S1.

Pentru a determina dacă activarea căii de semnalizare FAK este dependentă de DCC, am măsurat gradul de fosforilare a tirozinei FAK indusă de aceste peptide în neuronii DCC+/+ și DCC-/-. Am descoperit că ambele peptide E1 și E2 nu au reușit să inducă fosforilarea FAK în neuronii DCC-/- (Figura 3J, K).

De asemenea, am constatat că peptidele E1 și E2 marcate cu Flag N-terminal sintetizate (Flag-E1 și Flag-E2) se leagă direct cu domeniul DCCFN5 (Figura S3).

2.4. Peptida E1 protejează neuronii de moartea celulară indusă de hemină in vitro

Pentru a prezenta protecția împotriva leziunii neuronale a peptidei E1, am folosit o reacție de toxicitate inductibilă a Heminului pentru a imita leziunile cerebrale secundare după hemoragia intracerebrală [41,42].

Celulele neuronale cultivate care exprimă GnRH (NLT) [43–45] au fost incubate cu hemină la diferite concentrații și durate. Incubarea celulelor NLT cu hemină la doza letală medială (60 pM) a dus la o scădere dependentă de timp a ratei de supraviețuire a celulei, ceea ce sugerează că hemina a fost preluată de neuroni și metabolizată (Figura S4).

Pentru a examina dacă expresia Netrinei-1 și DCC a răspuns la moartea celulelor neuronale induse de hemină, celulele NLT cultivate au fost incubate cu hemină pentru durate diferite. Rezultatele Western blot au demonstrat că nivelurile de expresie ale Netrin-1 și DCC au fost crescute semnificativ la 6 ore după incubarea heminei și apoi au scăzut treptat (Figura 4A, B).

Pentru a investiga dacă peptidele E1 și E2 au fost capabile să atenueze moartea neuronală indusă de hemină, am efectuat un test CCK-8 cu Netrin-1, PepCtrl, peptida E1 și peptida E2.

Am descoperit că aceste peptide nu au avut niciun efect detectabil asupra viabilității celulare (Figura 4C și Figura S5). În comparație cu incubarea cu Pep Ctrl și peptideE2, peptida E1 și Netrin-1 au ameliorat moartea neuronală indusă de hemină (Figura 4D). De asemenea, am colorat cu calceină-AM și PI pentru a distinge celulele vii și cele moarte.

Rezultatele au arătat că atât Netrin-1, cât și peptida E1 au protejat împotriva morții induse de hemină in vitro (Figura 4E-G). Mai mult, 1,5 pM peptida E1 a atenuat moartea indusă de hemină în neuronii de cultură primară (Figura 4H, I). În total, aceste rezultate au arătat că peptida E1 protejează neuronii de moartea celulară indusă de hemină.

2.5. Peptida E1 derivată de Netrin-1-Promovează recuperarea funcțională după ICH

Pentru a investiga dacă peptida E1 derivată din Netrin-1 joacă un rol important în recuperarea nefuncțională după un accident vascular cerebral hemoragic, am stabilit un model experimental de șoarece ICH prin injectarea colagenazei amestecate cu cerneală în striat (Figura S6A).

După trei zile, s-a arătat că imaginile feliei de creier urmăresc poziția injectării și volumul colagenazei cu cerneală (Figura S6B, C). Șoarecii cu hemoragie striatală au prezentat slăbiciune pe partea ipsilaterală din cauza leziunilor cerebrale (Figura S7A-C).

Hematomul din striat după ICH a fost vizibil în comparație cu injectarea cu soluție salină (Figura S7D). Nivelurile relative de proteine ​​de Netrin-1 și DCC în cortexul perihematomal au fost crescute la șoarecii ICH în comparație cu șoarecii martor în ziua 2, iar Netrin-1 a fost încă semnificativ mai mare în ziua 3, ceea ce indică faptul că Netrin-1 este important pentru recuperarea leziunilor cerebrale (Figura S7E, F).

Apoi, peptida TAT E1 marcată cu FITC (FITC-Pep TE1), care a adăugat o secvență TAT a capătului N-terminal al peptidei E1, a fost injectată în șoarecii ICH și s-a demonstrat că FITC-Pep TE1 traversează bariera hematoencefalică ( Figura S8).

