Efectele hipoglicemiante și hipopolipidemice ale antocianinelor de afine prin activarea AMPK: studii in vitro și in vivo partea 1

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Abstract:Afinele sunt bogate în antocianine bioactive, cu un nivel ridicat de malvidină, care este asociată cu beneficii antioxidante care contribuie la reducerea riscului de diabet. Obiectivul acestui studiu a fost de a investiga efectele hipoglicemiante și hipolipidemice ale extractului de antociani de afine (BAE),malvidină(Mv), malvidin-3-glucozidă (Mv{-3-GLC) și malvidin-3-galactozidă (Mv{-3-gal) atât în ​​linia celulară de hepatocarcinom uman HepG2, cât și într-un dieta cu grăsimi care combină șoareci diabetici induși de streptozotocină. Tratamentul cu glucoză ridicată a crescut semnificativ stresul oxidativ hepatic de până la 6-ori și a scăzut viabilitatea celulelor HepG2. Pretratarea cu BAE, Mv, Mv-3-glc și Mlv-3-gal a atenuat semnificativ aceste daune prin scăderea speciilor reactive de oxigen (ROS) cu 87,80,76 și 91% și prin creșterea viabilității celulare. cu 88,79,73 și, respectiv, 98 la sută. Aceste pretratamente au inhibat, de asemenea, în mod eficient hiperglicemia și hiperlipidemia, respectiv prin reducerea nivelurilor de expresie ale enzimelor care participă la gluconeogeneză și lipogeneză și prin creșterea celor implicate în glicogenoliza și lipoliză, prin calea de semnalizare a protein kinazei activate de adenozin monofosfat (AMPK) în celulele HepG2. Pentru a determina rolul AMPK în reacția indusă de BAE a metabolismului glucozei și lipidelor in vivo, doze de 100 mg/kg (extracte de antociani de afine-concentrație scăzută, BAE-L) și 400 mg/kg (extracte de antociani de afine -concentrație mare) , BAE-H) au fost administrate pe zi la șoareci diabetici timp de 5 săptămâni. Tratamentele BAE au avut un efect semnificativ (P<0.05) effect="" on="" body="" weight="" and="" increased="" the="" ampk="" activity,="" achieving="" the="" decrease="" of="" blood="" and="" urine-glucose,="" as="" well="" as="" triglyceride="" and="" total="" cholesterol.="" this="" research="" suggested="" that="">antociania contribuit la extractul de afine indushipoglicemieși efectele hipolipidemice în diabet și BAE ar putea fi un aliment funcțional promițător sau un medicament pentru tratamentul diabetului.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

1. Introducere

Diabetul zaharat (DZ) este o boală bine-cunoscută caracterizată de obicei prin incapacitatea de a menține nivelurile normale de glucoză din sânge. Această tulburare metabolică cronică dăunează grav sănătății umane și impune o povară financiară grea sistemelor de sănătate din întreaga lume [1]. Această boală este clasificată în două tipuri principale, în funcție de cauza dereglării glicemiei. DZ de tip 1 este cauzat de distrugerea autoimună a celulelor beta care duce la incapacitatea de a produce insulină, în timp ce diabetul de tip 2 este caracterizat de receptorii de insulină rezistenți la insulină, având o funcție redusă, nu permit celulelor să răspundă în mod adecvat la creșterea glicemiei.

Cistanche poate îmbunătăți imunitatea

Pe lângă hiperglicemie, diabeticii tind să aibăhiperlipidemieambele condiții pot duce la deteriorarea organelor și țesuturilor prin creșterea stresului glioxidativ [2]. Producția de insulină și deteriorarea receptorilor de insulină se numără printre factorii care provoacă hiperglicemie la diabetici. În ficat, supraexprimarea gluconeogenezei și glicogenolizei reliberează glucoza în fluxul sanguin [3], în timp ce, în intestinul subțire, supraexpresia transportorului de glucoză 2 (GLUT2) determină o creștere a transportului de glucoză [4]. Hiperlipidemia cauzată de supraexprimarea lipogenezei în țesutul adipos [5] poate provoca, de asemenea, diminuarea absorbției glucozei stimulate de insulină și a sintezei glicogenului, ducând la rezistența la insulină și contribuind astfel la progresia diabetului 6]. Complicațiile pe termen lung legate de diabet afectează diferite organe și includ hipertensiune arterială, ateroscleroză, retinopatie, nefropatie, ulcere ale piciorului și neuropatie periferică [7].

