SNP Rs708727 asociat cu boala Alzheimer în SLC41A1 poate crește riscul de boală Parkinson: raport din studiul slovac extins partea 2

2.2. Analize genetice

Analizele genetice au fost efectuate pe SNP-urile A1 rs11240569, rs708727 și rs823156 în cohorta de 508 pacienți cu PD (vs. 150 de pacienți în studiul pilot) și cohorta de 472 de controale (față de 120 de controale în studiul pilot) [37]. Astfel, numărul pacienților cu PD și al celor de control au fost crescute în acest studiu de 3,4-ori, respectiv de 3,9 ori, în comparație cu studiul pilot.

Mulți oameni suferă de pierderi de memorie pe măsură ce îmbătrânesc, dar pentru persoanele cu boala Parkinson, modificările de memorie pot fi mai pronunțate. Cu toate acestea, nu ar trebui să ne gândim la persoanele cu boala Parkinson ca fiind obligate să sufere declinul memoriei, deoarece există lucruri pe care le putem face pentru a-i ajuta să-și mențină memoria.

În primul rând, efectuarea în mod constant a unor activități de antrenament a creierului poate ajuta persoanele cu boala Parkinson să-și îmbunătățească memoria. Aceste activități pot include: a face Sudoku, a juca jocuri de societate, a rezolva puzzle-uri și multe altele. Prin aceste activități, ei își pot exercita memoria, își pot îmbunătăți funcția creierului și îi pot ajuta să-și mențină starea mentală.

În al doilea rând, alimentația are și un impact foarte important asupra memoriei pacienților cu boala Parkinson. În dietă, putem adăuga câteva alimente bogate în proteine ​​și nutrienți, precum pește, fasole, nuci etc. Aceste alimente ne pot ajuta să rămânem sănătoși și să ne îmbunătățim memoria.

În cele din urmă, exercițiile fizice regulate pot ajuta și persoanele cu boala Parkinson să-și îmbunătățească memoria. Exercițiile fizice nu numai că ne ajută să rămânem sănătoși din punct de vedere fizic, dar și mai important, ne îmbunătățesc funcția creierului. Prin exerciții fizice regulate, aceștia își pot crește funcția cardiopulmonară, își pot spori elasticitatea mușchilor și oaselor și își pot îmbunătăți memoria.

Per total, dacă persoanele cu boala Parkinson experimentează declinul memoriei depinde de stilul lor de viață și de obiceiurile alimentare, precum și dacă acordă atenție unor lucruri precum antrenamentul creierului și exercițiile fizice. Atâta timp cât acordăm atenție acestor aspecte, cred că memoria pacienților cu boala Parkinson poate fi îmbunătățită eficient. Se poate observa că trebuie să ne îmbunătățim memoria. Cistanche deserticola poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece Cistanche deserticola este un material medicinal tradițional chinezesc cu multe efecte unice, dintre care unul este îmbunătățirea memoriei. Eficacitatea cărnii tocate provine dintr-o varietate de ingrediente active pe care le conține, inclusiv acid carboxilic, polizaharide, flavonoide etc. Aceste ingrediente pot promova sănătatea creierului prin diverse canale.

Faceți clic pe cunoașteți modalități de îmbunătățire a funcției creierului

In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) în cohorta noastră totală (cazuri PD + probe de control), aproximativ comparabil cu intervalul de fq total al populației alelelor minore (MATPFR) raportat de bazele de date gnomAD și ExAC, după cum urmează: fqo (observat) vs. pentru (raportat) {{1 }}% ​​față de 29-30%.

Alela minoră fq pentru rs708727 (G > A) în cohorta noastră totală a fost mai mare decât MATPFR în bazele de date gnomAD și ExAC (fq, vs. pentru=40% vs. 29-30%), dar a fost comparabilă cu alela minoră rs708727 fq raportată pentru populația europeană în baza de date ALFA (41%). Alelele minore rs823156 (A > G) din cohorta noastră totală a fost de 17% și, prin urmare, a fost mai mică decât MATPFR în bazele de date gnomAD și ExAC (23-30%), dar a fost comparabilă cu alelele minore rs823156 raportate pentru populația europeană în baza de date ALFA (18%).

Frecvența alelei minore a rs9438393 (A > G) în cohorta totală a fost de 40% și, prin urmare, a fost semnificativ mai mare decât MATPFR de 26-29% raportat în bazele de date gnomAD și TOPMED, dar a fost comparabilă cu rs9438393 minor. frecvența alelelor raportată în baza de date ALFA pentru populația europeană (41%). Alela minoră a rs56152218 (T > C) din cohorta totală a fost prezentă cu un fq de 38%, care se află în cadrul MATPFR de 32-46% raportat de bazele de date ALSPAC, TOPMED și ALFA (populația europeană).

Interesant este că în populațiile vietnameze, coreene și qatare, alela minoră este T și nu C, așa cum sa observat în populația europeană [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{{0} }rs56152218, accesat la 2 august 2021)]. Fq-ul alelei minore din rs61822602 (G > T) s-a dovedit a fi de 12%. Acest lucru este comparabil cu frecvențele alelei T raportate de bazele de date ALSPAC și TWINSUK (12% și, respectiv, 13%), dar este mult mai mare decât fq-ul alelei T raportat în populația europeană în baza de date ALFA (6%).

