Reactivitatea funcțională a celulelor T de memorie de la pacienții cu COVID-19
Mar 16, 2022
pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com
Ece Tavukcuoglua,, Utku Horzum1 a,, Ahmet Cagkan Inkaya1 , Serhat Unal ,bb Gunes Esendaglia, *
un Departament de Oncologie de bază, Institutul de Cancer al Universității Hacettepe, Ankara, Turcia
b Departamentul de Boli Infecțioase, Facultatea de Medicină, Universitatea Hacettepe, Ankara, Turcia
Cuvinte cheie: SARS-CoV-2 CentralmemorieCelule T, efectoarememorieCelule T, glicoproteină Spike S1 Celulă dendritică Celule T helper Limfocite T citotoxice
ABSTRACT: Prezenta luimemorieCelulele T la pacienții cu COVID-19 a fost recunoscută, însă potența funcțională amemorierăspunsurile sunt esențiale pentru protecție. În acest studiu, naiv, efector, memoria efector și centralmemorieCelulele T CD4 plus și CD8 plus obținute de la supraviețuitorii COVID-19 au fost reexpuse la DC autologe derivate din monocite care au fost încărcate cu glicoproteina S1 cu vârf SARS-CoV-2. Capacitate de proliferare, CD25, 4-1BB și PD-1
expresia și secreția de IFN-, IL-6, granzimă, granulizină și FasL au fost îmbunătățite în efectorul CD4 plus și CD8 plusmemorieși centralămemoriecelulele T. Deși fiind la niveluri eterogene, celmemorieCelulele T de la indivizii cu antecedente COVID-19 posedă capacități funcționale de revigorare a imunității antivirale împotriva SARS-CoV-2.
Apasa peCistanche deserticola ma pentru imbunatatirea memoriei
1. Introducere
În ciuda datelor emergente despre boala coronavirus 2019 (COVID-19), răspunsul imun la sindromul respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2) rămâne mai bine definit. Puterea și durata răspunsurilor umorale și celulare împotriva SARS-CoV-2 au fost asociate cu anticorpi neutralizanți șimemoriecelule T [1,2]. În special, glicoproteina-S1 are o imunodominanță semnificativă, deoarece anticorpii neutralizanți îi blochează atașarea la enzima de conversie a angiotensinei 2 (ACE2) și împiedică intrarea virală [3]. În plus, aproximativ 50% dintre pacienți au prezentat răspunsuri specifice celulelor T S1-[4,5].
Cu toate acestea, eterogenitatea observată în rândul cazurilor de COVID-19 are un efect confuz. În timp ce majoritatea pacienților dezvoltă imunitate antivirală, chiar și persoanele convalescente pot să nu fie protejate de reinfecție, care se datorează potențial amplitudinii și/sau stabilității insuficiente a celulelor T și producției de anticorpi [6-8]. În mod intrigant, în infecțiile severe cu SARS-CoV-2, interacțiunea dintre CD4 plus celulele T helper (Th) și celulele B este tocită în centrul germinal, ceea ce poate atenua longevitatea răspunsurilor anticorpilor [9]. Împreună cu activitățile Th, robustețea celulelor T CD8 plus citotoxice este, de asemenea, esențială pentru o imunitate anti-virală de succes [10]. Anterior, prezența CD4 plus sau CD8 plusmemorieCelulele T au fost raportate în COVID-19, cu toate acestea, capacitățile funcționale ale acestor celule trebuie abordate temeinic [11-13]. În acest studiu, reacția funcțională a naiv, efector, centralmemorie, și celulele T CD4 plus sau CD8 plus cu memorie efectoră, care au fost obținute de la pacienții cu antecedente COVID-19, împotriva celulelor dendritice derivate din monocite (DC) purtătoare de antigen SARS-CoV{-2 S1.
