Efectul avantajos/nefavorabil al quercetinei asupra membranelor celulelor de neuroblastom SK-N-SH Partea 2

Vă rugăm să faceți clicoscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

2.2.2. Activitatea antioxidantă a quercetinei

Pentru a testa eficacitatea quercetinei în protejarea membranelor împotriva stresului oxidativ, au fost efectuate experimente în care modelele lipidice ale membranei au fost expuse la ozon în absența (Figura 4a) și prezența quercetinei la o concentrație de 6,25 μM (Figura 4b).

Sub influența ozonului, cursul ambelor dependențe, adică π{{0}}f(A) și Cs-1=f(rn)se modifică. Izotermele obținute pentru împrăștierea monostratului pe subfaza care conține ozon s-au caracterizat printr-o pantă mai mică și o deplasare către valori A mai mici. Mai mult, valorile Cs-1 au scăzut sub influența ozonului. Aceste modificări au fost cele mai mari la o concentrație de ozon de aproximativ 0,4 ppm.cintancheO creștere suplimentară a concentrației de ozon nu a crescut modificările caracteristicilor monostratului (Figura 4a inset).

Figura 4. Izotermele presiunii de suprafață și modulul de compresibilitate corespunzător (inserția) al modelului lipidic al straturilor de neuroblastom răspândite pe subfază conțineau concentrațiile indicate de ozon dizolvat în tampon. Izoterme: (a) în absența antioxidanților; (b) în prezența quercetinei (6,25 μM) adăugată la tamponul care conține ozon.

Când quercetina la o concentrație de 6,25 μM a fost introdusă în subfază, ozonul nu a afectat în mod semnificativ cursul izotermei r(A); cu toate acestea, valorile modulului de compresie s-au modificat în prezența ozonului în mod similar ca în cazul absenței quercetinei (Figura 4b intercalat).

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Valorile numerice ale parametrilor care caracterizează monostraturile determinate pe baza izotermelor obţinute sunt prezentate în Tabelul 3.

Tabelul 3. Parametrii de suprafață ai monostraturilor Alim și Cs-I calculați pentru monostraturile modelului de membrană de neuroblastom răspândit pe subfază conținea concentrațiile indicate de ozon dizolvat în tampon în absența și în prezența quercetinei (6,25 uM). Datele reprezintă media din trei experimente ± SD. Litere diferite indică diferențe semnificative (p Mai mic sau egal cu 0.05).

În prezența ozonului, se observă o ușoară reducere a suprafeței per moleculă (Alim) în monostratul dens ambalat. Reducerea maximă a acestui parametru este de 3,2 procente comparativ cu controlul (monostrat pe tamponul pur). Parametrul Cs-I este de asemenea redus, atingând valori de platou la concentrații de ozon peste 0.6 ppm O. Reducerea maximă a acestui parametru ajunge la 24 la sută în raport cu controlul.

Când quercetina la o concentrație de 6,25 uM este prezentă în subfază, valorile Alim (1-2 procente) scad ușor, în timp ce reducerea valorii Cs-1 este de aproximativ 27 la sută.

Natura modificărilor Alim în prezența ozonului și a ozonului în combinație cu quercetina au cursuri diferite. La o concentrație de ozon de aproximativ 0,3 ppm, în absența quercetinei, obiectivul scade brusc la aproximativ 88,3 A2. Apoi atinge valoarea minimă de platou dând dependență caracteristică în formă de S (Figura 5a, puncte roșii). În prezența quercetinei, există o ușoară scădere lină monotonă a Alim, atingând o concentrație mai mare de ozon un platou de aproximativ 93,5 A2 (Figura 5a, puncte verzi).

Figura 5. Dependența ariei per moleculă de concentrația de ozon (a) și dependența modulului de compresie de concentrația de ozon (b) pentru membrana neuroblastomului pe subfaza: Fără puncte roșii de quercetină; cu puncte verzi de quercetină. Liniile nu prezintă niciun model fizic, au fost adaptate matematic și au fost desenate pentru confortul urmăririi modificărilor parametrilor. Valorile maxime ale modulului de compresie ale stratului se modifică în mod similar cu concentrația de ozon pentru ambele: În absența și prezența quercetinei (Figura 5b).

