Tranziția activă a fazei de memorie a fricii de la reconsolidare la dispariție prin prevenirea reconsolidării mediată de ERK

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Recuperareafricămemorieinduce două procese de memorie opuse, adică reconsolidarea și extincția. Recuperarea scurtă induce reconsolidarea pentru a menține sau spori fricamemorie, în timp ce recuperarea prelungită stinge această amintire. Deși mecanismele de reconsolidare și extincție au fost investigate, rămâne necunoscut modul în care fazele memoriei fricii sunt comutate de la reconsolidare la dispariție în timpul recuperării memoriei. Aici, arătăm că un proces de tranziție a memoriei dependent de kinaza reglată de semnal extracelular (ERK) după recuperare reglează trecerea fazelor de memorie de la reconsolidare la extincție prin prevenirea inducerii reconsolidării într-o sarcină de evitare inhibitorie (IA) la șoarecii masculi. În primul rând, faza memoriei de tranziție, care anulează inducerea reconsolidării, dar este insuficientă pentru dobândirea extincției, a fost identificată după reconsolidare, dar înaintea fazelor de extincție. În al doilea rând, fazele de reconsolidare, tranziție și extincție dupărecuperarea memorieiau arătat semnături moleculare și celulare distincte prin proteina de legare a elementelor care răspunde la cAMP (CREB) și fosforilarea ERK în amigdală, hipocamp și cortexul prefrontal medial (mPFC). Faza de reconsolidare a arătat o fosforilare crescută a CREB, în timp ce faza de extincție a afișat mai multe populații neuronale cu diferite combinații de fosforilare CREB și/sau ERK, în aceste regiuni ale creierului. Interesant este că cele trei faze de memorie, inclusiv faza de tranziție, au arătat activarea tranzitorie a ERK imediat după recuperare. Cel mai important, blocarea ERK în amigdală, hipocamp sau mPFC în faza de memorie de tranziție a dezinhibat îmbunătățirea indusă de reconsolidare a memoriei IA. Aceste observații sugerează că calea de semnalizare ERK reglează în mod activ tranziția fazei de memorie de la reconsolidare la dispariție și acest proces funcționează ca un comutator care anulează reconsolidarea fricii.memorie.

Cuvinte cheie: ERK; extincţie; memoria fricii; reconsolidare; tranziție

1Departamentul de Bioștiințe, Facultatea de Științe ale Vieții, Universitatea de Agricultură din Tokyo, Tokyo 156-8502, Japonia și

2Școala Absolventă de Agricultură și Științe ale Vieții, Universitatea din Tokyo, Tokyo 113-8657, Japonia

Declarație de semnificație

Recuperarea memoriei friciiinduce două procese de memorie opuse; reconsolidare și dispariție. Reconsolidarea menține/ îmbunătățeșteamintirea fricii, în timp ce dispariția slăbește memoria fricii. Rămâne necunoscut modul în care fazele memoriei sunt comutate de la reconsolidare la dispariție în timpul recuperării. Aici, am identificat un proces activ de tranziție a memoriei care funcționează ca un comutator care inhibă reconsolidarea. Această fază de tranziție a memoriei a arătat o creștere tranzitorie a fosforilării kinazei reglate de semnal extracelular (ERK) în amigdală, hipocamp și cortexul prefrontal medial (mPFC). Interesant este că inhibarea ERK în aceste regiuni în faza de tranziție a dezinhibat îmbunătățirea mediată de reconsolidare a memoriei de evitare a inhibiției (IA). Aceste descoperiri sugerează că procesul de memorie de tranziție reglează în mod activ schimbarea fazelor memoriei fricii ale memoriei fricii, împiedicând inducerea reconsolidării prin activarea căii de semnalizare ERK.

Introducere

Memorieregăsirea nu este un proces pasiv, ci este mai degrabă un proces dinamic care permite menținerea, întărirea, slăbirea sau alterarea/actualizarea unei memorie originale (Misanin și colab., 1968; Schneider și Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus și colab. ., 1979; Gordon, 1981; Nader și colab., 2000; Nader și Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima și colab., 2014). Important, o memorie de frică condiționată recuperată prin reexpunere scurtă la stimulul condiționat (CS) devine labilă și necesită reconsolidare dependentă de expresia genei pentru menținerea sau îmbunătățirea acesteia (Nader și colab., 2000; Dudai, 2002; Kida și colab., 2002; Suzuki și colab., 2004; Tronel și colab., 2005; Fukushima și colab., 2014). În schimb, reexpunerea continuă sau repetată la CS induce dispariția memoriei, ceea ce slăbește memoria fricii (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers și Davis, 2002). Astfel, regăsirea memoriei fricii induce două procese de memorie opuse, adică reconsolidarea și extincția, deși ambele procese sunt induse de reexpunerea la un CS identic, dar diferă în funcție de durata reexpunerii la CS.

