Analiza expresiei microARN după intervenția glutaminei în leziunile acute de ischemie-reperfuzie renală

Fundal.Ischemie-reperfuzieleziuni renale acute(I/R AKI) este aboală renală severăcu mortalitate și morbiditate ridicate. Acest studiu și-a propus să explorezemecanismul protector al glutaminei(GLN) împotriva I/R AKI.Metode. ThS-a stabilit modelul de șobolan I/R AKI și HEcolorarea țesutului renal și a creatininei sericeS-au efectuat detecția (SCr) și azotul ureic din sânge (BUN). MiARN-urile au fost secvențiate prin debit mare înmostre de țesut de rinichi de șobolan. MiARN-urile (DEmiR) exprimate diferențial între grupul I/R și grupul I/R + GLN au fost verificate și s-a efectuat analiza de îmbogățire pentru genele țintă ale DEmiR. Între timp, celulele HK-2 umane au fost cultivate și a fost stabilit un model I/R pentru a verifica expresia DEmiR.Rezultate.Comparativ cu grupul I/R, nivelurile SCr și BUN la fiecare moment au fost mai mici în grupul I/R + GLN. Degenerarea vacuolară a tubilor renali în grupul I/R + GLN a fost semnificativ redusă. În cele 104 DEmiR, am selectat miR-132-5p, miR- 205 și miR-615 ca miARN-uri cheie. Analiza KEGG a arătat că calea de semnalizare Notch, calea de semnalizare PI3K-Akt și calea de semnalizare cGMP au fost în principal legate de GLN împotriva I/R. qRT-PCR a verificat reglarea în jos a miR-205 în grupul I/R, în comparație cu sham și I/R în grupul GLN. Modelul I/R a fost stabilit cu celule HK-2, iar expresia miR- 132-5p și miR{-205 a fost scăzută.

Concluzie.GLN a redus AKI indusă de I/R. Au existat diferențe semnificative între expresia miARN în I/R după tratamentul GLN. Procesul GLN împotriva AKI indusă de I/R poate fi legat de calea de semnalizare Notch și PI3K-Akt.

EXTRACT DE CISTANCHE CU 25% ECHINACOSIDE SI 9% ACTEOSIDE PENTRU RINCHI

1. Introducere

Leziuni renale acute(AKI) se caracterizează prinfuncția renală acutăpierdere și afectează 13,3 milioane de oameni în fiecare an [1]. Printre o varietate de factori, renaleleziune de ischemie-reperfuzie(I/R) este una dintre cauzele care stau la baza AKI și o problemă inevitabilă întransplant de rinichi[2, 3]. AKI asociată I/R este asociată cu morbiditate și mortalitate ridicată și în prezent nu are un tratament eficient [4].

În practica clinică, AKI se manifestă prin acumularea de produse finale ale metabolismului azotului (uree și creatinina) și scăderea debitului de urină [5]. În plus, a existat afectarea concomitentă a celulelor epiteliale tubulare renale și a vaselor de sânge și un răspuns inflamator puternic [6, 7]. Studii recente au descoperit că glutamina, un medicament utilizat ca terapie nutrițională convențională pentru AKI, ar putea proteja rinichii prin reducerea stresului oxidativ [8, 9]. În anumite circumstanțe fiziologice, glutamina este utilizată pe scară largă ca combustibil metabolic major pentru rinichi și sistemul imunitar [10, 11]. Cu toate acestea, mecanismul său de protecție specific este încă în studiu.

microARN-urile (miARN), o moleculă mică foarte conservată de 21-25 nucleotide, au fost raportate a fi asociate cu I/R renal și AKI [12, 13]. miARN-urile pot juca un rol protector în I/R renal prin atenuarearăspuns inflamator[14]. Deși au fost descoperite efectele protectoare ale unor miARN asupra IRI renal, mecanismul de protecție rămâne neclar.

Până acum, puține studii s-au făcut asupra mecanismuluiprotectie renala mediata de glutaminala nivel de miARN. În acest studiu, am aplicat tehnica de secvențiere cu randament ridicat pentru a analiza expresia diferențială a miARN-urilor în I/R renal după intervenția cu glutamina. Am explorat în continuare mecanismul de protecție al glutaminei împotriva I/R renală la nivel de miARN.

2. Materiale și metode

2.1. Animal experimental.

Un total de 72 de șobolani masculi Sprague Dawley (SD) SPF, cântărind 180–260 g și cu vârsta cuprinsă între 90 și 120 de zile, au fost furnizați de Centrul pentru animale experimentale al Primului Spital Afiliat al Universității Medicale Xinjiang. Șobolanii au fost ținuți într-un mediu cu temperatură constantă cu o rație zilnică experimentală standardizată fără controlul aportului de apă. +ey au fost repartizați în mod egal aleatoriu în trei grupuri: grupul simulator, grupul I/R și grupul I/R + GLN. +e protocolul experimental a fost aprobat de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din +e primul spital afiliat al Universității Medicale din Xinjiang.