2. Material și metode
2.1. Pacienți și recoltare de probe
La două momente diferite, probe de sânge periferic au fost recoltate proaspăt de la pacienții recuperați de COVID-19 (Tabelul 1) și celulele mononucleare din sângele periferic au fost separate printr-un gradient de densitate Ficoll de 1,077 g/mL (Sigma-Aldrich). Toate protocoalele au fost aprobate de comitetele locale de etică și de Ministerul Sănătății din Republica Turcia. a fost obținut consimțământul informat de la pacienți. Pacienții cu test RT-PCR pozitiv și/sau seropozitivitate au fost înrolați în studiu. Simptomele clinice au fost clasificate ca ușoare (pacienții nespitalizați), moderate (pacienții care au avut pneumonie moderată) și severe (pacienții care au avut pneumonie severă și au fost internați mai mult de 5 zile). Au fost utilizate ca martori probe de sânge de la donatori sănătoși [n=10 (6 femei, 4 bărbați), vârsta medie 33 (min 28–max 55)] fără antecedente SARS-CoV-2 și seropozitivitate.
2.2. Stabilirea coculturii de celule DC și T derivate din monocite
DC au fost generate din monocite (CD14 MACS, Miltenyi) conform unui protocol publicat anterior [14]. Încărcarea antigenului cu proteina recombinantă S1 (S1; 10 µg/mL, Abcam) sau antigenul HIV Gag (10 µg/mL, Centrul de Cercetare TUBITAK Marmara) [15] sau toxoidul tetanic (TT; 10 µg/mL, Turk Ilac) ) a fost inițiată simultan cu maturarea DC-urilor derivate din monocite cu LPS (1 pg/mL, Sigma-Aldrich). DC mature derivate din monocite generate în absența a
antigenul specific a fost utilizat ca martori. La sfârșitul unei 7-incubări de o zi, DC-urile derivate din monocite au fost caracterizate ca o populație CD11bhiCD14loCD1a plus CD83 plus.
De la același pacient COVID-19, autolog naiv T (TN), efector diferențiat terminal (TEMRA), centralmemorieT (TCM) și efectormemorieCelulele T (TEM) au fost purificate (mai mare sau egal cu 96 la sută) de FACS (FACSAria II; Becton Dickinson) ca limfocite CD3-neatinse, CD19- și CD56- negative, conform la expresia diferențială a markerilor CD45RA, CD45RO și CCR7 (Fig. 1A).
DC-urile derivate din monocite (5x104) au fost co-cultivate cu subtipurile purificate de celule T (10)5 timp de 96 de ore într-un godeu cu fund rotund 96-godeu care conține 200 µL mediu RPMI 1640 completat cu 10% FBS , 1 procente penicilină/streptomicină (Industrii biologice), 5 ng/mL IL-2 (Bio-
Legendă). Înainte de co-cultură, subtipurile de celule T au fost etichetate cu 5 pM CFSE (BioLegend). Ca control pozitiv, un anticorp anti-CD3 (HIT3a, 25 ng/mL; BioLegend) a fost adăugat în co-culturi. Configurația experimentală este rezumată în Fig. 1A.
2.3. Imunofenotiparea și testele legate de funcție prin citometrie în flux
Imunofenotiparea a fost efectuată cu anticorpi monoclonali anti-uman-CD4 (OKT4), -CD8 (RPA-T8), -CD56 (MEM-188), -CD19 (SJ25C1), -CD45RA (HI100), -CD45RO (UCHL1). ), -CCR7 (G043H7), -CD25 (M-A251), -CD38 (HIT2), -4-1BB (4B{4-1), -PD-1 (NAT105), -CD14 (M5E2), -CD11b (ICRF44) (BioLegend); -CD1a (REA736), -CD83 (REA714) (Miltenyi). Valorile intensității mediane a fluorescenței (MFI) au fost determinate pe celulele T CD4 plus și CD8 plus și în conformitate cu diluția CFSE.
Modificarea IMF a fost calculată prin compararea datelor din co-culturi cu DC-urile încărcate cu antigen și DC-urile de control.
Procentul de celule T cu diluție CFSE a fost evaluat pentru proliferare. Capacitatea de proliferare specifică antigenului a celulelor T a fost calculată ca modificare a proliferării în care datele din coculturi cu DC-uri derivate din monocite de control au fost utilizate ca normalizatori. Supernatanții colectați au fost utilizați într-un ELISA multiplex (LEGEND-plex, BioLegend). Toate analizele citometrice în flux au fost efectuate pe un sortator FACSAria II.