În prezent, nu există un tratament pentru diabet, însă efectele acestuia pot fi atenuate [8]. Pentru persoanele diagnosticate cu diabet zaharat de tip 1, o combinație de reglare a dietei și aportul adecvat de insulină în funcție de carbohidrații consumați este tratamentul comun. Provocările actuale pentru diabeticii de tip 1 includ incapacitatea sau dificultățile în estimarea carbohidraților totali și a dozei adecvate de insulină; cu toate acestea, aproape idealglicemicnivelurile sunt posibile având în vedere progresul tehnologic, inclusiv pompele de insulină [9]. Pentru pacienții care suferă de diabet zaharat de tip 2, tratamentul poate fi mai complex, incluzând combinații de reglare a dietei, exerciții fizice, insulină și alte medicamente cu o varietate de mecanisme de acțiune care funcționează pentru a scădea glicemia[10].Recomandarea alimentară comună este de a urma o dietă cu conținut scăzut de carbohidrați [11,12].

Afinele este unul dintre fructele pe care pacientii cu diabet zaharat le pot consuma si ar putea diminua riscul de diabet zaharat de tip 2 (T2DM)[13,14]. Afinele sunt bogate într-o mare varietate de compuși benefici pentru sănătatea umană, inclusiv minerale, fibre acizi organici, acizi fenolici și flavonoide, inclusiv flavonoli și antociani [15,16]. Cu toate acestea, profilurile tipice de antociani includ galactozide, glucozide și arabinozide ale delfinidinei, malvidinei, cianidinei, petunidinei și peonidinei [17], malvidina și delfinidinele fiind de obicei contribuția majoră la conținutul total de antociani [18,19]. În studiul nostru anterior [20], malvidina a fost cea mai abundentă antocianidină găsită în extractul de fructe de afine de iepure, împreună cu delfinidină, cianidină, petunidină și peonidină, ceea ce este în acord cu alți autori care au găsit, de asemenea, că malvidina este un contributor important la conținutul total de antociani. în diferite tipuri de afine [17,21].

Antocianinele de afine pot îmbunătăți sensibilitatea la insulină prin capacitatea antioxidantă și prin alte interacțiuni de reglementare, deoarece efectele lor nu pot fi explicate în întregime de primele [13,22]. Studiile au descoperit, de asemenea, beneficiile antocianilor de afine pentru alte preocupări legate de diabet. Într-un studiu in vitro, Huang și colab. [23] a descoperit că antocianinele de afine aveau efecte antiinflamatorii și antioxidante asupra celulelor retiniene umane în condiții de glucoză ridicată. Celulele expuse la un nivel ridicat de glucoză au avut o viabilitate de 64%, în timp ce atunci când au fost expuse la extract de antociani de afine, malvidină, malvidin-glucozidă sau malvidin-galactozidă, viabilitatea lor a fost de 7-9 la sută , 83 la sută ,91- la sută sau { {11}} la sută, respectiv. Pe de altă parte, Song și colab. [24] au descoperit că antocianinele de afine au redus stresul oxidativ și inflamația în retina de șobolan diabetic. Șobolanilor diabetici li s-au administrat 20, 40 și 80 mg/kg de antocianine de afine pe cale orală timp de 12 săptămâni. Sobolanii cu doze mari de antociani de afine au avut glicemie mai scazuta, capacitate antioxidanta mai mare si inflamatie mai scazuta la nivelul retinei si specii de oxigen reactive mai scazute in comparatie cu cei fara antociani de afine.