Toate SNP-urile A1 testate din cohortele noastre PD și de control au fost în echilibrul Hardy-Weinberg (HWE; Tabelul 4).

Apoi, am calculat cotele de cote (OR) ale alelei minore și genotipurilor care conțin alela minoră pentru fiecare SNP testat. Aceste rezultate sunt rezumate în tabelul 5. Genotipul GA din rs708727 a fost asociat cu PD (OR=1.42 (1.08-1.87), p=0.01) în populația noastră. În plus, am testat asocierea unor combinații genotipice particulare pentru fiecare SNP testat cu PD în modele genetice recesive, dominante și complet supradominante (Tabelul 6). Coerent cu datele anterioare, am identificat o asociere a alelei minore rs708727 (A) cu PD în modelele genetice dominante (GG vs. GA + AA) și complet supradominante (GG + AA vs. GA) (ORD {{16} },36 (1,05–1,77), p=0,02 și ORCOD=1,34 (1,04–1,72), respectiv p=0,02). SNP-urile rămase nu au arătat nicio asociere cu PD în modelele genetice testate (Tabelul 6).

De asemenea, am testat egalitatea proporțiilor populației din orice combinație genotipică compusă din dupleți, tripleți, cvadrupleți, cvintupleți sau sextupleți ai SNP-urilor testate în cohorta PD (N {{0}}) și cohorta de control ( N=100) pentru a examina dimensiunea efectului interacțiunilor dintre SNP-urile A1 testate față de susceptibilitatea pentru dezvoltarea PD în populația noastră. În total, un total de 12 combinații genotipice (două duplets, șapte tripleți și trei cvadrupleți, Tabelul 7) cu semnificativ (p < 0.{0 5, 10 genotipuri; p < 0,06, două genotipuri) ) au fost identificate diferite numărări în cohortele PD și de control (Tabelul 7). Urmând criteriile lui Cohen [39], care descriu diferențele de proporții, doar tripletul GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) din cele 12 genotipuri au arătat diferența de dimensiune „medie” definită de h(2arcsin√ a lui Cohen). –2arcsin√ prp2) Mai mare sau egal cu 0,5.

Valoarea h pentru restul de 11 genotipuri a variat între 0.32 și 0.46 și a fost astfel în intervalul h de la 0.2 la 0.5, ceea ce definește mici diferențe de proporții (Tabelul 7) [39]. Prin urmare, tripletul GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) ar putea fi semnificativ din punct de vedere clinic și ar trebui efectuate examinări viitoare ale acestui genotip cu privire la susceptibilitatea PD. Pentru rs11240569, rs708727 și rs823156, am efectuat același tip de analiză cu date sursă din cohorta de 508 pacienți cu PD și cohorta de 472 de controale. Patru genotipuri, doi dupleți (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) și doi tripleți (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AGG3(rs708727) + AGG(rs708727) + AGG(rs823156) + GG(rs708727) + AG(rs823156)), cu număr semnificativ (p < 0,05) diferite în cohortele PD și control, au fost identificate. h-ul lui Cohen calculat pentru fiecare dintre cele patru genotipuri a fost sub pragul de 0,2 [39], și astfel, diferența dintre proporțiile populației dintre grupurile testate a fost, în toate cele patru cazuri, neglijabilă.

Îmbătrânirea, urmată de sexul masculin, este considerată a fi cel mai proeminent factor de risc pentru apariția PD idiopatică [37]. În studiul nostru pilot, vârsta de debut a PD idiopatică în cohorta de 15 0 pacienți cu PD nu a fost corelată cu prezența vreunei combinații genotipice pentru SNP rs11240569, rs708727 și rs823156 [37]. Aici, am corelat vârsta de debut a PD cu (1) prezența fiecărei combinații genotipice pentru SNP rs11240569, rs708727 și rs823156 în grupul de 508 pacienți cu PD (Figura 2) și (2) cu prezența fiecăruia. combinație genotipică pentru SNP-uri rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 și rs61822602, în sub-cohorta de pacienți cu PD, selectate aleatoriu din cohorta A1PD pentru secvențierea promotorului A1PD3. Despre vârsta de debut, o analiză ANOVA unidirecțională a arătat că nu a existat o diferență semnificativă (p < 0,05) între sub-populațiile genotipice pentru fiecare dintre SNP-urile testate atât în ​​cohorta mare de PD, cât și în sub-cohorta de PD. pacientii. Astfel, orice genotip special din SNP-urile testate nu influențează vârsta de debut a formei idiopatice de PD. Acest lucru este în deplin acord cu concluzia trasă în studiul nostru pilot [37].

De asemenea, am efectuat același tip de analiză pentru fiecare dintre SNP-urile testate în sub-populații de femei și bărbați care au fost derivate din cohorta mare (N=508) și sub-cohorta (N=96 ) a pacienților cu PD. După cum se demonstrează în figurile suplimentare S1–S3, nicio asociere semnificativă (p < 0.05) între vârsta de debut și prezența oricărei combinații de genotip anume în SNP-urile testate iar rs61822602 din subgrupurile împărțite în funcție de gen a fost derivat fie din cohorta mare PD (NM=306, NF=202), fie din sub-cohorta PD selectată pentru secvențierea promotorului A1 (NM {{20} }, NF=42).