2.4. analize statistice
Rezultatele sunt prezentate ca mediană ± SEM. Testul Kruskal-Wallis și corecția Bonferroni au fost utilizate pentru analizele statistice. Valoarea AP<0.05 was="" considered="" statistically="">
3. Rezultate
După incubarea cu S{{0}DC, a fost identificat un mic procent de celule T proliferante (interval procente , CD4 plus , TN {{1{0}}.49–6,8, TEMRA 3.29–7.7, TCM 0.38–2{0.2, TEM 0.2– 16.7; interval procente , CD8 plus , TN 0.64–5.6, TEMRA 2.16– 10.3, TCM0.8– 15, TEM 1.6– 19.4). Atât celulele CD4 plus, cât și CD8 plus TCM și TEM au prezentat o frecvență de proliferare considerabil crescută decât populațiile de celule T naive sau efectoare (Fig. 1B). Celulele CD4 plus TCM și celulele CD8 plus TEM au prezentat cea mai mare activitate proliferativă. CD4 plusmemorieProliferarea celulelor T ar putea fi indusă la aproximativ 90% dintre pacienții cu COVID-19, totuși, CD8 plusmemorieProliferarea celulelor T a fost evidențiată doar la ~ 60% dintre pacienți (Fig. 1B). DC-urile derivate din monocite au fost, de asemenea, încărcate cu un antigen viral irelevant, HIV Gag; de așteptat, nu a fost obținut niciun răspuns semnificativ în celulele T de la supraviețuitorii COVID-19 (Fig. 1C). În mod similar, celulele T de la indivizii sănătoși nu au răspuns la S1-DC. Pe de altă parte, DC-ul derivat din monocite care prezintă antigenul TT a servit drept control pozitiv pentru celulele Tmemorierăspunsuri (Fig. 1C). În plus, expresia de suprafață a anumitor markeri legați de activare, în special CD25, PD-1 și 4-1BB, a fost semnificativ upregulată pe celulele T care răspund la S1- (Fig. 1D). Celulele TEM stimulate de S1-DC au secretat cele mai înalte niveluri de IFN- și IL-6, care sunt în mare parte produse de celulele T CD4 plus de tip 1 și celulele T CD8 plus citotoxice. Markerii răspunsului citotoxic, granzima A, granulizină, ligand Fas (FasL) și în special granzima B au fost, de asemenea, crescuți în co-culturile care adăpostesc celule TEM de la pacienții cu COVID-19 (Fig. 1E). Supernatanții de cocultură din care au fost măsurați factorii solubili au conținut mediatorii secretați de celulele T și DC; astfel, așa cum se menționează în literatură, cantități moderate de citokine, cum ar fi TNF-, IL-6, IL{-4 și IFN- pot fi, de asemenea, produse de DC [16,17]. În unele cazuri, celulele T fără memorie au răspuns la S1-DC, au reglat în sens pozitiv expresia CD38 și 4-1BB și secreția de IL-4 și TNF- (Fig. 1) . Sa observat, de asemenea, eterogenitate între parametrii celulelor T studiați și timpul prelevării de sânge după recuperare, severitatea simptomelor clinice sau nivelul anticorpilor anti-S1 (datele nu sunt prezentate).