3. Discuție

Mecanismul de acțiune al quercetinei a fost studiat intens de mulți ani, dar rezultatele experimentelor sunt adesea contradictorii și indică faptul că, în unele circumstanțe, acest compus este benefic, iar în altele, nefavorabil pentru celule. Analiza studiilor disponibile arată că efectul acestui compus asupra celulelor este legat de două aspecte, și anume, interacțiunea sa cu membranele și activitatea antioxidantă. Cu toate acestea, în celule, nu este posibil să se distingă aceste două moduri de acțiune a quercetinei și evaluarea adecvării acestui compus ca substanță potențială, de exemplu, având activitate antitumorală. Din acest motiv, experimentele au fost planificate astfel încât să se evalueze calitativ și cantitativ influența acestui compus asupra proprietăților mecanice ale membranelor, precum și activitatea sa antioxidantă în sistemul model, care elimină efectele activitatea altor căi metabolice.

Pe baza experimentelor efectuate, s-a confirmat că chiar și la cele mai mici concentrații (6,25 uM), quercetina modifică (după cum este indicat de creșterea Alimvalue) monostraturile modelului, mimând partea lipidică a membranei celulelor neuroblastomului. Ea indică o posibilitate de interacțiune a quercetinei cu membranele acestor celule atunci când ajunge la creier, chiar și la concentrații scăzute. Acest lucru este de o importanță deosebită pentru celulele nervoase ale căror membrane conțin cantități relativ mari de lipide.

Cistanche poate îmbunătăți imunitatea

Raportul aproximativ lipide-proteine ​​pentru celulele nervoase este de 80:20 la sută și, de exemplu, pentru membrana eritrocitară, acest raport este de 50:50 la sută [29]. Un astfel de nivel de lipide în membrana celulelor nervoase este legat de rolul acestor celule în transmiterea semnalelor electrice. În același timp, chiar și modificări subtile ale proprietăților fizico-chimice, cum ar fi flexibilitatea și rigiditatea membranei celulare, pot perturba semnificativ această funcție.

Potențialul de acțiune este transferat de-a lungul membranei celulei nervoase datorită activității canalelor ionice, iar apoi, datorită acțiunii pompelor ionice, potențialul de repaus este restabilit. Funcționarea corectă a acestor proteine ​​(în special, determinată de forma lor) este strâns dependentă de mediul lipidic. Mai mult, modificările proprietăților mecanice ale membranei pot perturba funcționarea canalelor al căror mecanism de deschidere depinde tocmai de proprietățile mecanice ale membranei.

Aceste teze sunt confirmate de studii care au arătat că efectul quercetinei asupra membranei celulare este legat, printre altele, de transportul ionilor de Ca2 plus și/sau metabolismul de Ca2 plus [30,31]. Astfel, introducerea moleculelor de quercetină în mediul membranei (în special a celulelor nervoase) poate avea consecințe semnificative asupra funcționării acestora.

Pentru a verifica dacă acțiunea quercetinei determinată în sistemele model joacă un rol benefic sau nefavorabil în celule, rezultatele obținute pentru membranele model au fost comparate cu efectul acestui compus asupra celulelor întregi de neuroblastom. Pentru celulele SK-N-SH, a fost efectuat testul MTT,Extract de Cistanche Anti Alzheimeroferind informații despre viabilitatea celulelor care, la rândul lor, este direct proporțională cu enzimele dehidrogenazei mitocondriale.

Rezultatele obţinute au arătat că prezenţa quercetinei la concentraţii de 100 şi 200 uM a crescut numărul de celule viabile. Rezultate similare au fost obținute de Bao și colab. [32], investigând efectul quercetinei asupra celulelor PC-12. Scurgerea LDH în mediul extracelular, care oferă informații despre perturbarea membranei celulare, a fost de asemenea examinată la aceleași niveluri de quercetină. Rezultatele obţinute au demonstrat că membranele celulelor testate nu au fost deteriorate în astfel de condiţii. Boots et al. [2], studiind efectele quercetinei asupra celulelor epiteliale pulmonare, au observat rezultate similare. Prin urmare, se poate concluziona că la aceste concentrații, quercetina are un efect pozitiv asupra celulelor, crescând Viabilitatea acestora.