Deși antocianinele de afine oferă beneficii pentru sănătate ficatului și altor organe pentru diabetici, acțiunile hipoglicemiante și hipolipidemiante ale extractului de antociani din afine (BAE) în celulele hepatice umane sunt neclare. În studiul de față, s-a speculat că BAE, precum și Mv, Mv-3-glc și Mv-3-gal, au activități hipoglicemiante și hipolipidemice în celulele hepatocarcinomului uman (HepG2) și la șoareci și că acestea ar putea menține homeostazia glucolipidică atenuând astfel dezvoltarea diabetului.

2. Materiale și metode

2.1. Chimice și reactivi

Afine de tip ochi de iepure Brightwell (Vaccinium ashei au fost recoltate de la Fujiabian Orchard Picking (Nanjing, China) și extractele lor de antociani au fost apoi obținute și depozitate la întuneric la grade {{0}} . Reactivul 3- (4,5 dimetiltiazol-2-il){-2,5 difenil-2bromură de H-tetrazoliu (MTT) și standardele malvidină (Mv), malvidin-3-glucoză (Mv{ {11}}glc) și malvidin-3-galactoză (Mv-3-gal) au fost procurate de la Sigma Aldrich (Shanghai, China). Celule primare HepG2, trusa de analiză a proteinei acidului bicinconinic (BCA) și îmbunătățită Reactivii de detectare prin chemiluminescență (ECL) Western blot au fost achiziționați de la CW Biotechnology (Beijing, China). Ser fetal bovin (FBS), mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) și penicilină-streptomicina au fost procurate de la Gibco (Auckland, Noua Zeelandă). BioFroxx streptozotocina (STZ) a fost achiziționată de la Saiguo Biotech (Guangzhou, China) Kitul de detectare a dicloro-dihidro-fluorescein diacetat (DCFH-DA) a fost cumpărat de la Beyo-time Institute of Technology (Shan Ghai, China). Albumina serică bovină (BSA) a fost achiziționată de la Shyuanye (Shanghai, China). Furajele bogate în grăsimi și zahăr (grăsimi 35,5%, proteine ​​20%, carbohidrați 36,4%, 0,1% celuloză) și furajele normale (grăsimi 4,5%, proteine ​​23%, carbohidrați 31,9%, 3,7% fructoză și 5,3% celuloză) pentru șoareci au fost obținute de la Xietong Bioengineering Co., Ltd (Nanjing, China). Trusele de analiză pentru insulină, trigliceride (TG), colesterol total (TCHD, glutation peroxidază (GSH-Px) și superoxid dismutază (SOD) au fost cumpărate de la Jiancheng Bioengineering Research Institute (Nanjing, China). , glucozo-6-fosfatază (G6Pase), glicogen sintetaza-fosforilare (p-GS), glicogen sintază kinaza-3 beta-fosforilare (p-GSK3 ), transportor de glucoză 2 (GLUT2), acetil coenzima A carboxilază (ACC), trigliceride lipază hormono-sensibilă (HSL), 3-hidroxi{-3-metilglutaril-coenzima reductază (HMGCR) și kituri de test imunosorbent legat de enzime (ELISA) pentru insulină de jeun la șoarece au fost toate achiziționate de la Bluegene Biotech (Shanghai, China) Substanțele chimice și reactivii utilizați în acest studiu au fost toate de grade analitice pure.

2.2. Anticorpi

Anticorpii primari împotriva GS, p-GS (Ser641), proteina de legare a elementelor de reglare a sterolului-1c(SREBP-1c) și fosfoenolpiruvat carboxikinaza (PEPCK) au fost achiziționate de la Abcam (Cambridge, Regatul Unit) . Anticorpi primari împotriva protein kinazei alfa activate de adenozin monofosfat (AMPKa), p-AMPK a (Thr172), receptor-y-coactivator activat de proliferator de peroxizom-1 (PGC-1 ), ACC, p- Anticorpii secundari conjugați ACC (Ser79) și peroxidază de hrean (HRP) au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology (Beverly, MA, SUA). Anticorpul împotriva gliceraldehidei 3-fosfat dehidrogenazei (GAPDH) a fost achiziționat de la Nanjing Beidi Biomed Technology (Nanjing, China), în timp ce anticorpul împotriva -actinei a fost cumpărat de la Sigma Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Anticorpii primari au fost utilizați la diluții 1:1000, în timp ce diluțiile 1:4000 au fost utilizate pentru anticorpii secundari.