2.2. Stabilirea Modelului Animal.

Șobolanii SD au fost anesteziați prin injectare intraperitoneală cu pentobarbital de sodiu 2% (40 mg/kg). Grupul I/R: a fost făcută o incizie abdominală pe linia mediană și ambii rinichi au fost expuși, rinichiul drept a fost rezecat și artera renală stângă a fost clampată. După 45 de minute, clema vasculară a fost îndepărtată. Culoarea rinichiului a trecut de la roșu închis la roșu aprins, ceea ce implică faptul că cel mai mic a suferit un proces fiziopatologic I/R, șobolanii au fost observați timp de 2 ore după închiderea cavității abdominale. NS și, respectiv, glutamina (0,75 g/kg) au fost injectate folosind o micropompă din vena caudală la o viteză de 0,5 ml/min după finalizarea modelării. Grupa simulată: rinichiul drept a fost rezecat în același mod, iar pediculul renal stâng nu a fost clampat. Salină normală (NS) a fost injectată utilizând o micropompă din vena caudală la o viteză de 0,5 ml/min după finalizarea modelării.

2.3. Colectarea și testarea probelor.

Șase șobolani din fiecare grup au fost selectați aleatoriu la fiecare moment de timp (1 oră, 5 ore, 12 ore și 24 ore după modelare) și apoi șobolanii au fost uciși sub anestezie. +e aorta abdominală a fost expusă, iar sângele venos a fost recoltat cu o seringă. Serul a fost separat în mod obișnuit și a fost păstrat la frigider la -80 de grade. +e rinichii au fost rezecati rapid si apoi, o bucata de tesut a fost luata din rinichi bilaterali pentru a fi plasata in formaldehida neutra 10% si fixata peste noapte la 4 grade. Creatinina serică (SCr) și azotul ureic din sânge (BUN) au fost testate cu un analizor biochimic automat Beckman. Blocul de parafină a fost preparat din țesut renal fix printr-un proces de deshidratare, transparență, impregnare cu ceară și deshidratare prin încorporare. Blocurile de parafină au fost apoi tăiate în secțiuni și a fost efectuată colorarea.

2.4. Analiza de secvențiere de mare performanță.

ARN-ul total al probelor de țesut renal de șobolan din grupul I/R și grupul I/R + GLN a fost extras și evaluat pentru calitate. Conform procesului de construcție a bibliotecii de secvențiere a ARN-ului mic, ARN-ul total al țesutului renal purificat a fost transcris invers în ADNc. +ro, amplificarea PCR, purificarea și detectarea calității bibliotecii de ADNc au fost efectuate pentru a finaliza construcția bibliotecii de mostre de secvențiere. Apoi, am obținut datele originale ale fișierului FASTQ.

2.5. Analiza Bioinformatică.

Clean reads were classified and annotated from the FASTQ file. +e Rfam database, species reference transcripts, and repetitive sequence database were used to analyze the known miRNA annotations, miRNA prediction, and miRNA quantification. +e differentially expressed miRNAs (DEmiRs) were analyzed using the DESeq R package with |log2FoldChange|>2 și P < 0.05. Predicția genei țintă +e a fost efectuată folosind bazele de date RAID și, respectiv, miRanda. Analiza de îmbogățire a căilor Ontologiei genelor (GO) și KEGG a fost, de asemenea, efectuată pentru genele țintă folosind pachetul ClusterProfiler R. P < 0,05 a fost considerată o îmbogățire semnificativă.

2.6. Reacție cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (qRT-PCR).

Specimenele au fost colectate de lațesuturi de rinichi de șobolan24 de ore după modelare. ARN-ul total a fost extras și produsele cADN ale tuturor miARN-urilor au fost obținute folosind trusa de sinteză a cADN-ului miARN (Shenggong, Shanghai, China). Detectarea cantitativă a fluorescenței a fost efectuată utilizând un kit PCR cantitativ cu fluorescență miARN (Shenggong, Shanghai, China) cu 3 primeri specifici miARN (Tabelul 1). +e metoda de analiză cantitativă relativă (2-ΔΔCt) a fost utilizată pentru a calcula expresia relativă a miARN-ului țintă în fiecare grup de probe. +e expresia relativă a miARN în fiecare grup a fost calculată folosind expresia U6 în fiecare probă din fiecare grup ca referință.

2.7. Analize statistice.

Datele au fost analizate de SPSS19.0. Toate datele au fost exprimate ca medie ± abatere standard (media ± SD). +e t-test a fost utilizat pentru compararea perechilor între grupuri. P < 0.05 a indicat că diferența a fost semnificativă statistic.