4. Discutie
La supraviețuitorii COVID-19, celulele circulante TEM și TCM specifice S1-și-au păstrat capacitatea de răspuns funcțională și au afișat capacități efectoare crescute, cum ar fi activarea, proliferarea și secreția de mediatori imuni. Chiar dacă răspunsul proliferativ înmemorieCelulele T CD8 plus nu au fost la fel de puternice ca în CD4 plusmemorieCelulele T, datele noastre sugerează că aceste celule pot avansa rapid la o stare efectoră atunci când sunt expuse la antigenul SARS-CoV-2 S1. Celulele TEM sunt gardieni critici, deoarece au tendința de a se localiza în țesuturile predispuse la invazia de către microorganismul patogen, în timp ce celulele TCM sunt recrutate în organele limfoide secundare pentru accelerarea reacțiilor imune inaugurate de DC-urile prezentatoare de antigen [18]. Deși acoperă un număr limitat de cazuri de COVID-19, în studiul nostru, majoritatea pacienților au găzduit celule TEM și TCM care au răspuns funcțional la proteina S1 în ceea ce privește cel puțin un parametru testat. Aceste constatări preliminare pot indica o diferență probabilă între competența funcțională a celulelor T și severitatea COVID-19. Un studiu anterior a raportat o frecvență mai mare a celulelor T specifice S1- decât a celulelor T specifice pentru proteinele N și M [8]. În mod corespunzător, răspunsul funcțional al celulelor T la alte antigene SARS-CoV-2 rămâne mai bine elucidată. Lucrările fundamentale publicate recent au demonstrat prezența pe termen lungmemorieîn celulele T de la pacienții cu COVID-19 [19,20]. Folosind o abordare experimentală distinctă, în care DC-urile autologe derivate din monocite au fost utilizate ca element fezabil pentru testarea răspunsului celulelor T, studiul nostru a confirmat funcția și caracterul celulelor T menționate anterior la indivizii cu antecedente COVID-19. Acumularea de dovezi privind imunitatea stabilită la supraviețuitorii COVID-19 ar oferi o mai bună înțelegere a patogenezei bolii, a abordărilor terapeutice și a dezvoltării vaccinurilor.
Fig. 1. Evaluarea răspunsurilor funcționale în celulele T de la supraviețuitorii COVID-19. A) Este prezentată schița grafică a configurației experimentale. Celulele dendritice derivate din monocite au fost generate de la indivizii cu antecedente COVID-19 și încărcate cu SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein-S1 (S{1-DC); apoi, autolog naiv T (TN), efector diferențiat terminal (TEMRA), centralmemorieT (TCM) și efectormemorieCelulele T (TEM) au fost purificate și co-cultivate cu aceste DC. Proliferarea celulelor T, expresia markerilor de activare și secreția de citokine au fost măsurate după 96 de ore de incubare. B) Modificarea proliferării celulelor T CD4 plus și CD8 plus a fost reprezentată grafic pentru fiecare pacient în comparație cu cea obținută cu co-culturi martor cu DC-uri derivate din monocite fără încărcare specifică de antigen. Histogramele reprezentative ale citometriei în flux sunt date în partea dreaptă. Co-culturile stimulate cu un anticorp monoclonal anti-CD3 au servit ca un control tehnic pozitiv pentru proliferarea celulelor T. C) Răspunsul de proliferare a celulelor TCM și TEM derivat de la pacient împotriva S{{1{{20}}}}DC a fost comparat cu cele obținute cu HIV Gag sau cu antigenul toxoid tetanic (TT) -DC încărcate. Celulele T și S1-DC-urile obținute de la indivizi sănătoși (S1(hd)) au fost, de asemenea, folosite ca martori. D) S-au arătat modificări ale nivelurilor markerilor de activare a celulelor T CD4 plus și CD8 plus în comparație cu cele obținute cu co-culturi martor cu DC-uri derivate din monocite fără încărcare specifică de antigen. E) S-a evaluat cantitatea de citokine asociate celulelor T secretate în supernatanții de cocultură. (*p < 0,05,="" **p=""><>
Declarație de contribuție a autorului CRedit
Ece Tavukcuoglu: Investigație, Vizualizare, Analiză formală, Scriere - revizuire și editare. Utku Horzum: investigație, vizualizare, analiză formală, scriere - revizuire și editare. Ahmet Cagkan Inkaya: Conceptualizare, Resurse. Serhat Unal: Conceptualizare, Resurse. Gunes Esendagli: Conceptualizare, Scriere - revizuire și editare, Supraveghere.
Declarație de interese concurente
Autorii declară că nu au interese financiare concurente cunoscute sau relații personale care ar fi putut părea să influențeze munca raportată în această lucrare.