2.3. Prepararea extractului de antociani de afine (BAE)

Extracția antocianilor de afine a fost efectuată folosind metoda noastră anterioară a lui Huang și colab. [25]. Afinele de ochi de iepure congelate au fost ținute la temperatura camerei până la decongelare. Apoi, au fost bătuți la 10 000 rpm timp de 30 de secunde folosind un omogenizator T18 ULTRA-TURRAX de bază (IKA Works Guangzhou, China). O cantitate de 250 g de afine a fost apoi înmuiată într-o soluție de 1000 mL de metanol care conține 1% HCI timp de 24 de ore. Extractul a fost apoi colectat după centrifugare la 5000 x g timp de 15 minute. După evaporarea solventului la 40 de grade în vid, reziduul a fost extras cu acetat de etil 1:1 (v/v) de trei ori. Faza apoasă care conține antociani a fost colectată și concentrată utilizând evaporare în vid pentru a obține extractul brut de antociani. Extractul a fost purificat în continuare cu rășină macroporoasă AB-8 (Sigma Aldrich, Shanghai, China). Pentru a îndepărta fructoza și proteinele, extractul a fost supus cromatografiei pe coloană pe 1000 g de rășină macroporoasă AB-8 timp de 24 de ore și apoi a fost eluat cu apă dublu distilată. Fracția de antociani a fost eluată cu 80% etanol care conține 1% soluție de HCl, concentrată în vid și apoi uscată folosind un liofilizator Eyela FDU-1200 (Tokyo Rikakikai, Japonia) pentru a obține un extract de antociani de afine (BAE) pudra.

2.4. Cultură celulară și tratamente

Liniile de celule HepG2, derivate dintr-un carcinom hepatocelular uman specific distinct, au o proporție mare de proteine ​​specifice ficatului. Din acest motiv, ele sunt utilizate în mod obișnuit ca modele de laborator pentru studiile pe celulele hepatice umane [26]. Celulele HepG2 au fost crescute în DMEM care conține D-glucoză normală (5,5 mM) suplimentată cu 10% FBS și 1% penicilină-streptomicină și ținute la 37 de grade C și 5% CO2 în atmosferă incubator (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA). După ce s-au atins 70-80 procente de confluență, celulele HepG2 au fost subcultivate. Cu patru ore înainte de experiment, celulele HepG2 au fost oprite într-un mediu seric redus. După pretratarea cu 5 ug/mLof Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal sau BAE timp de 24 de ore, celulele au fost expuse la concentrații normale (5,5 mM) sau mari (30 mM) de glucoză la mimează condițiile normale și diabetice. Celulele au fost pregătite pentru analiza Western Blot și supernatanții au fost colectați pentru analiza ELISA.