Caracteristica biochimică comună și critică a reconsolidării și extincției este cerința pentru expresia genei mediată de proteina de legare a elementelor sensibile la cAMP (CREB) (Mamiya și colab., 2009). În mod interesant, am arătat semnături moleculare, anatomice și comportamentale contrastante între fazele de reconsolidare și extincție ale memoriei fricii contextuale (Suzuki și colab., 2004; Mamiya și colab., 2009). Blocarea sintezei proteinelor în timpul fazei de reconsolidare perturbă teama inițialămemorie, în timp ce blocarea sintezei proteinelor în timpul fazei de extincție nu reușește să facă acest lucru, deși memoria contextuală a fricii a fost reactivată. Cerința ca regiunile creierului să afișeze activarea expresiei genelor mediate de CREB diferă între reconsolidare și extincție; reconsolidarea depinde de amigdală și hipocamp, în timp ce extincția se bazează pe amigdală și cortexul prefrontal medial (mPFC). Cu toate acestea, cursul în timp al activării CREB amigdaloidului diferă între fazele de memorie de reconsolidare și extincție. Aceste observații au sugerat că fazele de reconsolidare și extincție nu sunt independente, ci mai degrabă interacționează între ele. Interesant este că studiile recente au identificat o fereastră de timp (faza de tranziție) care nu arată nicio activare extracelulară a kinazei reglate de semnal (ERK) în amigdală după reconsolidare, dar înaintea fazelor de extincție după regăsirea memoriei fricii auditive (Merlo et al., 2018). ). Luate împreună, aceste descoperiri sugerează posibilele mecanisme prin care fazele memoriei sunt comutate de la reconsolidare la dispariție în timpul recuperării memoriei fricii. Cu alte cuvinte, este posibil ca procesul de tranziție a memoriei să regleze activ acest comutator.

Într-o sarcină de evitare inhibitorie (IA), șoarecii primesc un șoc electric după ce intră într-un compartiment întunecat dintr-un compartiment ușor și formeazămemoriepentru a evita compartimentul întunecat. Anterior, folosind această sarcină, am arătat că fazele de reconsolidare și extincție pot fi discriminate în momentul în care un șoarece intră într-un compartiment întunecat dintr-un compartiment luminos în timpul unei sesiuni de reexpunere (Fukushima et al., 2014). Prin urmare, această sarcină ne permite să caracterizăm semnăturile moleculare de perspectivă ale fazelor de reconsolidare și extincție, în contrast cu paradigma clasică de condiționare a fricii contextuale în care reactivarea memoriei fricii condiționate prin reexpunerea la CS inițiază atât reconsolidarea, cât și extincția; reexpunerea scurtă (3 min) la contextul condiționat induce reconsolidarea, în timp ce reexpunerea lungă (30 min) sau repetată la acest context induce extincția (Eisenberg și colab., 2003; Pedreira și Maldonado, 2003; Suzuki și colab., 2004; Lee și colab., 2008; Mamiya și colab., 2009). În plus, am constatat că memoria IA recuperată este îmbunătățită prin reconsolidarea memoriei în această sarcină (Fukushima et al., 2014).

Pentru a înțelege mecanismul de trecere de la reconsolidare la dispariție în timpul recuperării friciimemorie, ne-am propus să identificăm și să caracterizăm semnăturile moleculare, celulare și comportamentale ale fazelor de reconsolidare, tranziție și extincție ale memoriei IA. Am analizat activarea CREB și ERK în amigdală, hipocamp și mPFC în fazele de reconsolidare, tranziție și extincție și am examinat rolurile activării ERK în aceste procese de memorie.

Materiale și metode

Șoareci Toate experimentele au fost efectuate conform Ghidului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (Japan Neuroscience Society și Tokyo University of Agriculture). Toate experimentele pe animale efectuate în acest studiu au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea de Agricultură din Tokyo (autorizație #280037). Toate procedurile chirurgicale au fost efectuate sub anestezie Nembutal și s-au depus toate eforturile pentru a minimiza suferința. Șoarecii masculi C57BL/6N au fost obținuți de la Charles River. Șoarecii au fost găzduiți în cuști de cinci sau șase, menținuți pe un ciclu lumină/întuneric de 12/12 ore și au permis accesul la hrană și apă ad libitum. Soarecii aveau cel putin opt saptamani cand au fost testati. Testarea a fost efectuată în timpul fazei de lumină a ciclului. Toate experimentele au fost efectuate în orb față de starea de tratament a șoarecilor.

Testul IA Aparatul de trecere IA (OHARA Pharmaceutical) a constat dintr-o cutie cu compartimente separate de lumină și întuneric (ambele 15,5 12,5 11,5 cm). Compartimentul de lumină a fost iluminat de o lumină fluorescentă (2500 lux; Fukushima și colab., 2008, 2014; Zhang și colab., 2011; Ishikawa și colab., 2016). Înainte de începerea antrenamentului IA, șoarecii au fost manipulați individual timp de 2 minute în fiecare zi timp de o săptămână. În timpul sesiunilor de antrenament, fiecărui șoarece i sa permis să se obișnuiască cu compartimentul de lumină timp de 30 de secunde, iar ușa ghilotinei a fost ridicată pentru a permite accesul la compartimentul întunecat. Latența de a intra în compartimentul întunecat a fost considerată o măsură de achiziție. De îndată ce șoarecele a intrat în compartimentul întunecat, ușa ghilotinei a fost închisă. După 5 s, a fost eliberat un șoc la picior (0,2 mA) pentru o perioadă totală de 2 s (antrenament). La 24 de ore după sesiunea de antrenament, mouse-ul a fost plasat înapoi în compartimentul luminos până a intrat în compartimentul întunecat (media 459 6 15.49 s). Imediat după ce șoarecele a intrat în compartimentul întunecat, ușa ghilotinei a fost închisă și șoarecele a rămas în compartimentul întunecat pentru o perioadă diferită de timp (0, 1 sau 10 minute) fără un șoc de picior (reactivare). Memoria a fost evaluată 48 de ore mai târziu [testul de memorie pe termen lung postreactivare (PR-LTM)] ca latență de încrucișare pentru ca mouse-ul să intre în compartimentul întunecat atunci când a fost înlocuit în compartimentul de lumină, ca în reactivare.