2.3. RandomForest Machine Learning (RF-ML)

Toate SNP-urile A1 au fost testate pentru capacitatea lor de a discrimina între pacienții cu PD și controalele cu RF-ML. Algoritmul RF-ML a fost antrenat folosind datele noastre și a fost evaluată importanța discriminativă a SNP-urilor individuale printr-un construct tehnic, cunoscut sub numele de adâncimea graficului [37,40]. Ca și în studiul nostru pilot [37], capacitatea de predicție a SNP-urilor testate a fost vizualizată și cuantificată prin curbele ROC (caracteristică de funcționare a receptorului) și, respectiv, prin AUC (aria sub curba ROC). Capacitatea de discriminare a predictorilor este dată în intervalul ASC de la 100% (capacitate discriminativă maximă) până la 50% (capacitate discriminativă minimă); ASC < 50% corespunde unei capacități de nediscriminare.

Algoritmul RF a fost antrenat în următoarele moduri: (1) cu trei sau șase (Tabelul 8) SNP-uri A1 particulare (fiecare SNP, trei genotipuri (AMAM/AMAm/AmAm, unde AM reprezintă alela majoră și Am pentru alela minoră), ca predictor (trei sau șase modele RF, unul pentru fiecare SNP), (2) cu dupleturi genotipice ale SNP-urilor perechi ca predictori (trei modele RF (trei SNP) sau 15 modele RF (șase SNP), câte unul pentru fiecare pereche de SNP; Tabelul 8), (3) cu tripleți genotipici ai celor trei SNP ca predictori (un model RF (trei SNP) sau 20 de modele RF (șase SNP), câte unul pentru fiecare triplet de SNP; Tabelul 8), (4) cu cvadrupleți genotipici ai celor șase SNP ca predictori (15 modele RF, unul pentru fiecare cvadruplet; Tabelul 8), (5) cu cvintupleți genotipici ai celor șase SNP ca predictori (șase modele RF, unul pentru fiecare cvintuplet; Tabelul 8) și ( 6) cu un sextuplet genotipic (un model RF, Tabelul 8).

Astfel, atunci când singleton-urile, dupleții, tripleții, cvadrupleții, cvintupleții și sextupletul SNP-urilor A1 au fost utilizați ca predictori, nu au avut nicio capacitate de a discrimina între pacienții cu PD și controale (Tabelul 8). Prin urmare, conform analizei RF-ML și în acord cu studiul pilot [37], SNP-urile A1 nu au potențialul de a servi drept discriminatori între control și pacienții cu PD și, în ceea ce privește PD, nu au valoare predictivă sau diagnostică în populația slovacă. .

3. Discuție

Locusul PARK16 a câștigat atenția comunității științifice datorită asocierii sale cu PD și a rolului său discutat în definirea susceptibilității la această boală complexă. În 2019, am raportat un studiu pilot în care am analizat asocierea celor trei SNP-uri A1, și anume rs11240569, rs708727 și rs823156, cu forma idiopatică a PD în populația slovacă (slavii de vest). Asocierea raportată a rs11240569 și rs823156 cu susceptibilitatea la PD în principal la populațiile asiatice/orientale nu a fost găsită în studiul nostru [37]. Nicio asociere nu a putut fi confirmată folosind statistici frecventiste (analize genetice conservatoare) sau prin analiza RF-ML [37].

Limitarea majoră a studiului nostru pilot a fost, totuși, numărul relativ scăzut de pacienți/probabili din cohortele PD și de control (150 și, respectiv, 120). Am subliniat că, din punct de vedere statistic, datele au trebuit interpretate cu prudență din cauza dimensiunii reduse a eșantionului în ambele cohorte și din cauza puterii statistice scăzute a analizelor efectuate [37]. Cu toate acestea, prin utilizarea abordării ML, care necesită dimensiuni considerabil mai mici ale eșantionului decât statisticile frecventiste convenționale sau calculul Bayesian aproximativ, am putut examina cu încredere capacitatea anumitor SNP-uri A1 de a discrimina între pacienții cu PD și controale. În toate cazurile, abordarea ML a evidențiat în esență zero relevanță diagnostică și predictivă a SNP-urilor rs11240569, rs708727 și rs823156 în populația slovacă [37].

În acest studiu, am examinat nu numai cele trei SNP-uri menționate mai sus, ci și cele trei SNP-uri (rs9438393, rs56152218 și rs61822602) localizate în regiunea promotoare a A1. Aceste SNP au fost identificate prin secvențierea a 96 de probe PD urmată de analiza RFLP a probelor de control și verificarea RFLP a probelor PD secvențiate. Analizele noastre genetice nu au evidențiat în esență nicio asociere a niciunuia dintre cele trei SNP-uri nou studiate cu PD. Același lucru este valabil și pentru rs11240569 și rs823156, care au fost analizate în sub-cohortele PD și control (96/100) și, de asemenea, în cohortele de 508 pacienți cu PD și 472 martori. Aceste rezultate sunt în total acord cu rezultatul studiului pilot [37]. Cu toate acestea, în cohortele mari, rs708727 este asociat cu un risc crescut de PD în populația slovacă.

