O nouă peptidă derivată de Netrin-1-îmbunătățește protecția împotriva morții neuronale și atenuează hemoragia intracerebrală la șoareci Partea 3

Grupele de tratament cu soluție salină, TAT sau TE1 (dizolvată în soluție salină) au fost date șoarecilor 2 după ICH și în fiecare zi timp de 5 zile prin injecție intraperitoneală la un volum total de 0,1 ml per animal. Peptidele au fost administrate în mod orb la doze de 12 mg/kg.

Soluția salină fiziologică este un tampon fiziologic utilizat în mod obișnuit, utilizat pe scară largă în experimente medicale și biologice. Dar știai? Salina fiziologică ne poate îmbunătăți și memoria!

În primul rând, soluția salină fiziologică joacă un rol important în funcționarea normală a celulelor. Poate menține presiunea osmotică celulară normală și poate menține morfologia și funcția normală a celulelor. În creier, un număr mare de celule nervoase au nevoie de soluție salină fiziologică ca substanță de bază, iar suplimentul de soluție salină fiziologică poate promova funcționarea normală a celulelor creierului, poate furniza suficient oxigen și substanțe nutritive pentru creier și poate face creierul mai sănătos.

În al doilea rând, soluția salină fiziologică poate promova transmiterea semnalului între neuronii creierului și poate îmbunătăți capacitatea de învățare a creierului. Studiile au arătat că în procesul de învățare a sarcinilor, injectarea de soluție salină fiziologică poate îmbunătăți semnificativ efectul de învățare al cursanților și poate îmbunătăți starea emoțională a cursanților, reduce anxietatea și stresul de învățare. În același timp, soluția salină fiziologică poate crește și numărul de neuroni și complexitatea neuronilor din hipocamp, ceea ce este favorabil formării și menținerii memoriei.

În plus, soluția salină fiziologică poate îmbunătăți mediul metabolic al creierului și poate reduce diferite efecte dăunătoare asupra creierului, cum ar fi deteriorarea, leziunile, ischemia și hipoxia. Aceștia sunt factori care pot răni creierul, iar injectarea de soluție salină fiziologică poate spori capacitatea de a face față a creierului și poate reduce daunele acestuia, îmbunătățind astfel memoria creierului și capacitatea de gândire.

În general, soluția salină este o substanță ideală pentru îmbunătățirea memoriei. Poate avea multiple efecte pozitive asupra creierului, inclusiv creșterea numărului și complexității neuronilor, îmbunătățirea mediului metabolic și promovarea transmiterii semnalului între neuroni. Prin urmare, atunci când trebuie să ne îmbunătățim memoria, ar putea la fel de bine să luăm în considerare injectarea de soluție salină pentru a oferi o protecție și un sprijin mai bun pentru creierul nostru. Se poate observa că trebuie să ne îmbunătățim memoria, iar Cistanche ne poate îmbunătăți în mod semnificativ memoria deoarece poate regla și echilibrul neurotransmițătorilor, cum ar fi creșterea nivelului de acetilcolină și a factorilor de creștere, care sunt foarte importanți pentru memorie și învățare. În plus, Cistanche poate, de asemenea, să îmbunătățească fluxul sanguin și să promoveze livrarea de oxigen, ceea ce poate asigura că creierul obține suficientă nutriție și energie, îmbunătățind astfel vitalitatea și rezistența creierului.

Faceți clic pe cunoașteți modalități de a vă îmbunătăți memoria

4.13. Model de șoarece indus de colagenază de ICH

Injecția cu colagenază este frecvent utilizată pentru a induce ICH [60]. Șoarecii masculi C57BL/6 (cu vârsta de 8 până la 12 săptămâni) au fost anesteziați cu izofluran (2 până la 5%) și plasați pe un cadru stereotaxic.

În timpul procedurii, temperatura corpului fiecărui animal a fost menținută la 37 ◦ C cu o pătură homeotermă. Folosind un instrument stereotaxic (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, China) și o seringă (Hamilton Company, Reno, NV, SUA), 0.3 µLof colagenază (0.{{12). }}45 UI Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA) a fost infuzat în striatul drept (AP: +0,2 mm; ML: -2,3 mm; DV: -3,5 mm) la un debit de 0,1 uL/min.

Un total de 0,3 µL de ser fiziologic a fost perfuzat animalelor martor. Toate procedurile chirurgicale au fost efectuate în condiții aseptice. În acest studiu, au fost utilizați peste 66 de șoareci masculi, iar animalele au fost repartizate aleatoriu în grupuri înainte de fiecare experiment [57].