Pentru primul experiment, am examinat efectul inhibării sintezei proteinelor după reactivare (reexpunere la compartimentul întunecat timp de 0, 1 sau 10 min; Fig. 1). Inhibitorul sintezei proteinelor anisomicină (ANI; Wako) a fost dizolvat în soluție salină (pH ajustat la 7,0-7,4 cu NaOH). Șoarecii au fost antrenați așa cum este descris mai sus și, la 24 de ore mai târziu, au primit vehicul (VEH) sau ANI (150 mg/kg, ip) imediat după reexpunerea la compartimentul întunecat timp de 0, 1 sau 10 minute fără un șoc la picior. (reactivare). La această doză, ANI inhibă 0,90% din sinteza proteinelor din creier în primele 2 ore (Flood et al., 1973). La 48 de ore după sesiunea de reactivare, șoarecii individuali au fost plasați din nou în compartimentul de lumină și a fost evaluată latența de încrucișare.

Pentru al doilea experiment [imunohistochimie CREB fosforilat (pCREB) și ERK fosforilat (pERK); Figurile. 2–5], am examinat regiunile creierului care au fost activate după reexpunerea la lumină (până când șoarecii au intrat în compartimentul întunecat, reexpunerea la compartimentul întunecat timp de 0 min) sau compartimentul întunecat (re- expunerea la compartimentul întunecat timp de 1 sau 10 min). Șoarecii au fost împărțiți în patru Fukushima și colab. · Transition of Fear Memory Phases after Retrieval J. Neurosci., 10 februarie 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289groups. La 24 de ore după antrenament, șoarecii individuali au fost reexpuși la compartimentul de lumină și apoi au rămas în compartimentul întunecat după intrarea lor din compartimentul întunecat [reactivare: 0 min în compartimentul întunecat, grup de reconsolidare (Recon); 1 min, grup de tranziție (Tran); 10 min, grupa extincție (Ext)]. Un alt grup de șoareci nu a fost returnat în compartimentul de lumină/întuneric [grup nereactivat (NR)]. Șoarecii au fost apoi anesteziați cu Nembutal (750 mg/kg, ip) la 5, 15 sau 30 de minute după reactivare.

Pentru al treilea experiment (microinfuzie de U0126; Figurile 6, 7), am examinat efectele inhibării ERK în amigdală, hipocamp sau mPFC asupramemoriereconsolidare/îmbunătățire, tranziție și dispariție. Inhibitorul MEK U0126 (Sigma-Aldrich) a fost dizolvat în lichidul cefalorahidian artificial care conține trei picături de Tween 80 (Sigma) în 2,5 ml de 7,5% dimetil sulfoxid (Wako) și ajustat la pH 7,4 cu NaOH. Șoarecii au fost antrenați așa cum este descris mai sus și, 24 de ore mai târziu, au fost plasați înapoi în compartimentul de lumină (reactivare). Șoarecii au fost microinfuzați cu U0126 (1 mg) sau VEH în diferitele regiuni ale creierului imediat după (Figurile 6A, C, E–H, 7A–C) sau la 30 minute după (Fig. 6B, D) reactivare. La 48 de ore după reactivare, șoarecii individuali au fost plasați din nou în compartimentul de lumină și a fost evaluată latența de încrucișare (PR LTM). Microinfuziile în hipocamp și mPFC (0,5 ml) au fost făcute cu o viteză de 0,25 ml/min. Microinfuziile în amigdală (0,2 ml) au fost făcute cu o viteză de 0,1 ml/min. Canula de injecție a fost lăsată pe loc timp de 2 minute după microinfuzie și șoarecii au fost apoi înapoiați în cuștile lor de acasă. Inhibitorul MEK SL327 (Santa Cruz Biotechnology) a fost dizolvat în dimetil sulfoxid și diluat cu soluție salină. Șoarecii au fost dresați așa cum este descris mai sus și 24 de ore mai târziu, șoarecii individuali au fost plasați înapoi în compartimentul de lumină (reactivare). Șoarecii au fost injectați sistemic cu SL327 (10 sau 20 mg/kg) sau VEH imediat după reactivare (Fig. 7D-F). La 48 de ore după reactivare, șoarecii individuali au fost plasați din nou în compartimentul de lumină și a fost evaluată latența de încrucișare (PR-LTM).

Imunohistochimia a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Mamiya și colab., 2009; Suzuki și colab., 2011; Zhang și colab., 2011; Fukushima și colab., 2014; Ishikawa și colab., 2016; Hasegawa și colab., 2019). După anestezie, toți șoarecii au fost perfuzați cu 4% paraformaldehidă. Creierele au fost îndepărtate, fixate peste noapte, transferate la 30% zaharoză și depozitate la 4 grade. Secțiunile coronale (30 mm) au fost tăiate într-un criostat.