Referințe
[1] A. Mazzoni, L. Maggi, M. Capone, M. Spinicci, L. Salvati, MG Colao, A. Vanni, ST Kiros, J. Mencarini, L. Zammarchi, E. Mantengoli, L. Menicacci, E Caldini, S. Romagnani, F. Liotta, A. Morettini, GM Rossolini, A. Bartoloni, L. Cosmi, F. Annunziato, Răspunsurile imune adaptative mediate celular și umoral la SARS-CoV-2 sunt mai mici în pacienți asimptomatici decât cei simptomatici COVID-19, EUR. J. Immunol. 50 (2020) 2013–2024.
[2] Y. Tan, F. Liu, X. Xu, Y. Ling, W. Huang, Z. Zhu, M. Guo, Y. Lin, Z. Fu, D. Liang,T. Zhang, J. Fan, M. Xu, H. Lu, S. Chen, Durabilitatea anticorpilor neutralizanți și răspunsul celulelor T post-infecția cu SARS-CoV-2, Front. Med. 14 (2020) 746–751.
[3] C. Conte, F. Sogni, P. Affanni, L. Veronesi, A. Argentiero, S. Esposito, Vaccines against coronaviruses: The State of the Art, Vaccines (Basel) 8 (2020).
[4] CK Li, H. Wu, H. Yan, S. Ma, L. Wang, M. Zhang, X. Tang, NJ Temperton, RA Weiss, JM Brenchley, DC Douek, J. Mongkolsapaya, BH Tran, CL Lin, GR Screaton, JL Hou, AJ McMichael, XN Xu, răspunsurile celulelor T la întregul coronavirus SARS la om, J. Immunol. 181 (2008) 5490–5500.
[5] M. Koblischke, MT Traugott, I. Medits, FS Spitzer, A. Zoufaly, L. Weseslindtner, C. Simonitsch, T. Seitz, W. Hoepler, E. Puchhammer-Stockl, SW Aberle, M. Fodinger, A. Bergthaler, M. Kundi, FX Heinz, K. Stiasny, JH Aberle, Dynamics of CD4 T cell and anticorps responses in Pacienți cu COVID-19 cu gravitate diferită a bolii, Front. Med. (Lausanne) 7 (2020), 592629.
[6] GA Poland, IG Ovsyannikova, RB Kennedy, SARS-CoV-2 immunity: review and applications to phase 3 vaccin candidates, Lancet 396 (2020) 1595–1606.
[7] R. Zhou, KK To, YC Wong, L. Liu, B. Zhou, X. Li, H. Huang, Y. Mo, TY Luk, TT Lau, P. Yeung, WM Chan, AK Wu, KC Lung, OT Tsang, WS Leung, IF Hung, KY Yuen, Z. Chen, Infecția acută cu SARS-CoV-2 afectează răspunsurile celulelor dendritice și ale celulelor T, Immunity 53 (2020) 864–877 e{ {7}}.
[8] A. Grifoni, D. Weiskopf, SI Ramirez, J. Mateus, JM Dan, CR Moderbacher, SARawlings, A. Sutherland, L. Premkumar, RS Jadi, D. Marrama, AM de Silva, A. Frazier, AF Carlin, JA Greenbaum, B. Peters, F. Krammer, DM Smith, S. Crotty, A. Sette, Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals, Cell, 181 (2020) 1489-1501 e1415.
[9] PF Canete, CG Vinuesa, COVID-19 face ca celulele B să uite, dar celulele T își amintesc, Celula 183 (2020) 13–15.
[10] I. Schulien, J. Kemming, V. Oberhardt, K. Wild, LM Seidel, S. Killmer, F. Sagar, MS Daul, A. Lago, H. Decker, B. Luxenburger, D. Binder, O Bettinger, S. Sogukpinar, M. Rieg, D. Panning, M. Huzly, G. Schwemmle, CF Kochs, A. Waller, D. Nieters, F. Duerschmied, HE Emmerich, AR Mei, S. Schulz, DA Llewellyn -Lacey, T. Price, B. Boettler, R. Bengsch, M. Thimme, C.-H. Hofmann, Caracterizarea celulelor T CD8( plus) specifice SARS-CoV-2-preexistente și induse, Nat. Med. 27 (2021) 78–85.
[11] I. Odak, J. Barros-Martins, B. Bosnjak, K. Stahl, S. David, O. Wiesner, M. Busch, M.