ICH și șoarecii de control au fost injectați intraperitoneal cu peptida (12 mg/kg) zilnic sau cu un volum egal de soluție salină (Figura 5A). Am descoperit că administrarea cu peptida TE1 a îmbunătățit rata de supraviețuire și a salvat defectele greutății corporale după ICH (Figura 5B, C).

De asemenea, am găsit că volumul de colagenază urmărit cu un raport egal de cerneală în fiecare grup a fost similar, confirmând că acest model standard ICH de colagenază a dus la hematoame intrastriatale reproductibile (Figura 5D). Peptida TE1 a îmbunătățit scorurile comportamentale ale șoarecilor ICH în testul de îndepărtare a benzii (Figura 5E). ) și testul cilindrului (Figura 5F).

După cum era de așteptat, peptida TE1 a redus volumul infarctului după ICH (Figura 5G, H). Luate împreună, aceste rezultate sugerează că peptida E1 a putut să reducă volumul hematomului și să îmbunătățească recuperarea funcțională la un model de șoarece de ICH.

Figura 4. Peptida E1 ameliorează moartea celulară indusă de hemină in vitro. (A) Western blot de Netrin-1 și DCC în celulele NLT cultivate expuse la Hemin (6{0 µM). (B) Analiza cantitativă a rezultatelor western blotres este prezentată în (A). n=3. (C) Testele CCK-8 au arătat că peptidele în serie nu au modificat viabilitatea celulară. n=4. (D) 1,5 µM Pep E1 a păstrat viabilitatea celulelor NLT atunci când a fost adăugat bine după expunerea la hemină (60 µM). n=4. (E) Testul viu (verde)/Mort (roșu) al celulelor NLT expuse la hemină (60 µM, 6 ore). Bară de scară, 50 µm. (F, G) Analiza cantitativă a testului viu/mort din (E). n=9. (H) Testele CCK-8au arătat că Pep E1 ar putea reduce moartea celulară indusă de hemină în neuronii de cultură primară. n=8.(I) Imagistica de testare Vii/Morți a neuronilor de cultură primară (50 uM, 6 ore). Bară de scară, 50 µm. Datele sunt prezentate ca medii ± SEM. Pentru toate analizele statistice prezentate în această figură au fost utilizate ANOVA unidirecțional sau ANOVA bidirecțional (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nesemnificativ). Detaliile analizei datelor sunt văzute în tabelul suplimentar S1.

Figura 5. Peptida E1 derivată-1-netrină promovează procesul de recuperare după ICH. (A) Schema paradigmei experimentale a injectării intraperitoneale (IP) a peptidei TE1 în modelarea ICH a șoarecilor. (B) Raportul de supraviețuire post-ICH al fiecărui grup a fost înregistrat și a fost folosită metoda Kaplan-Meier. n=10. (C) Greutatea corporală se modifică la 5 zile după ICH. n=6.(D) Amestecul colaj/soluție salină cu un raport egal de cerneală (total 0,6 µL) injectat în striatul șoarecilor C57, imagini reprezentative care arată că zona de cerneală a fost similară la șoarecii tratați cu/ fără peptidă TE1 5 zile după ICH. (E, F) Injectarea IP a peptidei TE1 (12 mg/kg), dar nu a controlului TAT (12 mg/kg), comportament îmbunătățit, monitorizat de o sarcină de îndepărtare a benzii (E) sau o sarcină de colț (F).

Salin,n=10 animale individuale; ICH, n=6 animale individuale; ICH + TAT, n=6 animale individuale; ICH + TE1, n=8 animale individuale. (G) Secțiuni reprezentative colorate cu hematoxilină și eozină la șoarecii tratați cu/fără peptidă TE1 5 zile după ICH. Bară de scară, 1 mm. (H) Cuantificarea volumului hemoragiei în secțiunile creierului prezentate în (G).

Salină, n {{0}} animale individuale; ICH, n=6 animale individuale; ICH + TAT, n=6 animale individuale; ICH + TE1, n=8 animale individuale. Datele sunt prezentate ca medii ± SEM. Pentru toate analizele statistice prezentate în această figură au fost utilizate ANOVA unidirecțional sau ANOVA bidirecțional (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nesemnificativ). Detaliile analizei datelor sunt văzute în tabelul suplimentar S1.

2.6. Peptida E1 derivată de netrină reduce apoptoza neuronală după ICH

Pentru a explora mecanismele de bază ale peptidei E1 în procesul de recuperare funcțională a ICH. Am detectat degenerarea neuronală în regiunea perihematomală prin colorarea fluoro-jad C (FJC).