4.14. Analiza Comportamentală

Analiza comportamentală neurologică a șoarecilor după formarea hematomului cerebral a fost detectată prin testul de îndepărtare a benzii adezive [61] și testul cilindrului [60]. Testul de îndepărtare a benzii adezive a fost efectuat prin plasarea benzii adezive pe regiunea de plantare a fiecărei labe anterioare (dreapta și stânga) a șoarecilor.

Fiecare șoarece a fost plasat într-o cușcă inedită.

Timpul de la momentul în care a fost aplicată banda până la momentul în care mouse-ul a îndepărtat-o ​​cu succes a fost înregistrat pentru fiecare labă. Au fost permise maxim 300 s pentru fiecare labă. Între experimente, animalele au fost găzduite în cuștile lor de acasă, într-o unitate fără agenți patogeni.

Testul cilindrului a fost efectuat prin plasarea unui mouse într-un cilindru transparent din sticlă acrilică (diametru: 8 cm; înălțime: 25 cm) în fața a 2 oglinzi și a unei camere timp de 5 min. Camera a fost amplasată central în fața celor 2 oglinzi și a cilindrului pentru a obține un videoclip optim.

Pentru evaluarea utilizării independente a membrelor anterioare, au fost evaluate (1) capacitatea șoarecilor de a contacta peretele cilindrului cu un membru anterior în timpul creșterii complete și (2) capacitatea șoarecilor de a ateriza cu un singur membru anterior pe podea după creșterea completă. Cel puțin 20 de puncte de contact pentru fiecare membru anterior au fost numărate folosind mișcarea lentă.

Pentru analiza inițială înainte de operație, testul a fost efectuat de două ori per șoarece, cu o pauză de 1 oră între încercări. Forelimbusul este exprimat ca raportul dintre utilizarea independentă a membrelor anterioare din partea dreaptă și cea stângă.

4.15. Analiza volumului hematomului

Pentru a determina dacă tratamentele au redus volumul hematomului, șoarecii au fost sacrificați la 5 zile după ICH; creierele au fost îndepărtate și înghețate în OCT. Secțiunile coronale au fost tăiate la o grosime de 30 µm și plasate direct pe lame de sticlă. Pentru a cuantifica volumul hematomului, secțiunile au fost digitizate la niveluri coronale standardizate.

Un utilizator orb a măsurat contururile și hematomul din emisfera stângă și dreaptă în fiecare secțiune. Volumul și umflarea hematomului au fost măsurate și calculate utilizând ImageJ (NIH).

Cel puțin 5 creiere per grup au fost supuse măsurătorilor hematomului, iar volumul hematomului a fost măsurat în tot creierul.

4.16. Colorare fluoro-jad C

Neurodegenerarea la șoareci după ICH indusă de colagenază a fost evaluată prin colorare cu un kit de colorare Fluoro-jade C Ready-to-Dilute (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Australia) conform protocolului producătorului [62].

Pe scurt, șoarecii martor și șoarecii ICH (± peptidă ip) au fost sacrificați la 5 zile după modelare, iar creierele au fost procesate conform protocolului utilizat pentru experimentul de imunocitochimie.

Insecticiile plutitoare au fost scufundate în soluție de hidroxid de sodiu 1% timp de 5 minute, clătite timp de 2 minute în etanol 70% și apoi clătite timp de 2 minute în apă distilată. Apoi, secțiunile plutitoare au fost scufundate într-o soluție de permanganat de potasiu 0,06% (KMnO4 în apă distilată) timp de 10 minute.

Secțiunile au fost spălate cu ddH2O înainte de a fi scufundate în soluție de colorare cu fluoro-jad 0.0001% (Fluoro-jad C în apă distilată) timp de 20 de minute cu agitare ușoară în întuneric.

Secțiunile au fost spălate cu ddH20, montate pe lame acoperite și uscate la temperatura camerei peste noapte în întuneric. Colorația fluoro-jad C în regiunea perihematomală a fost examinată folosind un microscop confocal Zeiss LSM 880. Cuantificarea colorării fluoro-jad a fost efectuată folosind software-ul ImageJ.

4.17. Imunofluorescența tisulară

Colorarea prin imunofluorescență tisulară a fost efectuată utilizând o serie de secțiuni cu grosimea de 30-µm. Secțiunile au fost incubate cu următorii anticorpi primari: anticorpi antiNeuN de șoarece (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, SUA) sau anticorpi anti-GFAP de șoarece (1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, SUA) la 4 ◦C peste noapte. După spălare cu PBS, secțiunile au fost apoi incubate cu anticorp Alexa Fluor 488-conjugat de măgar anti-șoarece (1:1000; Invitrogen, A21202, Carlsbad, CA, SUA).