2.5. Animale și design experimental

Șoarecii masculi sănătoși C57BL/6J (20 ± 2 g) de la GemPharmatech (Nanjing, Jiangsu, China) au fost ținuți în condiții standard de laborator, inclusiv o temperatură constantă de 25 de grade și o alternanță de 12- h zi și noapte. Subcomitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de cercetare al Academiei de Științe Agricole din Jiangsu a aprobat anterior toate procedurile experimentale pe animale. O dietă bogată în grăsimi și streptozotocină (STZ) au fost folosite pentru a induce T2DM la modelele animale, conform metodei utilizate de Islam și Loots [27]. Toți șoarecii au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi și zahăr, cu excepția grupului de control care a consumat o dietă normală. După 4 săptămâni, șoarecii au fost ținuți timp de 12 ore și au fost injectați intraperitoneal cu 100 mg/kg STZ dizolvat în soluție tampon de citrat de sodiu (pH 4.2-4.5). La o săptămână după inducerea STZ, au fost prelevate probe de sânge din vena coadă a șoarecilor care ținuseră post peste noapte. Șoarecii care au prezentat simptome diabetice, inclusiv poliurie, polidipsie și hiperglicemie (nivel de glucoză din sânge > 11,1 mmol/L) au fost recunoscuți ca DZD și utilizați pentru studii viitoare. Pentru a verifica stabilitatea T2DM a modelului, toți șoarecii au fost hrăniți cu o dietă normală timp de o săptămână. Șoarecii normali au fost utilizați ca grup de control. Șoarecii diabetici au fost apoi împărțiți aleatoriu în trei grupuri: model, BAE cu doză mică (100 mg/kg) și BAE cu doză mare (400 mg/kg). Timp de 6 zile consecutive, administrarea intragastrică a aceluiași volum de solvent (100 μL), 100 mg/kg sau 400 mg/kg de BAE a fost administrată grupului de control, grupului model, BAE cu doză mică și BAE cu doză mare. respectiv. În a șaptea zi au fost măsurate greutatea corporală și glicemia a jeun. Aceeași administrare intragastrică a continuat timp de 5 săptămâni. Șoarecii au fost apoi ținuți peste noapte și au fost colectate probe de sânge pentru prepararea serului din vena cavă inferioară și depozitate la gradul-20 . După prelevarea de sânge, toți șoarecii au fost anesteziați și sacrificați. Ficatul, splina, rinichii și țesuturile timusului de șoareci au fost îndepărtate, cântărite și depozitate la gradul de -80 pentru experimente ulterioare.

2.6. Detectarea viabilității celulare

Viabilitatea celulară a fost determinată prin metoda MTT. Cinci ug/mL de Mv, Mv{{0}}glc, Mv-3-gal sau BAE au fost utilizate pentru pretratarea celulelor timp de 24 de ore. Celulele au fost apoi tratate cu 5 mMor 30 mM glucoză timp de 24 de ore și 10 uL 0,5% (5 mg/mL) MTT au fost adăugate celulelor care au fost apoi cultivate din nou. După 4 ore, soluția MTT a fost îndepărtată și s-au adăugat 100 μL dimetil sulfoxid (DMSO) înainte ca amestecul să fie agitat lent timp de 10 minute pentru a dizolva cristalul celular. Absorbanța la 490 nm a fost măsurată pe un cititor de microplăci StatFax-2100 (Awareness Tech-nology Inc., Plam, FL, SUA) pentru a obține valorile densității optice (OD). Celulele cultivate cu niveluri normale de glucoză (5,5 mmol/L) au fost utilizate ca grup de control, în timp ce godeurile fără celule au fost utilizate ca martor. Următoarea formulă a fost utilizată pentru a determina viabilitatea celulei: Viabilitate celulară (procent )=(valoarea DO al grupului de eșantion-valoare DO al grupului martor)/(Valoare DO ale grupului martor - valoare DO ale grupului martor) x 100 procente .

2.7. Vizualizarea fluorescenței ROS

Speciile reactive de oxigen (ROS) din celulele HepG2 au fost evaluate folosind kitul de detectare DCFH-DA. După un tratament inițial cu 5 ug/mL de Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal sau BAE timp de 24 de ore, care a fost urmat ulterior de un tratament cu 5 mM sau 30 mM glucoză timp de 24 de ore, celulele au fost spălate cu PBS, apoi au fost adăugate 10 μM DCFH-DA în fiecare godeu și lăsate să reacționeze timp de 20 de minute la 37 de grade. Celulele au fost din nou spălate bine cu PBS și apoi un grup de aceste celule a fost observat imediat la un microscop fluorescent inversat IX53 (Olympus, Tokyo, Japonia) la filtre de emisie de 530 nm și excitare de 485 nm. Imaginile sunt prezentate cu o mărire de 200×. După disociere, un alt grup de celule a fost colectat și fluorescența lor a fost înregistrată de un cititor de microplăci multimod Synergy H4 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, SUA). Intensitatea totală de fluorescență a celulelor din fiecare godeu a fost notă și generarea de ROS a fost măsurată ca o pliază a Controlului.