Pentru colorarea pCREB și pERK, secțiunile care plutesc liber au fost tratate cu 1% H2O2 și incubate peste noapte cu un anticorp policlonal de iepure anti-fosfo-CREB (serină 133; S133) (1:1000; #{{10) }}, Millipore) și/sau anticorp monoclonal de iepure anti-fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) în soluție de blocare (soluție salină tamponată cu fosfat plus 1% albumină serică de capră, 1 mg/ml albumină serică bovină și 0,05% Triton X-100). Secțiunile au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat și incubate cu IgG anti-iepure de măgar conjugat cu peroxidază de hrean (1:500; Jackson ImmunoResearch) pentru pCREB sau IgG de capră anti-iepure conjugat cu peroxidază de hrean pentru pERK timp de 1 oră la temperatura camerei. Semnalele pCREB au fost amplificate de tiramidă de biotină și vizualizate folosind streptavidină conjugată cu Alexa Fluor (Invitrogen). Semnalele pERK au fost amplificate cu TSA-FCM (Invitrogen). Secțiunile au fost montate pe lame și acoperite cu lame folosind un mediu de montare (Millipore).

Cuantificarea a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Frankland și colab., 2006; Fukushima și colab., 2014; Mamiya și colab., 2009; Zhang și colab., 2011; Suzuki și colab., 2008). Structurile au fost definite anatomic conform atlasului lui Franklin și Paxinos (1997). Toți neuronii imunoreactivi au fost numărați de un experimentator orb la starea de tratament

Rezultate

Caracterizarea fazelor de memorie după regăsire în sarcina IA

Sarcina IA ne permite să discriminăm fazele de reconsolidare și extincție în momentul în care un șoarece intră într-un compartiment întunecat dintr-un compartiment luminos (Fukushima et al., 2014). Pentru a înțelege mecanismul care stă la baza trecerii fazelor de memorie de la reconsolidare la dispariție, am caracterizat fazele memoriei IA după recuperarea memoriei prin examinarea efectelor inhibării sintezei proteinelor care este necesară pentru reconsolidarea și stingerea memoriei IA (Fukushima și colab., 2014). Șoarecii au fost plasați mai întâi în compartimentul de lumină. La 5 s după ce au intrat în compartimentul întunecat, a fost emis un scurt șoc electric la picior (antrenament). Șoarecii au fost reexpuși la compartimentul de lumină la 24 de ore după antrenament (sesiunea de reactivare; Fig. 1A) și a fost evaluată latența lor de încrucișare pentru a intra în compartimentul întunecat (Fig. 1B). Șoarecii au fost înapoiați în cuștile lor de acasă imediat după ce au intrat în compartimentul întunecat din compartimentul de lumină (0-reexpunere min. la compartimentul întunecat; faza de reconsolidare) sau au rămas în compartimentul întunecat timp de 1, 3 sau 10 min fără a primi un șoc la picior (faza de extincție; Fig. 1C–E). Imediat după sesiunea de reactivare, șoarecii au primit o injecție sistemică de VEH sau inhibitor al sintezei proteinelor ANI. La 48 de ore mai târziu, a fost evaluată latența de încrucișare PR-LTM.

În concordanță cu studiul nostru anterior (Fukushima și colab., 2014), reexpunerea la compartimentul luminos (grup 0 min) a indus reconsolidarea și îmbunătățirea memoriei IA. O ANOVA bidirecțională a evidențiat efecte semnificative ale timpului (F(1,24)=10.433, p=0.{{{20}}036), medicamentului (F(1) ,24)=23.197, p, 0,0001) și interacțiunea medicamentoasă în timp (F(1,24)=25.022, p, 0,0001; Fig. 1B). Testul post-hoc Bonferroni și testul t pereche au arătat că grupurile VEH și ANI au afișat o latență de încrucișare semnificativ crescută sau, respectiv, scăzută la PR-LTM în comparație cu sesiunea de reactivare (ps , 0,05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; Fig. 1B). Aceste observații indică faptul că recuperarea memoriei IA în compartimentul de lumină a îmbunătățit memoria, în timp ce inhibarea sintezei proteinelor a perturbat memoria recuperată, confirmând observația anterioară că recuperarea memoriei IA îmbunătățește memoria prin reconsolidare într-o manieră dependentă de sinteza proteinelor.

În schimb, reexpunerea la compartimentul întunecat a indus extincția pe termen lung [ANOVA bidirecțională, timp (Fig. 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04; Fig. 1D, F(1,36)=11.699, p=0.0016), medicament (Fig. 1C, F(1,28)=4.674, p=0.039; Fig. 1D, F(1,36)=12.285, p {{29 }}.0012), interacțiunea medicamentoasă în timp (Fig. 1C, F(1,28)=7.916, p=0.009; Fig. 1D, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], așa cum sa observat anterior (Fukushima și colab., 2014). Grupurile VEH care au stat în compartimentul întunecat timp de 3 sau 10 minute au prezentat o scădere semnificativă a latenței încrucișate la PR-LTM în comparație cu sesiunea de reactivare, în timp ce grupurile ANI au afișat o latență încrucișată comparabilă la PR-LTM în comparație cu sesiunea de reactivare și cu Grupuri VEH (testul post-hoc Bonferroni, ps , 0,05; test t pereche, Fig. 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, p. 0.05; Fig. 1D, VEH, t(9)=10.211, p , 0.0001, ANI, t(9)=1.02, p. 0.05 ). Aceste observații indică faptul că reexpunerea la compartimentul întunecat timp de 3 sau 10 minute a stins memoria IA și că inhibarea sintezei proteinelor a blocat extincția pe termen lung. Astfel, recuperarea memoriei IA în compartimentul întunecat stinge memoria IA într-o manieră dependentă de expresia genei.