4.18. Testul TUNEL

Un test terminal de deoxinucleotidil transferază mediată de deoxiuridin trifosfat (dUTP) nick end-labeling (TUNEL) a fost utilizat pentru a identifica celulele apoptotice cu fragmentare ADN nucleară în regiunea perihematomală a creierului.

Colorarea a fost realizată folosind un kit comercial de analiză a apoptozei one-stepTUNEL (Beyotime, C1090, Nanjing, China) și a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului. În urma imunofluorescenței tisulare, a fost efectuată reacția TUNEL.

Secțiunile de creier au fost incubate cu un amestec de reacție TUNEL (1 oră la 37 ◦C), apoi secțiunile au fost spălate cu PBS și contracolorate cu DAPI. Co-localizarea colorației NeuN-TUNEL a fost examinată folosind un microscop confocal Zeiss LSM 880.

Neuronii TUNEL-pozitivi (NeuN pozitivi) din regiunea perihematomală din interiorul striatului au fost cuantificați utilizând software-ul ImageJ pe trei imagini diferite per șoarece făcute sub un obiectiv de 20X. Colocalizarea colorării GFAP-TUNEL a fost similară cu cea a colorării NeuN-TUNEL.

4.19. Testul de permeabilitate a barierei hematoencefalice in vivo

In Vivo, testele de permeabilitate a barierei hematoencefalice au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [63–65]. Pe scurt, șoarecii de control și șoarecii ICH (peptidă ±ip) au fost injectați intraperitoneal cu dextran de 4 kDa marcat cu FITC (100 uL de stoc de 2 mM în PBS, Sigma Aldrich, 46944-100 MG-F, St Louis, MO, SUA) după modelare 5 zile, urmată de anestezie 5 min mai târziu.

După un timp de circulație de 10 minute pentru trasor, animalele au fost pregătite pentru perfuzia transcardică și s-au colectat ~ 300 pl de sânge din cavitatea toracică imediat după puncția atrială, urmată de perfuzie timp de 3 minute cu PBS. Hemibraul (liber de lobii olfactivi, cerebelul și creierul posterior) și un singur rinichi au fost colectate și imediat congelate cu azot nelichid și depozitate la -80 ◦ C.

Pentru măsurarea fluorescenței, probele au fost dezghețate cu gheață, cântărite și omogenizate în PBS (400 µL pentru hemicerebrum și 600 µL pentru rinichi), urmate de centrifugare timp de 20 de minute la 4 ◦ C și 15,000× g.

Supernatanții (100 µL), precum și volume egale de ser (1/5 diluție în PBS), au fost încărcați într-o placă neagră de 96-godeuri și fluorescența a fost măsurată la excitația corespunzătoare (490 nm)/emisia (520 nm). ) într-un cititor de plăci (Tecan, Männedorf, Elveția). Animalele simulate (fără tracerinjecție) au fost folosite pentru a scădea valorile de autofluorescență. Indicele de permeabilitate (mL/g) a fost calculat ca raport dintre RFU țesutului/g greutate țesut și RFU serice/mL ser.

4.20. Colorare fluorescentă cu lectină

Pentru a vizualiza microvasele creierului, am folosit lectină Lycopersicon esculentum conjugată cu fluoresceină (1:200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, CA, SUA) pentru a imersa secțiuni plutitoare timp de 1 oră.

Secțiunile au fost fotografiate pe un microscop confocal Zeiss LSM 880 sub un obiectiv de 20 ×, iar imaginile au fost procesate cu o setare gamma de 1,3. Au fost luate trei imagini din 3 zone prespecificate din regiunea perihematomală a creierului coronal peranimal. Punctele de ramificare a vaselor au fost cuantificate în fiecare creier de către un investigator orb. Un punct de ramificare a fost definit ca un singur vas marcat cu fluoresceină care se separă în mod vizibil în 2 urme de vase distincte și separate [66].

4.21. Analiza Statistică

Toate procedurile experimentale au fost efectuate în orb și efectuate de 3 ori independent, așa cum s-a descris anterior [67]. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Analiza statistică a fost efectuată prin One-way ANOVA, Two-way ANOVA și testul Student, după caz, folosind GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA ) și versiunea software SPSS 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, SUA).

Parametrii statistici pot fi găsiți în legendele figurilor relevante. Semnificația statistică a fost stabilită la *p < {{0}}.05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.]

5. Concluzii

Domeniul EGF3 al Netrin-1 este crucial pentru interacțiunea Netrin-1 cu DCC și poate activa diferite căi de semnalizare. Peptida trunchiată E1 a Netrin-1 (reziduurile 407-422) interacționează cu DCC pentru a proteja neuronii de toxicitatea indusă de hemină.