2.8. ELISA

Trusele ELISA au fost utilizate pentru a cuantifica proteinele implicate în gluconeogeneză (FOXO1, G6Pase, p-GS), glicogenoliză (p-GSK3), transportor de glucoză (GLUT2), lipogeneză (ACC și HMGCR) și lipoliză (HSL) în supernatanții HepG2. celule. S-a determinat, de asemenea, cantitatea de GLUT2 din ficatul de șoareci. Trusa de analiză a proteinei BCA a fost utilizată pentru a cuantifica proteina celulară totală a supernatantului. Absorbanța la 450 nm a fost măsurată la 37 de grade pe un cititor de microplăci StatFax-2100 (Awareness Technology Inc., Plam, FL, SUA) pentru a determina nivelurile de proteine.

2.9. Analiza Western blot

Western blotting a fost efectuat pe lizate de HepG2 pentru a măsura nivelul proteic al AMPK, p-AMPK, gluconeogeneza (PGCl, PEPCK, glicogenoliza (GS, p-GS) și lipoliza (ACC, p-ACC, SREBP{{4} }c) în celule. Western blotting a fost, de asemenea, efectuat pentru a determina cantitățile de AMPK,p-AMPK pe ficatul șoarecilor induși de diabet. Fie GAPDH, fie -Actin a fost folosit ca control de încărcare. Imagistica LAS-3000 (Fuji, Tokyo, Japonia) a fost folosit pentru a observa benzile de proteine, iar densitatea acestora a fost cuantificată folosind software-ul Bio Profile 1D plus plus (Vilbert Lour-mat, Marne La Vallee, Franța).Toate datele au fost exprimate ca o modificare a oriului controlul.

2.10. Analiza glicemiei a jeun și a toleranței la glucoză

Glicemia a jeun a fost măsurată o dată pe săptămână pentru o perioadă de 5 săptămâni după o perioadă de post de 12-h. Pentru testul de toleranță la glucoză, șoarecii au fost ținuți timp de 16 ore și hrăniți cu 2 g/kg de 20 procente de glucoză (2{00 μL) intra-gastric (ig) pentru a determina glicemia la 0 ,0,5,1,1,5 și 2h. Sângele a fost colectat din vena cozii și nivelurile de glucoză au fost măsurate folosind un glucometru (Sinocare, Changsha, China). Nivelul de glucoză din urina șoarecilor care au primit ig a fost de asemenea măsurat pentru o perioadă de cinci săptămâni.

2.11.Estimarea indicilor biochimici serici și a activității enzimatice la ficatul de șoareci

S-a măsurat cantitatea de insulină, trigliceride și colesterol total din ser, în timp ce activitatea enzimatică SOD și GSH-PX a fost estimată folosind kiturile comerciale conform protocolului producătorului. Absorbanța la 500 nm pentru trigliceride (TG) și colesterol total (TCH) și 450 nm pentru celelalte (insulina, SOD și GSH-PX) a fost măsurată la 37 de grade pe un cititor de microplăci StatFax-2100 (Awareness Technology). Inc., Plam, FL, SUA).

2.12. analize statistice

Toate datele sunt prezentate ca valoare medie ± abaterea standard (SD) a cel puțin trei experimente independente. Cifrele au fost obținute folosind GraphPad Prism Versiunea 8 (GraphPad Software, Inc., CA, SUA). Analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), testele t sau testul de comparații multiple Sidak au fost efectuate pentru a determina diferențele statistice între diferite grupuri. Diferențele au fost considerate semnificative la P<>

Acest articol este extras din https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102100 Primit 21 iulie 2021; Primit în formă revizuită 9 august 2021; Acceptat la 11 august 2021