Este important că grupul VEH a arătat o latență încrucișată comparabilă la PR-LTM în comparație cu sesiunea de reactivare și cu grupul ANI atunci când au stat în compartimentul întunecat timp de 1 min [ANOVA bidirecțională, timp (F(1,36) {{ 5}}.03, pag. 0.05), medicament (F(1,36)=0.019, pag. 0.05), interacțiunea medicamentoasă în timp (F(1,36)=0.011, p. 0.05); testul post hoc Bonferroni, ps . 0,05; test t pereche, VEH, t(9)=0.091, p . 0,05, ANI, t(9)=0,328, p . 0,05; Fig. 1E]. Aceste observații indică faptul că grupul VEH nu a arătat nici îmbunătățirea, nici stingerea memoriei IA și că grupul ANI nu a arătat nicio perturbare a memoriei IA. Prin urmare, reexpunerea la compartimentul întunecat timp de 1 min a blocat atât îmbunătățirea, cât și perturbarea indusă de ANI a memoriei IA reactivate, dar nu a stins memoria IA, sugerând că această 1-reexpunere min. anulează inducerea reconsolidării. , dar este insuficientă pentru a stinge memoria IA.

În rezumat, aceste rezultate au indicat că reexpunerea la compartimentul de lumină induce faza de reconsolidare, în timp ce reexpunerea mai lungă la compartimentul întunecat (3 sau 10 min) induce faza de stingere. Mai important, rămânerea timp de 1 minut în compartimentul întunecat induce faza de tranziție de la reconsolidare la extincție, care inhibă reconsolidarea memoriei fricii fără a induce extincția.

Semnături moleculare ale fazelor de reconsolidare, tranziție și extincție în amigdală, hipocamp și mPFC după recuperarea memoriei IA

Reconsolidarea și stingerea memoriei fricii contextuale arată creșteri ale fosforilării CREB la S133, un marker al activării expresiei genelor necesar pentru reconsolidare și extincție pe termen lung, dar arată o dinamică distinctă a fosforilării CREB (Mamiya și colab., 2009). ). Interesant este că studiile recente au arătat că nu există o creștere a fosforilării ERK, un regulator din amonte al CREB (Impey și colab., 1998; Wu et al., 2001), în regiunea bazolaterală a amigdalei la tranziția de la reconsolidare. la stingerea unei amintiri de frică semnalată, deși această fosforilare este crescută în regiunea bazolaterală atunci când o memorie de frică semnalată este reconsolidată și stinsă (Merlo et al., 2014, 2018). Un alt studiu a indicat că ERK hipocampal este activat numai atunci când memoria fricii contextuale este stinsă, dar nu este reconsolidată (Tronson et al., 2009). Aceste descoperiri sugerează că fazele de reconsolidare, tranziție și extincție prezintă semnături moleculare și celulare distincte. Prin urmare, am măsurat și comparat nivelurile de pCREB și pERK în fazele de reconsolidare, tranziție și extincție folosind imunohistochimie. Am efectuat programe experimentale similare ca în Figura 1B, D, E folosind patru grupuri experimentale. Șoarecii au fost reexpuși la compartimentul de lumină la 24 de ore după antrenament și apoi au rămas în compartimentul întunecat [reactivare: 0 min în compartimentul întunecat, grup de reconsolidare (Recon); 1 min, grup de tranziție (Tran); 10 min, grupa extincție (Ext)]. Un alt grup de șoareci nu a fost returnat în compartimentul de lumină/întuneric (nereactivat, grup NR). Am numărat neuronii pCREB-pozitivi (pCREB1), neuronii pERK-pozitivi (pERK1) și neuronii dublu-pozitivi (pCREB1/pERK1) în amigdală, hipocamp și mPFC la 30 de minute după sesiunea de reactivare.

Amigdala (regiunea laterală) CREB a fost activată în fazele de extincție și reconsolidare, în timp ce ERK a fost activată doar în faza de extincție (Fig. 2A-C). O ANOVA unidirecțională a evidențiat un efect semnificativ al grupului (Fig. 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). Similar cu descoperirile anterioare (Mamiya et al., 2009), testul post-hoc Newman-Keuls a arătat că grupurile Recon și Ext au arătat semnificativ mai mulți neuroni pCREB1 decât celelalte grupuri (p, 0,05). Aceste observații au indicat că, similar cu observațiile la nivelurile comportamentale (Fig. 1), expunerea la compartimentul întunecat timp de 1 min (faza de tranziție) anulează „pornirea” fosforilării CREB care ar fi crescută în faza de reconsolidare. În contrast, au fost observați semnificativ mai mulți neuroni pERK1 în grupul Ext decât în ​​celelalte grupuri, deși au fost mult mai puțini neuroni pERK1 decât neuronii pCREB1 în grupul Ext (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; Fig. 2C).