Al doilea aspect important al mecanismului de acțiune a quercetinei este legat de proprietățile sale antioxidante. Pentru a evalua efectul asociat al polifenolului studiat, au fost efectuate experimente în care s-a verificat dacă quercetina joacă un rol protector în celulele expuse la stres oxidativ. Stresul oxidativ a fost generat prin introducerea H, O2 în mediul celular.Cistanche pentru îmbunătățirea memorieiDupă cum sa demonstrat în acest studiu, peroxidul de hidrogen provoacă o mortalitate celulară semnificativă, exprimată ca deteriorare a mitocondriilor.

Când celulele SK-N-SH au fost cultivate timp de 3 ore într-un mediu care conține 3 și 5 mM H2O2, viabilitatea celulelor a scăzut la aproximativ 44% din cea a celulelor netratate (test MTT). Studiile au arătat că pretratarea cu 24 de ore a celulelor cu quercetină determină o creștere a numărului de celule vii în raport cu celulele tratate cu H2O2. Suematsu și colab. [13] au raportat efecte similare.

De asemenea, am măsurat nivelul de MDA, care este un biomarker al stresului oxidativ ca produs final al peroxidării lipidelor[33]. Pretratarea celulelor cu concentrații mari de quercetină, urmată de adăugarea de peroxid de hidrogen, a dus la o ușoară creștere a conținutului de MDA în comparație cu celulele expuse doar la H2O. Acest lucru se poate datora faptului că quercetina (la concentrații mai mari) poate suferi, de asemenea, o activare oxido-reductivă și poate fi subiectul ciclului redox, generând specii de oxigen reactive intracelular [34].

Nu au existat modificări semnificative în distrugerea membranei (după cum este indicat de nivelul LDH neschimbat) a celulelor tratate cu quercetină și H2O2 în comparație cu cazul în care celulele au fost expuse doar la stres oxidativ. Prin urmare, se poate concluziona că, în ciuda creșterii peroxidării lipidelor (la concentrații mari de quercetină), aceasta nu a fost suficient de semnificativă pentru a distruge membranele și a perturba continuitatea acestora.

Observațiile obținute pentru sistemul nativ au fost confruntate cu cele primite pentru un sistem model în care este posibil să se controleze exact atât concentrația de quercetină, cât și nivelul de stres. S-a verificat modul în care partea lipidică a membranei neuroblastomului este rezistentă la stresul oxidativ. Condițiile de stres au fost create prin introducerea ozonului în tampon, în care mediul apei ozonul suferă reacții de descompunere formând radicali oxidativi, printre alții radicali hidroxil și radicali anioni superoxid [35]. Amestecul obținut de specii reactive de oxigen corespunde celor care apar în mod natural în celule, datorită dezechilibrului de perturbare a stării redox [36-38].

Sub influența stresului, forma izotermelor s-a schimbat, indicând o scădere semnificativă a suprafeței pe moleculă în monostratul dens. Astfel de modificări au avut loc datorită oxidării legăturilor nesaturate din lanțurile de acizi grași. Acest efect a crescut odată cu creșterea concentrației de ozon la aproximativ {{0}},3 ppm, iar apoi acest parametru de izotermă a rămas la același nivel în ciuda creșterii ROS. Aceasta înseamnă că la o concentrație de ozon de aproximativ 0,3 ppm, toți acizii grași nesaturați prezenți în monostrat au fost oxidați (în modelul neuroblastomului, cantitatea totală de acizi grași nesaturați a fost de 52 la sută).

Monostraturile oxidate au o rigiditate substanțială,cistanche în chinezăașa cum este reprezentat de valoarea Cs-1 (cu cât este mai mare valoarea acestui parametru, cu atât este mai mare rigiditatea stratului). În prezența quercetinei, chiar și la o concentrație scăzută (6,25 μM), modificările membranei expuse la ozon, vizualizate prin modificări ale valorii Alim, au fost semnificativ reduse (Figura 5a), ceea ce demonstrează activitatea antioxidantă a acestui compus. . Este de remarcat, totuși, că, deși quercetina a captat radicalii, protejând acizii grași nesaturați împotriva oxidării, nu a inversat modificările rigidității membranei (Figura 5b).