Din cele mai bune cunoștințe, niciun studiu nu a asociat încă direct A1 SNP rs708727 cu un risc modificat pentru dezvoltarea PD [19,37]. În studiul nostru extins (în comparație cu studiul pilot [37]), alela minoră A din rs708727 este asociată cu un risc crescut de apariție a PD atunci când este testată în dominant [40] (ORD=1.36 (1,05– 1,77), p=0,02) sau complet supradominant [41] (ORCOD=1,34 (1,04–1,72), p=0,02) modele (Tabelul 5). Astfel, prezența alelei minore (A) în rs708727 ar putea fi asociată cu un risc crescut de a dezvolta PD. Întrucât Sanchez-Mut și colab. [27] și Wang și colab. [42] au arătat în mod clar că prezența alelei minore A în rs708727 modifică metilarea promotorului PM20D1 (și, prin urmare, expresia acestuia) într-o manieră dependentă de doză (cantitativă), modelele genetice cele mai potrivite în studiul nostru. indică faptul că prezența unei alele rs708727 A este suficientă pentru a modifica susceptibilitatea la debutul PD. Susceptibilitatea PD (fenotip), despre faptul dacă una sau două copii ale alelei minore sunt prezente în rs708727 (genotip), rămâne să fie elucidată în detaliu.
Sanchez-Mut și colab. au identificat PM20D1 (localizat în locusul PARK16 și care codifică domeniul peptidază M20-conținând proteina 1 enzimă cu activități atât hidrolază, cât și peptidază; N-acil aminoacid sintază/hidrolază grasă) ca fiind o trăsătură cantitativă de metilare și expresie locus (mQTL) cuplat la un haplotip asociat riscului AD, care prezintă caracteristici asemănătoare amplificatorului și contactează promotorul PM20D1 printr-o buclă de cromatină mediată de factor de transcripție CTCF (legare CCCTC) dependentă de haplotip [27]. Comparând probe de la martori sănătoși și pacienți cu AD în stadiu avansat, ei au descoperit că PM20D1 prezintă în mod constant hipermetilarea promotorului la pacienții cu AD [27]. A1 SNP rs708727 se corelează cu nivelurile de metilare a ADN-ului PM20D1 în cortexul frontal uman și hipocampus [27], la fel ca și SNP rs960603 [27]. Wang și colegii săi, în munca lor asupra sângelui periferic, au obținut date care confirmă că PM20D1 este un mQTL mediat în principal de A1 SNP rs708727 asociat riscului AD [42].

Mai mult, datele lor longitudinale demonstrează că hipometilarea are loc înainte de debutul simptomatic al AD, probabil pentru a facilita exprimarea crescândă a PM20D1 pentru a-și activa funcția protectoare [42]. Progresul AD este marcat de un nivel în creștere de metilare în insulele CpG din DMR (regiunea metilată diferențial) a promotorului PM20D1 la pacienții cu AD, conducând în cele din urmă la inhibarea transcripției și expresiei genelor [27,42,43]. PM20D1 a fost, de asemenea, asociat cu diabetul [44], obezitatea [45] și scleroza multiplă [46] și, deoarece este localizat în locusul PARK16, se presupune că este posibilă implicare/asociere cu PD [47].

În ciuda lipsei de analize mecaniciste moleculare, speculăm, în lumina datelor noastre actuale, că AD și PD (și alte boli neurodegenerative mai puțin frecvente) au în comun mecanisme patofiziologice „binecunoscute” (de exemplu, mitofagie perturbată, retromer și proteazom). funcții), dar și mecanisme epigenetice, cum ar fi reglarea dependentă de A1 rs708727-a expresiei PM20D1 [27,42]. Munca noastră se adaugă indirect la necesitatea elucidării detaliate a rolului N-acil aminoacizilor (NAA) endogeni care sunt metabolizați de PM20D1 în patobiologia PD și a altor tulburări neurodegenerative. Se știe acum că NAA și N-acil conjugații neurotransmițătorilor (NAAN) joacă un rol important în neuromodulație [48,49]. Dovezile care leagă expresia PM20D1 cu N-acil dopamina (NADA) au fost furnizate de lucrările recente ale lui Song și colab. Acești autori au arătat că ștergerea kir6.2 (o subunitate care formează pori a canalelor K+ sensibile la ATP) duce la o reducere a numărului de mitocondrii și la scăderea producției de ATP prin creșterea nivelurilor de PM20D1 și a agenților care decuplează respirația mitocondrială. , inclusiv NADA, în mezencefalul murin [49].

NADA este un inhibitor puternic al 5-lipoxigenazei (5-LOX) și are o distribuție limitată la creier, nivelurile fiind cele mai ridicate în striat și foarte scăzute în altă parte [48,50,51]. 5-LOX catalizează sinteza leucotrienei sau 5-HpETE ({5-acidul hidroperoxi eicosatetraenoic) din acidul arahidonic și a fost asociat cu neurodegenerarea (AD și PD) prin implicarea sa în neuroinflamație [51, 52]. Prin urmare, sugerăm că expresia scăzută a PM20D1, abundența mai scăzută ulterior a NADA și activitatea crescută a 5-LOX contribuie în mod semnificativ la patologia PD (și a altor boli neurodegenerative).

Sanchez-Mut și colegii săi au demonstrat că supraexprimarea PM20D1 în hipocampul murin AD are ca rezultat îmbunătățirea învățării, în timp ce distrugerea acestuia crește încărcătura plăcii de amiloid [27]. Atât patologiile de tip Lewy, cât și cele de tip Alzheimer sunt importante în demența legată de PD [53]. Un grup semnificativ de pacienți cu PD suferă de agravarea demenței în timpul bolii [54]. Luând în considerare aceste observații, speculăm dacă activitatea legată de rs{10}}care reduce PM20D1 la tăcere contribuie la debutul demenței PD și dacă monitorizarea activității PM20D1 poate servi ca parametru de prognostic pentru debutul demenței PD.