În mod constant, au fost observați semnificativ mai mulți neuroni dublu pozitivi (pCREB1/pERK1) în grupul Ext (F(3,29)=6.698, p=0.00 14; Fig. 2D), în timp ce semnificativ mai mulți neuroni pCREB1/pERK– (pCREB unic pozitiv) au fost observați în grupurile Recon și Ext (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; Fig. 2E). Astfel, faza de reconsolidare a arătat doar o singură populație de neuroni pCREB1/pERK-. În schimb, faza de extincție a arătat două populații de neuroni pCREB1/pERK– și pCREB1/pERK1, ceea ce indică faptul că ERK este activat doar într-un subset de neuroni pCREB1. Important, au fost observate rezultate similare în regiunea bazolaterală a amigdalei (Fig. 2G, F(3,29)=13.042, p, 0,0001; Fig. 2H, F(3,29) {{32} },824, p=0,0201; Fig. 2I, F(3,29)=12.633, p , 0,0001; Fig. 2J, F(3,29)=12 .505, p , 0,0001).

Activarea bifazică a ERK în faza de extincție ERK este un activator în amonte al CREB și, prin urmare, activarea ERK este necesară pentru consolidarea și reconsolidarea memoriei fricii (Schafe și colab., 200{{31). }}; Duvarci et al., 2005). Cu toate acestea, în mod inconsecvent, nu a fost observată nicio activare ERK în amigdală, hipocamp sau mPFC în faza de reconsolidare când pERK a fost măsurat la 30 min după sesiunea de reactivare (Fig. 2-4). Prin urmare, am examinat cursurile de timp ale fosforilării ERK și CREB. Am efectuat un experiment similar ca în figurile 2-4, cu excepția faptului că nivelurile pCREB și pERK au fost măsurate la 5, 15 și 30 min după sesiunea de reactivare (reexpunere la compartimentul întunecat pentru {{ 66}}, 1 sau 10 min; Fig. 5A). În conformitate cu datele prezentate în figurile 2-4, creșteri semnificative ale neuronilor pCREB1 au fost observate la 30 de minute, dar nu la 5 minute, după sesiunea de reactivare în Recon (amigdala, mPFC și hipocamp) și Ext (amigdala și mPFC). ), dar nu și grupul Tran (Fig. 5E, ANOVA unidirecțional, amigdala, 5 min, F(3,23)=0.346, p . 0,05, 30 min, F(3,23)=15,272, p, 0,0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1,169, p. 0,05, 30 min, F(3,23)=32. 346, p, 0,0001; hipocamp, 5 min, F(3,23)=0,154, p. 0,05, 30 min, F(3,23)=16,197, p, 0,0001; test t nepereche, amigdala, reconsolidare, 5 vs 30 min, t(12)=7.807, p , 0,0001, extincție, 5 vs 30 min, t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, reconsolidare, 5 vs 30 min, t(12)=5.727, p , 0,0001, extincție, 5 vs 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013; regiunea CA1 hipocampală, reconsolidare, 5 vs 30 min, t(12)=2.339, p=0.0374).

Interesant, au fost observate creșteri semnificative ale neuronilor pERK1 în amigdala, mPFC și hipocampul grupurilor Recon, Tran și Ext la 5 minute după sesiunea de reactivare în comparație cu grupul NR (Fig. 5F, amigdala, F(3,23)=10,961, p=0.0{0{01; mPFC, F(3,23)=7,525, p { {13}}.0011; hipocamp, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Aceste observații au indicat că ERK este activat imediat după sesiunea de reactivare în toate fazele de memorie. Cu toate acestea, aceste creșteri ale numărului de neuroni pERK1 au revenit la niveluri bazale (comparabile cu grupul NR) la 15 minute după sesiunea de reactivare (Fig. 5F, amigdala, F(3,20)=2.676, p. 0,05; mPFC, F(3,23)=0,683, p. 0,05; hipocamp, F(3,20)=0,74, p. 0,05). În plus, în concordanță cu constatările prezentate în figurile 2-4, au fost observați semnificativ mai mulți neuroni pERK1 în amigdală, mPFC și hipocamp la 30 de minute după sesiunea de reactivare numai în grupul Ext (Fig. 5F, amigdala, F(). 3,23)=6,616, p=0,022; mPFC, F(3,23)=8,012, p=0,0008; hipocamp, F( 3,23)=6.206, p=0.003). Astfel, fazele de reconsolidare și de tranziție arată activarea tranzitorie a ERK doar la momentul timpuriu (5 min), în timp ce faza de extincție arată activarea bifazică a ERK la timpurii timpurii (5 min) și târziu (30 min) după reactivare. sesiune. Aceste observații au indicat că mecanismele de reglare a activării ERK diferă în fazele de reconsolidare/tranziție și extincție. În mod colectiv, observațiile noastre au demonstrat că fazele de reconsolidare, tranziție și extincție prezintă semnături moleculare distincte.

Rolurile activării ERK în fazele de reconsolidare și extincție ale memoriei IA

Fazele de reconsolidare/tranziție și extincție au prezentat activare ERK monofazică și, respectiv, bifazică. Apoi am investigat și comparat rolurile activării precoce (5 min) și târzie (30 min) ale ERK în mPFC în fazele de reconsolidare și extincție, examinând efectele inhibării ERK (Fig. 6).

Discuţie

În acest studiu, am investigat mecanismele de tranziție a memoriei de la fazele de reconsolidare la fazele de extincție după regăsirea memoriei IA. Am caracterizat mai întâi semnăturile comportamentale ale fazelor de memorie IA după recuperare. În concordanță cu studiul nostru anterior (Fukushima și colab., 2014), reconsolidarea și extincția induse de recuperarea memoriei IA prin reexpunere la lumină (0 min în compartimentul întunecat) și întuneric ( 3 sau respectiv 10 min) compartimente. Interesant, memoria IA nu a fost nici îmbunătățită, nici stinsă și a arătat rezistență la inhibarea sintezei proteinelor atunci când șoarecii au fost reexpuși la compartimentul întunecat pentru doar 1 minut. Prin urmare, aceste observații sugerează că o reexpunere de 1-min la compartimentul întunecat anulează inducerea reconsolidării, dar este insuficientă pentru a stinge memoria IA. În plus, am constatat că ERK a fost activat în amigdală, hipocamp și mPFC la un moment timpuriu (5 minute) după reexpunerea la compartimentul întunecat timp de 0, 1 sau 10 minute. În mod constant, inhibarea ERK în aceste regiuni ale creierului a blocat reconsolidarea/îmbunătățirea și stingerea memoriei IA. Cel mai important, inhibarea ERK în amigdală, hipocamp și mPFC după 1-minute de reexpunere la compartimentul întunecat a dezinhibat îmbunătățirea mediată de reconsolidare a memoriei IA, sugerând că activarea ERK după reexpuneri scurte (1 minut) la compartimentul întunecat este necesar pentru inhibarea reconsolidării memoriei IA. În schimb, o reexpunere de 1-min la compartimentul întunecat a fost insuficientă pentru a stinge memoria IA, deși o reexpunere extinsă la compartimentul întunecat (3 sau 10 minute) a stins această memorie. Prin urmare, rezultatele noastre sugerează că o reexpunere de 1-min la compartimentul întunecat induce un proces de tranziție a memoriei care anulează reconsolidarea/îmbunătățirea, dar nu inițiază învățarea de extincție. În mod colectiv, sugerăm că procesul de tranziție a memoriei contribuie la trecerea fazelor de memorie de la reconsolidare la dispariție prin prevenirea reconsolidării mediată de ERK.

Similar cu observațiile noastre actuale, un studiu recent care utilizează condiționarea fricii auditive a arătat că prezentările CS unice (1) sau prelungite (10) induc reconsolidarea și, respectiv, extincția memoriei printr-o creștere a nivelurilor pERK în regiunea bazolaterală a amigdalei. În schimb, prezentările intermediare (4-7) CS nu modifică nivelurile pERK în regiunea bazolaterală a amigdalei. Important, inhibarea ERK la prezentările intermediare CS nu a afectat memoria fricii. Acest studiu a sugerat că există o tranziție a fazei de memorie de la reconsolidare la dispariție după recuperarea memoriei fricii (Merlo et al., 2018). În studiul de față, am extins această constatare și am sugerat că faza de tranziție comută în mod activ fazele de memorie de la reconsolidare la extincție prin activarea căii de transducție a semnalului ERK. Spre deosebire de descoperirile anterioare (Merlo et al., 2018), am constatat că faza de tranziție implică fosforilarea ERK în amigdală, hipocamp și mPFC. Aceste discrepanțe poate din cauza diferenței de puncte de timp care examinează fosforilarea ERK; studiul anterior a măsurat nivelurile de pERK la;12 minute după prezentarea CS (Merlo et al., 2018), în timp ce studiul nostru a arătat că nivelurile crescute de pERK au revenit la nivelul bazal în jurul acestui punct de timp (15 minute după reexpunere). În plus, este important de menționat că sarcina IA permite observarea îmbunătățirii memoriei IA prin reconsolidare, ceea ce duce la descoperirea noastră că inhibarea ERK în faza de tranziție dezinhibează îmbunătățirea memoriei IA.

Studiile anterioare au arătat că fosforilarea ERK este crescută în regiunea bazolaterală a amigdalei la 20-60 de minute, după învățarea de extincție a memoriei fricii (Herry și colab., 2006; Merlo și colab., 2014, 2018), în timp ce hipocampul arată această activare la 1 oră după extincția învățării memoriei fricii contextuale (Fischer și colab., 2007; Tronson și colab., 2009). În studiul de față, am obținut observații similare că pERK este crescut la 30 de minute după sesiunea de reactivare în faza de extincție. Aceste descoperiri sugerează că fosforilarea ERK este o semnătură moleculară comună a fazei de extincție târzie (20-60 min).