Astfel, s-a demonstrat că quercetina prezintă o acțiune antioxidantă, dar simpla ei prezență între moleculele lipidice influențează (determină) parametrii laverului, adică, în ciuda protecției lanțurilor de acizi grași împotriva oxidării, rigiditatea membranei a scăzut semnificativ (Cs- Eu prețuiesc cu aproximativ 25 la sută mai puțin față de control).

Aceste rezultate indică faptul că modificarea membranei este principalul factor în efectele celulare rezultate din prezența quercetinei. Cu toate acestea, consecințele acestei modificări (modificarea semnalizării, transportul) variază în funcție de numărul de molecule de polifenol, de compoziția inițială a membranei și de funcția celulei. Așa se explică de ce, în diferite circumstanțe și în diferite studii, quercetina prezintă un efect protector, în timp ce în altele este exact opusul.

Într-o situație de stres oxidativ ridicat, efectul antioxidant ajută celula prin protejarea componentelor acesteia împotriva deteriorării. Cu toate acestea, dacă membranele sunt modificate semnificativ prin localizarea acestui compus în mediul lor, rezultând distribuția căilor de semnalizare sau transport prin modificarea rigidității membranei, acest lucru poate duce la efecte nefavorabile. De asemenea, trebuie amintit că multe procese într-o celulă au loc simultan, atât cele legate de membrane, cât și cele care generează stres oxidativ. Efectul care poate fi observat și măsurat prin determinarea nivelului indicatorilor specifici este întotdeauna total. Prin urmare, există situații în care efectul quercetinei este perceput ca favorabil și nefavorabil.

4. Materiale și Metode

4.1.Materiale

Compoziția modelului părții lipidice a membranei celulelor neuroblastomului a fost stabilită pe baza lucrării autorilor [{0}}]. Fosfolipide: 1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicerol-3-fosfocolină;1-hexacosanoil-d{4-2-hidroxi-sn-glicerol-3-fosfocolină; 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolină; L- -fosfatidiletanolamină (creier); sfingomielină (creier)-(Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, SUA). Colesterolul a fost cumpărat (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania). Raportul dintre fosfolipide și colesterol a fost de 79 la sută până la 21 la sută. Raportul dintre acizii grași saturați și nesaturați a fost de 48% la 52%.

Solvenții (cloroform, etanol) de puritate chimică-Poch (Gliwice, Polonia); apă proaspăt deionizată produsă de HLP 5 Hydrolab (Straszyn, Polonia). Mediul de cultură, serul și antibioticele au fost achiziționate de la CytoGen GmbH. Reactivii chimici utilizați în experimente au fost obținuți de la Sigma Aldrich.

4.2.Cultura celulară

Linia celulară de neuroblastom uman SK-N-SH (Colecția europeană de culturi celulare autenticate (ECACC) a fost cultivată în ser fetal bovin (FBS) 10 procente în mediu de vultur modificat de la Dulbecco (DMEM), suplimentat cu 0,01 procente de penicilină -streptomicina la 37 de grade in atmosfera umezita, continand 5 la suta CO2.

4.3. Măsurarea viabilității celulare (testul MTT)

Celulele au fost însămânțate într-o placă de {{{0}}godeuri la o densitate de 1 x 104 celule per godeu într-un volum de 0,1 ml. Celulele au fost tratate timp de 24 de ore cu diferite concentrații de quercetină (3.75-200 μM). După acest timp, s-au adăugat peroxid de hidrogen 3 mM și 5 mM timp de 3 ore. Din cauza lipsei de diferențe între efectele Concentrații de HO2 la 3 și 5 μM, pentru studii statistice, acestea au fost tratate ca aceleași tratamente și descrise ca tratament cu 3-5 uM H2O2.

După 50μL MTT（3-【4,5-dimetiltiazol-2-il】-2,5 soluție de bromură de difenil tetrazoliu）(soluție stoc sterilă de 5 mg/mL) a fost adăugat la celule și incubat timp de 2 ore la 37 de grade într-o atmosferă umidificată cu 5% CO. Apoi, s-au adăugat 0,4 ml de dimetil sulfoxid (DMSO) în fiecare godeu și s-au păstrat timp de 10 minute. După centrifugare, densitatea optică a supernatantului a fost măsurată la 570 nm folosind un cititor de plăci de microlitri (BioTek Instruments, VT, SUA).