Aplicarea peptidei E1 îmbunătățește recuperarea funcțională într-un model experimental de ICH. În plus, peptida E1 poate proteja neuronii de degenerare și apoptoză după ICH.

Contribuții autor: Conceptualizare, LL, Z.-XH și X.-JZ; metodologie, LL, K.-JL și J.-BC; validarea H.-LY și X.-XH; ancheta, X.-JZ; curatarea datelor, JY; resurse LL și Z.-XH; scrierea LL, Z.-XH și X.-JZ; supraveghere, Z.-XH, X.-JZ; achiziție de finanțare, Z.-XHand X.-JZ Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțare: Această cercetare a fost finanțată de Fundația Națională de Științe Naturale din China (31671065 și 32071018), Planul de dezvoltare a științei și tehnologiei din provincia Jilin (202520YY01017404).

Declarația Comitetului de revizuire instituțională: Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor instituționale al Universității Normale de Nord-Est (NENU/IACUC, AP2016200299). Standardele naționale ale Republicii Populare Chineze (GB/T 35892–2018), Ghidul pentru animale de laborator pentru evaluarea etică a bunăstării animalelor, a fost ghidul pentru îngrijirea și protocoalele noastre pentru animale.

Declarație de consimțământ informat: Nu se aplică.

Mulțumiri: Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională de Științe Naturale din China (31671065 și 32071018) și de Planul de dezvoltare a științei și tehnologiei din provincia Jilin (202520YY01017404).

Conflicte de interese: Autorii nu declară niciun conflict de interese. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului; în colectarea, analizele sau interpretarea datelor; în scrierea manuscrisului sau în decizia de a publica rezultatele.

Referințe

1. Kirshner, HS Managementul medical al hemoragiei intracerebrale: înapoi la elemente de bază. Int. J. Clin. Practică. 2008, 62, 521–522.[CrossRef] [PubMed]

2. Anderson, CS; Heeley, E.; Huang, Y.; Wang, J.; Stapf, C.; Delcourt, C.; Lindley, R.; Robinson, T.; Lavados, P.; Neal, B.; et al. Scăderea rapidă a tensiunii arteriale la pacienții cu hemoragie intracerebrală acută. N. Engl. J. Med. 2013, 368, 2355–2365. [CrossRef][PubMed]

3. Qureshi, AI; Mendelow, AD; Hanley, DF Hemoragie intracerebrală. Lancet (Lond. Engl.) 2009, 373, 1632–1644. [CrossRef]

4. Keep, RF; Hua, Y.; Xi, G. Hemoragie intracerebrală: Mecanisme de leziune și ținte terapeutice. Lancet Neurol. 2012, 11.720–731. [CrossRef]

5. Schrag, M.; Kirshner, H. Managementul hemoragiei intracerebrale: Seminar Focus JACC. J. Am. col. Cardiol. 2020, 75, 1819–1831.[CrossRef] [PubMed]

6. Kandasamy, R.; Idris, Z.; Abdullah, JM Chirurgia hemoragiei intracerebrale. În chirurgia neurovasculară Abordări chirurgicale pentru bolile neurovasculare; July, J., Wahjoepramono, EJ, Eds.; Springer: Singapore, 2019; p. 201–210.7. Broughton,

7. Broughton, BR; Reutens, DC; Sobey, CG Mecanisme apoptotice după ischemie cerebrală. Stroke 2009, 40, e331–e339. [CrossRef][PubMed]

8. Kristiansen, M.; Graversen, JH; Jacobsen, C.; Sonne, O.; Hoffman, HJ; Law, SK; Moestrup, SK Identificarea receptorului de captare a hemoglobinei. Natura 2001, 409, 198–201. [CrossRef]

9. Madangarli, N.; Bonsack, F.; Dasari, R.; Sukumari-Ramesh, S. Hemoragie intracerebrală: componente ale sângelui și neurotoxicitate.Brain Sci. 2019, 9, 316. [CrossRef]

10. Deiner, MS; Kennedy, TE; Fazeli, A.; Serafini, T.; Tessier-Lavigne, M.; Sretavan, DW Netrin-1 și DCC mediază ghidarea axonilor la nivel local la discul optic: pierderea funcției duce la hipoplazia nervului optic. Neuron 1997, 19, 575–589. [CrossRef]

11. Kennedy, TE; Serafini, T.; de la Torre, JR; Tessier-Lavigne, M. Netrinele sunt factori chimiotropi difuzibili pentru axonii comisurali din măduva spinării embrionare. Cell 1994, 78, 425–435. [CrossRef]

12. Flores, C. Rolul netrinei-1 în organizarea și funcția sistemului dopaminergic mezocorticolimbic. J. Psihiatrie Neurosci. Jpn.2011, 36, 296–310. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com