Mai mult, am observat că activarea ERK are loc bifazic la momentele timpurii și târzii (5 și 30 min) după sesiunea de reactivare în faza de extincție, în timp ce această activare are loc monofazic la momentul timpuriu în faza de reconsolidare (Fig. 5). . În mod constant, inhibarea ERK în regiunile creierului în aceste momente ale fazelor de reconsolidare și extincție a blocat reconsolidarea / îmbunătățirea și, respectiv, extincția pe termen lung (Fig. 6A, C-H). Aceste observații sugerează că activarea ERK monofazică și bifazică este necesară pentru îmbunătățirea mediată de reconsolidare și respectiv stingerea memoriei IA. Este important de menționat că ERK funcționează ca un regulator în amonte al fosforilării CREB. Prin urmare, activarea tranzitorie a ERK în faza de memorie timpurie poate, cel puțin parțial, să contribuie la această fosforilare a CREB, care activează expresia genelor necesare reconsolidării și extincției pe termen lung.

Similar cu descoperirile noastre anterioare folosind condiționarea fricii contextuale (Mamiya și colab., 2009), CREB a fost activat în fazele de memorare de reconsolidare (amigdala/hipocampus/mPFC) și extincție (amigdala/mPFC), în timp ce ERK a fost activat doar în faza de extincție. la 30 min după şedinţa de reactivare. În mod constant, doar o singură populație de neuroni pCREB1/pERK– a fost observată în faza de reconsolidare, în timp ce populații de neuroni distincte au fost observate în faza de extincție: neuroni pCREB1/pERK– și pCREB1/pERK1 în amigdală (Fig. 2); neuronii pCREB– /pERK1 din hipocamp (Fig. 3); și neuronii pCREB1/pERK–, pCREB– /pERK1 și pCREB1/pERK1 în mPFC (Fig. 4). Aceste observații, în special observația contrastantă a neuronilor pCREB–/pERK1 și pCREB1/pERK–, sugerează că activarea CREB și ERK este reglată diferit în fiecare zonă a creierului atunci când memoria este stinsă și că activarea în fază târzie a ERK joacă un rol specific și distinct. roluri pentru stingerea memoriei fricii în comparație cu alte procese de memorie, cum ar fi consolidarea și reconsolidarea, așa cum se discută mai jos. Interesant, am observat că neuronii pERK1 au fost mai abundenți în mPFC în comparație cu hipocamp și amigdală, deoarece mPFC a arătat un raport mai mare de neuroni pERK1 (faza de extincție) și neuroni pCREB1 (faza de reconsolidare) în comparație cu hipocamp și amigdală, ceea ce sugerează că activarea ERK în mPFC joacă un rol mai specific în dispariția memoriei.

Rămâne neclar dacă aceleași populații de neuroni sau diferite sunt activate în fazele de memorie de reconsolidare, tranziție și extincție. Un studiu anterior a identificat activarea „neuronilor fricii” și a „neuronilor de extincție” în amigdală atunci când memoria de frică este reactivată sau respectiv stinsă (Herry și colab., 2008). Prin urmare, este posibil ca ERK și CREB să fie activate în diferitele populații de neuroni cu profiluri temporale diferite (adică „neuroni de reconsolidare” și neuroni de extincție). După cum sa discutat mai sus, neuronii pCREB1, inclusiv neuronii pCREB1/pERK1, pot regla reconsolidarea și extincția pe termen lung a memoriei IA prin activarea expresiei genelor ca neuroni de reconsolidare și, respectiv, de extincție. În schimb, activarea ERK în neuronii pCREB–/pERK1 poate contribui la anularea activării transcripționale mediate de CREB care ar fi necesară pentru reconsolidare, deoarece această activare ERK este observată în mod specific în faza târzie de extincție; ERK s-a activat în neuronii de reconsolidare pentru a anula activarea expresiei genelor în faza de extincție. Interesant, un studiu anterior a arătat că activarea hipocampului ERK blochează inducerea c-fos atunci când memoria fricii contextuale este stinsă (Guedea et al., 2011), ridicând posibilitatea ca această activare ERK să antagonizeze calea de semnalizare CREB. Este important să se identifice populațiile neuronale care reglează reconsolidarea, tranziția și extincția și să se investigheze semnăturile moleculare și semnificația funcțională a acelor neuroni. În plus, interacțiunile dintre populațiile neuronale identificate în acest studiu rămân necunoscute. Este posibil ca „neuronii de extincție (de tranziție)” să moduleze funcția neuronilor de reconsolidare pentru a anula prevenirea reconsolidării prin interacțiuni între ei (Eisenberg și colab., 2003; Merlo și colab., 2014). Prin urmare, este, de asemenea, important să se examineze aceste interacțiuni în și între amigdală, mPFC și hipocamp.

Anterior, am arătat că hipocampul nu prezintă nicio modificare a fosforilării CREB și a expresiei Arc după extincția învățării fricii contextuale și, în mod constant, inhibarea sintezei proteinelor în hipocamp în faza de extincție nu reușește să blocheze extincția pe termen lung (Mamiya și colab. , 2009). Aceste observații au ridicat posibilitatea ca hipocampul să nu fie necesar pentru extincția pe termen lung. Cu toate acestea, am arătat că ERK este activat în hipocamp după extincția învățării memoriei IA și, în mod constant, blocarea activării ERK în hipocamp afectează extincția pe termen lung. Prin urmare, observațiile noastre actuale indică roluri esențiale ale hipocampului în dispariția memoriei. Luat împreună cu descoperirile noastre anterioare, sugerăm că hipocampul este necesar pentru dispariția memoriei, dar nu pentru un proces asemănător consolidării pentru a stabiliza o „memorie de extincție” prin activarea expresiei genelor.