Lucrările publicate anterior au sugerat implicarea transportatorilor de Mg2+ în patobiologia PD [18–22,55]. A1, fiind jucătorul cheie în homeostazia Mg a celulelor somatice, a fost legat direct de PD [20-22]. Mutațiile punctuale din A1 care conduc la substituții p.A350V, p.R244H și p.R285Q au fost presupus asociate cu PD și se presupune că atât lipsa funcției, cât și pierderea funcției mutațiilor din A1 au consecințe negative asupra neuronilor, prin urmare contribuind la fenotipul PD [20–22]. Această lucrare indică indirect o posibilitate ca nu numai perturbațiile funcției de bază A1 (schimb Na+/Mg2+), ci și reglarea epigenetică legată de A1-(rs708727) a expresiei (și activității PM20D1) să contribuie la patobiologia PD.

În acest studiu, am identificat tripletul genotipic GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) ca fiind potențial semnificativ din punct de vedere clinic (h Mai mare sau egal cu 0,5). Interesant, rs708727 cu genotipul GG face parte din triplet. Cu toate acestea, în lumina cercetărilor anterioare, ar fi de așteptat ca genotipul care conține alela minoră A din rs708727 să fie legat de un risc potențial de PD asociat cu acest triplet. În prezent, nu putem comenta nicio interacțiune moleculară/genetică/epigenetică care implică SNP-urile din tripletul GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) și, prin urmare, despre orice contribuție presupusă a acestui triplet la o sumă. a riscului de debut al PD.

În studiul nostru pilot, am folosit RF-ML pentru a evalua și interpreta datele noastre [37]. Avantajul major al analizei datelor RF-ML este dublu, după cum urmează: (1) permite cuantificarea capacității de discriminare a SNP-urilor între pacienții cu PD și martori [37] și (2) necesită dimensiuni mai mici ale eșantioanelor pentru evaluarea importanța discriminatorie a SNP-urilor individuale sau a combinațiilor lor [37]. Mai mult, RF-ML ocolește problema valorii p asociată adesea cu eșantioane mai mari, chiar și atunci când acestea sunt disponibile [56]. Ca și în raportul nostru anterior, niciunul dintre SNP-urile A1 testate nu s-a dovedit a avea puterea de a discrimina între pacienții cu PD și probandii non-PD din cohorta noastră (Tabelul 8). Astfel, putem presupune că niciunul dintre SNP-urile A1 testate nu este potrivit pentru a servi drept discriminator PD/non-PD în populația slovacă.

În ceea ce privește asocierea A1 rs708727 cu riscul modificat pentru PD, rezultatul analizei noastre RF-ML pare a fi, la prima vedere, contradictoriu (Tabelele 5 și 6 vs. Tabelul 8). Jakobsdottir et al. în regresia lor logistică și analizele curbei ROC au arătat că chiar și asociațiile genetice puternice nu garantează automat o discriminare eficientă între cazuri și controale [57]. În ciuda faptului că sunt clasificatori slabi, SNP-urile cu OR semnificativ ar putea fi foarte valoroase pentru stabilirea ipotezelor etiologice [57]. În cazul nostru, A1 SNP rs708727 nu are putere de clasificare în ceea ce privește PD, prin urmare, nu are nicio importanță clinică. Cu toate acestea, asocierea sa slabă, dar semnificativă, cu riscul modificat pentru PD ne-a permis să speculăm despre implicarea rs708727 în patobiologia PD într-un mod similar sau în același mod cu care este implicat în AD [27].

4. Materiale și Metode

4.1. Participanții la studiu (caracteristici de bază)

În total, 980 de probands au fost incluși în studiu (508 pacienți cu PD și 472 martori, care îndeplinesc criteriile de incluziune). Forma idiopatică a PD a fost diagnosticată de neurologi în cinci centre de diagnostic PD (în Martin, Bratislava, Trencin, Zvolen și Kosice) conform criteriilor de diagnosticare PD ale MDS (Movement Disorder Society). Toți pacienții au fost tratați cu terapie anti-PD standard. Vârsta medie a pacienților cu PD a fost de 68,4 ± 9,6 ani. Vârsta medie de debut a bolii a fost de 61,7 ± 10,7 ani. Cel mai tânăr caz a fost diagnosticat la vârsta de 34 de ani, iar cel mai vechi caz la 89 de ani. Grupul PD a fost format din 202 femei (F) și 306 bărbați (M) și astfel, raportul F:M a fost de 1:1,5.

Cohorta de control de probanți a constat din pacienți externi și interiori de la Clinica de Medicină și Toxicologie a Muncii (Spitalul Universitar Martin (UHM)) și Clinica de Neurologie (UHM). Doar acei pacienți care nu au fost diagnosticați anterior cu nicio boală neurodegenerativă și neuropsihiatrică, cum ar fi diabetul zaharat sau osteoporoza (toate bolile presupus asociate cu expresia alterată a A1 și dereglarea funcției A1), au fost înscriși în grupul de studiu de control. Vârsta medie a probelor de control a fost de 68,3 ± 11,6 ani. Grupul de control a fost format din 208 persoane de sex feminin și 264 de bărbați și astfel, raportul F:M a fost de 1:1,3 în grupul de control.