3. Rezultate

3.1. Efectul glutaminei asupra funcției renale a șobolanilor după ischemie-reperfuzie.

Nivelurile SCr și BUN au fost examinate mai întâi în cele trei grupuri de șobolani (Figurile 1 (a) și 1 (b)). +e SCr și BUN au continuat să crească de la 1 la 24 de ore, atingând un vârf la 24 de ore în grupul I/R, care a fost semnificativ mai mare decât cei din grupul simulat (P < 0.{{11} }5). În grupul I/R + GLN, nivelurile SCr și BUN au fost crescute de la 1 oră la 12 ore, dar tendința de creștere a fost mai lentă decât cea din grupul I/R. Nivelurile SCr și BUN la fiecare moment au fost mai mici decât cele din grupul I/R (P < 0,05).

3.2. Modificări histologice în rinichii de șobolan.

În grupul simulat, după 24 de ore de intervenție chirurgicală, observația microscopică a evidențiat că unii tubuli renali din zona cortexului au fost dilatați, iar unele epitelii tubulare renale au prezentat edem și degenerare vacuolară și nu a existat nicio anomalie evidentă în glomeruli (Figura 2(a). )). În grupul I/R au dispărut marginile perie ale tubilor renali din zona corticală și zona de tranziție cortex-medulară, un număr mare de celule epiteliale tubulare renale au prezentat edem și degenerare vacuolară, în timp ce unele dintre ele au prezentat cariopicnoză, colorare roșie a citoplasmei, necroza de coagulare, abscizia și formarea gipsului

Figura 1: Modificări ale nivelurilor Scr (a) și BUN (b) ale șobolanilor la momente diferite din fiecare grup. ∗P < 0.05 comparativ cu grupul simulat; #P < 0,05 în comparație cu grupul I/R

Figura 2: Modificări histopatologice ale rinichilor de șobolan detectate prin colorarea HE. (a) Grupul simulat, (b) grupul I/R și (c) grupul I/R + GLN. Bar: 200×.

(Figura 2(b)). Nu a existat niciun semn de inflamație în interstițiu și nicio anomalie evidentă nu a fost observată în glomeruli. În grupul I/R + GLN, structura glomerulului a fost normală la microscop, unele celule epiteliale tubulare au fost umflate și au prezentat degenerare balonată, unele celule epiteliale tubulare au fost abcisate, unii tubuli au fost dilatați și s-a găsit o cantitate mică de ghips proteic. (Figura 2(c)).

3.3. Identificarea miARN-urilor exprimate diferențial.

Analiza statistică a fost efectuată pe miARN-urile exprimate diferențial, selectate din grupul I/R și grupul I/R + GLN. În comparație cu grupul I/R + GLN, un total de 104 miARN exprimate diferențiat semnificativ au fost eliminate în grupul I/R (Figura 3 (a)). Dintre aceștia, 76 au exprimat miARN reglat în sus, iar 28 au exprimat miARN reglat în jos (Figura 3 (b)). În plus, RAID și Miranda au fost utilizate pentru a efectua predicția genei țintă pentru miARN-urile exprimate în mod diferențial. Am găsit 436 de gene țintă de intersecție (Figura 3 (c)). +ro, am construit rețeaua de reglementare a genelor țintă miARN (Figura S1). Foarte important, am selectat miR-132-5p, miR-205 și miR{-615 în grupul I/R ca miARN-uri cheie pentru studii ulterioare. De asemenea, au existat 65 de gene țintă pentru aceste trei miARN (Figura 3 (d)). Conform rezultatelor detectării qRT-PCR în țesutul renal, nivelurile de expresie ale miR-132-5p, miR-205 și miR{-615 au fost scăzute în grupul I/R (Figura 4). ).

3.4. Funcțiile biologice ale genelor țintă.

Pentru a identifica mecanismele moleculare care stau la baza efectelor terapeutice ale GLN, am efectuat o analiză de îmbogățire a genelor țintă. În rezultatele GO (Figura 5 (a)), transducția semnalului intracelular, reglarea proliferării celulelor stem și răspunsul celular la hipoxia proceselor biologice (BP) au fost îmbogățite de gene țintă. În plus, calea de semnalizare Notch, calea de semnalizare PI3K-Akt și calea de semnalizare cGMP PKG a căilor KEGG au fost semnificativ îmbogățite (Figura 5 (b)). Interesant este că rno-miR-132-5p participă la calea cGMP-PKG prin țintirea lui Mylk.

Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

OBȚINEȚI EXTRACT DE CISTANCHE ORGANIC NATURAL CU 25% ECHINACOSIDE ȘI 9% ACTEOSIDE PENTRU INFECȚIA RINCHILOR