M. Hoeper, I. Pink, T. Welte, M. Cornberg, M. Stoll, L. Goudeva, R. Blasczyk, A. Ganser, I. Prinz, R. Forster, C. Koenecke, CR Schultze-Florey, Reapariție a celulelor T efectoare este asociată cu recuperarea din COVID-19, EBioMedicine 57 (2020), 102885.
[12] AE Oja, A. Saris, CA Ghandour, NAM Kragten, BM Hogema, EJ Nossent, LMA Heunks, S. Cuvalay, E. Slot, F. Linty, FH Swaneveld, H. Vrielink, G. Vidarsson, T. Rispens, E. van der Schoot, RAW van Lier, A. Ten Brinke, P. Hombrink, Răspunsuri specifice ale celulelor T și B specifice SARS-CoV-2-divergente la pacienții cu COVID-19 severe, dar nu ușoare , EURO. J. Immunol. 50 (2020) 1998–2012.
[13] B. Kratzer, D. Trapin, P. Ettel, U. Kormoczi, A. Rottal, F. Tuppy, M. Feichter,P. Gattinger, K. Borochova, Y. Dorofeeva, I. Tulaeva, M. Weber, K. Grabmeier- Pfistershammer, PA Tauber, M. Gerdov, B. Muhl, T. Perkmann, I. Fae, S. Wenda, H. Fuhrer , R. Henning, R. Valenta, WF Pickl, Amprenta imunologică a COVID-19 asupra populațiilor de leucocite din sângele periferic uman, Allergy (2020).
[14] AM Bruger, C. Vanhaver, K. Bruderek, G. Amodio, E. Tavukcuoglu, G. Esendagli,S. Gregori, S. Brandau, P. van der Bruggen, Protocol pentru a evalua suprimarea proliferării celulelor T de către MDSC uman, Metode Enzymol. 632 (2020) 155–192.
[15] SA Younes, B. Yassine-Diab, AR Dumont, MR Boulassel, Z. Grossman, JP Routy, RP Sekaly, HIV-1 viremia previne stabilirea interleukinei 2- producătoare de HIV specificămemorieCelule CD4 plus T dotate cu capacitate proliferativă, J. Exp. Med. 198 (2003) 1909–1922.
[16] DM Frucht, T. Fukao, C. Bogdan, H. Schindler, JJ O'Shea, S. Koyasu, Producția de IFN-gamma de către celulele prezentatoare de antigen: apar mecanisme, Trends Immunol. 22 (2001) 556–560.
[17] EO Gubernatorova, EA Gorshkova, OA Namakanova, RV Zvartsev, J. Hidalgo, MS Drutskaya, AV Tumanov, SA Nedospasov, Funcții non-redundante ale IL-6 produse de macrofage și celule dendritice în inflamația alergică a căilor respiratorii, Față. Imunol. 9 (2018) 2718.
[18] YD Mahnke, TM Brodie, F. Sallusto, M. Roederer, E. Lugli, The who's who of T-cell differentiation: humanmemorieSubseturi de celule T, Eur. J. Immunol. 43 (2013) 2797–2809.
[19] JM Dan, J. Mateus, Y. Kato, KM Hastie, ED Yu, CE Faliti, A. Grifoni, SI Ramirez, S. Haupt, A. Frazier, C. Nakao, V. Rayaprolu, SA Rawlings, B Peters, F. Krammer, V. Simon, EO Saphire, DM Smith, D. Weiskopf, A. Sette, S. Crotty, Imunologicmemoriela SARS-CoV-2 evaluat timp de până la 8 luni după infecție, Science 371 (2021).
[20] LB Rodda, J. Netland, L. Shehata, KB Pruner, PA Morawski, CD Thouvenel, KK Takehara, J. Eggenberger, EA Hemann, HR Waterman, ML Fahning, Y. Chen,M. Hale, J. Rathe, C. Stokes, S. Wrenn, B. Fiala, L. Carter, JA Hamerman, NP King, M. Gale, Jr., DJ Campbell, DJ Rawlings, M. Pepper, Functional SARS-CoV{ {2}}imunitar specificmemoriepersistă după ușoară COVID-19, Cell, 184 (2021) 169-183 e117.