Sub-cohorta de pacienți cu PD, în care a fost secvențiată regiunea promotor A1, a constat din 96 de subiecți selectați aleatoriu. Raportul F:M a fost de 1:1,3 (42 de femei și 54 de bărbați). Vârsta medie a pacienților din sub-cohorta PD a fost de 67.{{10}} ± 9,5 ani. Subcohorta de control a fost formată din 41 de femei și 59 de bărbați, astfel încât raportul F:M a fost de 1:1,4. Vârsta medie a probelor din sub-cohorta de control a fost de 59,8 ± 5,0 ani.

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de etică de la Facultatea de Medicină Jessenius, Universitatea Comenius (JFM CU). Aprobarea a fost înregistrată sub ID: EK 66/2019. Toți participanții la studiu au semnat formulare de consimțământ informat.

4.2. Prelucrarea probelor

Probele de sânge au fost colectate în tuburi BD Vacutainer® tratate cu EDTA (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ SUA). ADN-ul genomic a fost izolat din probe de sânge proaspăt (UHM) sau congelat (alte centre PD) utilizând kitul Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation, Maddison, WI, SUA) conform protocolului producătorului. Probele de ADN izolate au fost depozitate la -80 ◦C.

4.3. Genotiparea

Genotiparea a fost efectuată pe 358 de probe PD și 352 de probe de control. Rezultatele acestor experimente au fost analizate împreună cu rezultatele raportate anterior de Cibulka și colab. [37]. SNP-urile rs11240569, rs708727 și rs823156 au fost analizate utilizând sondele de genotipare TaqMan® C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 și C_9238453_10/rscientific, Walrmot MA USA) în același mod ca cel raportat anterior [37].

4.4. Secvențierea Sanger

Regiunea promotor a fost împărțită în patru fragmente/ampliconi suprapuse, deoarece era prea lungă pentru o singură rulare de secvențiere. Înainte de a fi secvențiate, regiunile țintă au fost amplificate. Primer-urile au fost proiectate utilizând instrumentul online Primer3Plus [https:// primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (accesat la 3 mai 2018)]. Fiecare pereche de primeri a fost verificată pentru prezența mai multor produse de amplificare de către instrumentul online PCR UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (accesat pe 3 mai 2018)].

Primerii și programele PCR utilizate pentru amplificarea celor patru fragmente sunt rezumate în tabelele suplimentare S1 și S2. Compozițiile amestecurilor principale pentru fiecare fragment sunt rezumate în SA3. Fragmentele 3 și 4 au un conținut ridicat de nucleotide G și C (67,4% și, respectiv, 71,9%). Randamentul de reacție a fost crescut prin adăugarea de 10x GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Tartu, Estonia). Produsul PCR a fost purificat utilizând Gel NucleoSpinTM și un kit de curățare PCR (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Düren, Germania). În etapa următoare, produsul PCR purificat a fost diluat la o concentrație adecvată pentru pre-secvențierea PCR (SA4, SA5). În PCR-ul de pre-secvențiere au fost utilizați numai primeri înainte (fw). Amestecul de reacție a inclus și BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, SUA) și dideoxinucleotide.

Ca rezultat, am obținut un amestec de produse de diferite dimensiuni terminate cu dideoxinucleotide marcate cu fluorescență. Produsele au fost ulterior purificate prin utilizarea trusei de curățare a reacției de secvenție SigmaSpin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) conform protocolului producătorului. Un volum de 3 µL de produs purificat a fost transferat într-o placă de godeuri 96- împreună cu 12 µL de formamidă deionizată de înaltă calitate (Applied Biosystems, Waltham, MA, SUA). Amestecul a fost denaturat timp de 5 minute la 95 °C într-un termociclor. Fragmentele au fost separate pe 8-dispozitivul microcapilar ABI 3500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, SUA). Secvențele au fost exportate și vizualizate de software-ul Chromas (Technelysium Pty Ltd., South Brisbane, Australia). Fișierele FASTA au fost încărcate în BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) și aliniate la genomul uman de referință (versiunea GRCh38.p12).

Predicția site-urilor de legare a factorului de transcripție și a modificărilor acestora a fost efectuată de instrumentul online ConSite [disponibil la: http://consite.genereg.net/ (accesat la 3 septembrie 2020)] [38]. Au fost încărcate secvențe cu alela majoră și alela minoră și au fost generate spectre ale factorilor de transcripție (TF). Analiza a fost efectuată fără a pre-seta specificitatea minimă. Modificările profilurilor de legare a TF pe baza prezenței variantelor sunt rezumate în tabelul 2.

4.5. Analiza RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

Componentele amestecului de reacție și condițiile PCR ale PCR amplificate sunt rezumate în SA6 și SA7. Instrumentul online in silico NEBCutter 2.0 [http://nc2.neb.com/NEBcutter2 / (accesat pe 14 februarie 2020)] a fost folosit pentru a proiecta restricții ale ampliconilor. Următoarele enzime de restricție au fost alese pentru analiza RFLP: Hpy166II (detecția rs9438393), NIaIII (detecția rs56152218) și Bmrl (detecția rs61822602). Toate enzimele au fost achiziționate de la New England Biolabs. Pentru varianta rs144056491, nu am putut proiecta un experiment RFLP, deoarece nu era disponibilă nicio enzimă adecvată. După restricție, ne-am așteptat ca fragmentele rezumate în SA8 să formeze randamentul. După restricție, produsele au fost separate prin electroforeză pe gel de agaroză (NIaIII și Hpy166II 1% gel; BmrI 2% gel) și apoi vizualizate pe un instrument PharosFX (Bio-Rad Laboratories). Au fost determinate genotipurile pentru fiecare SNV.

4.6. Analiza datelor

Datele au fost explorate și analizate folosind R [R Core Team (2021); R: un limbaj și mediu pentru calculul statistic. R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria. URL https://www.R-project.org/, ver. 4.0.5 (2021-03-31)]. Un studiu de asociere genetică (GAS) și o analiză de putere au fost efectuate folosind bibliotecile R HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Explorarea markerilor genetici dialelici: pachetul HardyWeinberg. Journal of Statistical Software, 64(3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Andri Signorelli et al. (2021); DescTools: Instrumente pentru statistici descriptive. Versiunea pachetului R 0.99.41.], epitools [Tomas J. Aragon (2020); epitools: Instrumente de epidemiologie. Pachetul R versiunea 0.5-10.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Stephane Champely (2020); pwr: Funcții de bază pentru analiza puterii. Pachetul R versiunea 1.3-0. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] și un cod dezvoltat intern. Modelarea predictivă RandomForest a fost realizată cu biblioteca R randomForestSRC [Ishwaran H. și Kogalur UB (2021); Fast Unified RandomForests pentru supraviețuire, regresie și clasificare (RF-SRC), versiunea pachetului R 2.11.0.]. Datele au fost vizualizate de R library beeswarm [Aron Eklund (2021); beeswarm: The Bee Swarm Plot, o alternativă la Stripchart. Pachetul R versiunea 0.3.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru a testa ipoteza nulă de egalitate a vârstei medii de debut a populației pentru cele trei subpopulații de genotipuri pentru fiecare SNP. Constatările cu o valoare p sub 0,05 au fost considerate semnificative statistic.

5. Concluzii

În rezumat, datele noastre sugerează o asociere slabă, dar semnificativă a A1 SNP rs708727 cu PD în modelele genetice dominante și supradominante la o populație slovacă. Niciunul dintre celelalte SNP-uri A1 testate (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 și rs61822602) nu a fost asociat cu boala în niciunul dintre modelele genetice testate. Analizele RF-ML au identificat toate SNP-urile A1 testate ca fiind clasificatori/predictori slabi ai PD, astfel încât utilizarea lor în practica clinică ca markeri de diagnostic sau prognostic rămâne neglijabilă. Cu toate acestea, asocierea rs708727 cu PD ne-a permis să speculăm că alela minoră asociată riscului de PD (G > A) în rs708727 contribuie la debutul și progresia bolii prin perturbarea reglării epigenetice a expresiei PM20D1, mecanismul cunoscut că joacă un rol. în patobiologia AD. Această ipoteză ar trebui examinată în continuare pentru a face o afirmație concludentă. În plus, ar trebui elucidată o posibilă asociere între demența asociată PD și rs708727.

Contribuții ale autorului:

Conceptualizare, MK; metodologie, MK, MC, MG (Marian Grendar) și MB; software, MG (Marian Grendar); validare, MC, MB și MK; analiza formală, MK, MG (Marian Grendar), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS și MG (Milan Grofik); investigație, MC și MB; curatarea datelor, MC, MB, MG (Marian Grendar), MG (Milan Grofik), JN, VN și EK; scris — pregătire originală a proiectului, MK; scris—recenzie și editare, MC, MG (Marian Grendar) și ZP; vizualizare, MK, MC și MG (Marian Grendar); supraveghere, MK; administrarea proiectelor, MC, MK, MG (Milan Grofik), JN, JB, VH, VN, EK, MS și BV; achiziție de finanțare, MK Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțarea:

Această lucrare a fost susținută de Agenția Slovacă de Cercetare și Dezvoltare, numărul de grant APVV-19-0222, și de Agenția de Grant Științific a Ministerului Educației, Științei, Cercetării și Sportului din Republica Slovacă și de Academia Slovacă de Științe, numărul de grant VEGA 1/0554/19, ambele către MK

Declarația Comisiei de revizuire instituțională:

Studiul a fost aprobat de Comitetul de etică de la Facultatea de Medicină Jessenius, Universitatea Comenius (JFM CU). Avizul a fost înregistrat sub ID: EK 66/2019.

Declarație de consimțământ informat:

Consimțământul informat a fost obținut de la toți subiecții implicați în studiu.

Declarație de disponibilitate a datelor:

Setul de date complet este conținut în articol. Natura și amploarea datelor incluse permit o meta-analiză ulterioară. Orice informații referitoare la studiu sunt disponibile la cerere de la autorul corespunzător.

Mulțumiri:

Mulțumim tuturor participanților la studiu și membrilor familiei lor. Mulțumim și lui Martin Marak (JFM CU) pentru sprijinul tehnic competent al proiectului, lui Jan Radvanszky și Rastislav Hekel (ambele GENETON sro) pentru sfaturi utile cu privire la analizele promotorilor A1 și Theresei Jones pentru editarea lingvistică a documentului. manuscris.

Conflicte de interes:

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Referințe

1. Tatarkova, Z.; de Baaij, JHF; Grendar, M.; Aschenbach, JR; Racay, P.; Bos, C.; Sponder, G.; Hoenderop, JGJ; Röntgen, M.; Turcanova Koprusakova, M.; et al. Aportul alimentar de Mg2+ și schimbătorul de Na+/Mg2+ SLC41A1 influențează componentele energetice mitocondriale în cardiomiocitele murine. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 8221. [CrossRef] [PubMed]

2. Yamanaka, R.; Tabata, S.; Shindo, Y.; Hotta, K.; Suzuki, K.; Soga, T.; Oka, K. Homeostazia Mg2+ mitocondrială decide metabolismul energetic celular și vulnerabilitatea la stres. Sci. Rep. 2016, 6, 30027. [CrossRef] [PubMed]

3. Dudev, T.; Grauffel, C.; Lim, C. Cum se leagă cationii metalici nativi și străini ATP: Implicații pentru litiu ca agent terapeutic. Sci. Rep. 2017, 7, 42377. [CrossRef] [PubMed]

4. Kolisek, M.; Zsurka, G.; Samaj, J.; Weghuber, J.; Schweyen, RJ; Schweigel, M. Mrs2p este o componentă esențială a sistemului electroforetic major de influx de Mg2+ în mitocondrii. EMBO J. 2003, 22, 1235–1244. [CrossRef] [PubMed]

5. Schindl, R.; Weghuber, J.; Romanin, C.; Schweyen, RJ Mrs2p formează un canal selectiv Mg2+ cu conductanță ridicată în mitocondrii. Biophys. J. 2007, 93, 3872–3883. [CrossRef] [PubMed]

6. Kolisek, M.; Sponder, G.; Pilchova, I.; Cibulka, M.; Tatarkova, Z.; Werner, T.; Racay, P. Magnesium Extravaganza: Un compendiu critic al cercetărilor curente asupra transportatorilor celulari de Mg2+, alții decât TRPM6/7. Rev. Physiol. Biochim. Pharmacol. 2019, 176, 65–105. [CrossRef]

7. Kubota, T.; Shindo, Y.; Tokuno, K.; Komatsu, H.; Ogawa, H.; Apreciere.; Kitamura, Y.; Suzuki, K.; Oka, K. Mitocondriile sunt depozite intracelulare de magneziu: Investigare prin imagistica fluorescentă simultană în celulele PC12. Biochim. Biophys. Acta 2005, 1744, 19–28. [CrossRef]

8. Sponder, G.; Abdulhanan, N.; Fröhlich, N.; Mastrototaro, L.; Aschenbach, JR; Röntgen, M.; Pilchova, I.; Cibulka, M.; Racay, P.; Kolisek, M. Supraexprimarea schimbătorului de Na+/Mg2+ SLC41A1 atenuează semnalizarea pro-supraviețuire. Oncotarget 2017, 9, 5084–5104. [CrossRef] [PubMed]

9. Yamaguchi, H.; Wang, HG Protein kinaza PKB/Akt reglează supraviețuirea celulară și apoptoza prin inhibarea modificării conformaționale Bax. Oncogene 2001, 20, 7779–7786. [CrossRef]

10. Vauzou, D.; Vafeiadou, K.; Rice-Evans, C.; Williams, RJ; Spencer, JP Activarea căilor de semnalizare Akt și ERK1/2 pro-supraviețuire stă la baza efectelor anti-apoptotice ale flavanonelor în neuronii corticali. J. Neurochem. 2007, 103, 1355–1367. [CrossRef]

11. Muddapu, VR; Dharshini, SAP; Chakravarthy, VS; Gromiha, MM Boli neurodegenerative — Este deficiența metabolică cauza principală? Față. Neurosci. 2020, 14, 213. [CrossRef] [PubMed]

12. Pathak, D.; Berthet, A.; Nakamura, K. Eșecul energetic: contribuie la neurodegenerare? Ann. Neurol. 2013, 74, 506–516. [CrossRef] [PubMed]

13. Dharshini, SAP; Taguchi, YH; Gromiha, MM Investigarea crizei energetice din boala Alzheimer folosind studiul transcriptomului. Sci. Rep. 2019, 9, 18509. [CrossRef] [PubMed]

14. Crenguta, G.; Shirihai, OS Interacțiunea dintre dinamica mitocondrială și mitofagie. Antioxid. Semnal redox. 2011, 14, 1939–1951. [CrossRef] [PubMed]

15. Zhao, W.; Zhang, W.; Ma, H.; Yang, M. NIPA2 reglează funcția osteoblastelor prin modularea mitofagiei în osteoporoza diabetului de tip 2. Sci. Rep. 2020, 10, 3078. [CrossRef]
16. Nadler, MJ; Hermosura, MC; Inabe, K.; Perraud, AL; Zhu, Q.; Stokes, AJ; Kurosaki, T.; Kinet, JP; Penner, R.; Scharenberg, AM; et al. LTRPC7 este un Mg. Canal de cationi divalenti reglat de ATP necesar pentru viabilitatea celulară. Natura 2001, 411, 590–595. [CrossRef]

17. Kolisek, M.; Nestler, A.; Vormann, J.; Schweigel-Röntgen, M. Gena umană SLC41A1 codifică pentru schimbătorul Na+/Mg2+. A.m. J. Physiol. Fiziol celular. 2012, 302, C318–C326. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com