Am descoperit că administrarea peptidei TE1 a redus semnificativ numărul de celule FJC-pozitive în regiunile perihematom, indicând faptul că pep TE1 a inhibat degenerarea neuronală după ICH (Figura 6A, B). Am efectuat colorarea TUNEL și am constatat că peptida TE1 a scăzut semnificativ numărul de neuroni TUNEL-pozitivi (Figura 6C, D).

Numărul de astrocite TUNEL-pozitive nu a fost o schimbare detectabilă după tratamentul cu peptidă TE1 (Figura 6E, F). În plus, prin utilizarea dextranului de 4 kDa marcat cu FITC ca atracer pentru a indica permeabilitatea barierei hematoencefalice (BBB), am constatat că peptida TE1 nu a afectat recuperarea permeabilității BBB (Figura S9A, B).

Nivelurile serice de unități de fluorescență brute (RFU) au fost similare, confirmând prezența trasorului injectat la toate animalele analizate (Figura S9C). Am folosit, de asemenea, lectină marcată cu fluoresceină pentru a marca microvasele, dar nu am reușit să observăm nicio îmbunătățire după tratamentul TE1 (Figura S9D, E). Mai presus de toate, aceste constatări sugerează că peptida E1 promovează recuperarea neuronală după ICH prin inhibarea apoptozei neuronale.

Figura 6. Peptida E1 derivată de netrină -1-poate proteja împotriva morții și degenerării neuronale, dar nu și astrocitelor după ICH. (A) Secțiuni reprezentative colorate cu fluoro-jad C la șoarecii tratați cu/fără TE1 la 5 zile după ICH. Bară de scară, 50 µm și, respectiv, 10 µm. (B) Cuantificarea celulelor fluoro-jad C pozitive în regiunea perihematomală (n=4). (C) Colorarea TUNEL care arată efectele TE1 asupra leziunii cerebrale secundare (SBI) la 5 zile după debutul ICH. Imagini reprezentative din grupurile Saline, ICH, ICH + TAT și ICH + TE1.

Fiecare grup a fost supus ICH, cu excepția grupului cu soluție salină. Bară de scară, 50 µm și, respectiv, 10 µm. (D) Analizele cantitative pentru procentul de neuroni TUNEL-pozitivi sunt prezentate în (C). n=4. (E) Colocalizarea TUNEL cu GFAP la 5 zile după ICH. Imagini reprezentative de la Saline, ICH, ICH + TAT și ICH + TE1groups. Bară de scară, 50 µm și, respectiv, 10 µm. (F) Analizele cantitative pentru procentul de astrocite TUNEL-pozitive sunt prezentate în (E). n=4. Datele sunt prezentate ca medii ± SEM.

ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru toate analizele statistice prezentate în această figură (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 ns, nesemnificativ). Detaliile analizei datelor sunt văzute în tabelul suplimentar S1.

3. Discuție

Studiul nostru a identificat o secvență peptidică de bază a Netrin-1 care este crucială pentru recuperarea funcțională după ICH. Prin interacțiunea cu DCC, această peptidă derivată-1-netrină protejează împotriva morții neuronale din cauza leziunilor secundare după ICH și este, prin urmare, un tratament promițător pentru ICH.

Aplicarea terapeutică a Netrin-1, o proteină cu greutate moleculară mare, necesită identificarea secvenței funcționale minime a Netrin-1 care promovează semnalizarea în aval. În studiul nostru, au fost generate peptidele E1 (reziduurile 407–422) și E2 (reziduurile 423–433), care sunt derivate din domeniul EGF3 al Netrin-1. Am descoperit că peptida E1 (reziduurile 407–422) este protejată împotriva morții neuronale după ICH.

Am descoperit că nivelurile de expresie de Netrin-1 și DCC au fost crescute în celulele NLT după tratamentul cu hemină. Hemina este eliberată din hemoglobină după ICH și induce leziuni secundare atât la nivelul gliei, cât și al celulelor neuronale [46-48].

În plus, am observat, de asemenea, niveluri crescute de proteine ​​de Netrin-1 și DCC după ICH experimental. În plus, am observat, de asemenea, niveluri crescute de proteine ​​de netrină-1 și DCC în urma ICH experimentală.

Aceste rezultate sunt în concordanță cu rezultatele anterioare care arată că netrina-1 joacă un rol important în recuperarea după ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com