4.4. Testul de deteriorare a membranei (test LDH)

Testul lactat dehidrogenazei (LDH) a fost utilizat ca marker al întregii membranei celulare.

Celulele în cantitate de 1× 1{{10}}* celule per godeu au fost însămânțate într-o placă de 96-godeuri și incubate în prezența quercetinei （3.75-200 μM） timp de 24 h; Apoi, 3 mM și 5 mM H2O, au fost adăugate timp de 3 ore. La tuburile care conțin 0,5 mL de piruvat de sodiu 0,75 mM și 10 uL NADH (140 μM) (încălzite la 37°C timp de 10 minute), s-au adăugat 150 μL de supernatant și s-au incubat timp de 30 de minute la 37 de grade. Apoi s-au adăugat la probă 0,5 ml de 2,4-dinitrofenilhidrazină, iar după 1 oră absorbanța a fost măsurată la 450 nm.

4.5. Determinarea peroxidării lipidelor (concentrația de MDA)

Peroxidarea lipidelor membranei a fost estimată prin reacția acidului tiobarbituric (TBA) cu malondialdehida (MDA). Celulele au fost însămânțate în {{{0}}plăci de godeuri care conțineau quercetină și H,O2 (în concentrații și timpi descriși mai sus) în cantitate de 1×104 celule per godeu într-un volum de { {10}},25 ml. După tratament, probele au fost colectate și centrifugate (1000×&,5 min). La pelete, s-au adăugat 0,5 ml de 0,5% TCA, s-au agitat în vortex timp de 1 min, și s-au lizat prin sonicare timp de 5 min. După centrifugare la 10.000 xg timp de 10 minute, s-au adăugat 0,4 mL de supernatant la 1,25 mL 20% TCA cu 0,5% TBA și s-au încălzit într-un termobloc uscat (100 grade) timp de 30 de minute. După răcire, absorbanța a fost măsurată la 532 nm folosind coeficientul de extincție molar al MDA egal cu 155 M-1 cm-1.

4.6.Model Membrane

Ozonarea tampon. Tamponul fosfat (0,01 M, pH 7,4) a fost saturat cu ozon produs de generatorul de ozon FM 500 (Grekos, Polonia). Concentrația de ozon într-un tampon a fost determinată conform lui Bader și Hoigne [42].

Izoterme de presiune de suprafață.cresterea penisului cistancheJgheabul Langmuir (KSV, Finlanda) a fost utilizat pentru înregistrarea izotermei presiunii de suprafață la o rată constantă de compresie corespunzătoare unei viteze de barieră de 5 mm/min. Monostratul lipidic a fost format prin împrăștierea unei cantități definite de soluție de cloroform lipidic la concentrație de 1 mg/mL pe subfaza compusă din tampon fosfat apos 0,01 M, pH 7,4 cu sau fără quercetină și cu sau fără ozon. Tensiunile de suprafață au fost măsurate cu o placă Pt-Wilhelmy. Experimentele au fost efectuate la 25 de grade ± 1 grad.

4.7. Analize statistice

Au fost efectuate trei până la șase analize independente pentru fiecare variantă testată și au fost mediate (± SD). Diferențele semnificative față de controale au fost estimate prin exploatarea procedurii SAS ANOVA. Analiza statistică a fost efectuată prin testul cu intervale multiple al lui Duncan, luând p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Contribuții autor: Conceptualizare, BK, BD și ER-S.metodology, BKBD; software, BK, BDvalidation, BK, BD, ER-S., ABwriting—pregătirea schiței originale BK, BD, ER-S., scriere—revizuire și editare, BK, BD, ER-S., ABvisualization, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., ABAToți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțarea:Această cercetare nu a primit finanțare externă.

Declarația Comisiei de revizuire instituțională: Nu se aplică.

Declarație de consimțământ informat: Nu se aplică.

Declarație de disponibilitate a datelor: Datele sunt conținute în articol. Conflicte de interese: Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Acest articol este extras din Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules