Efectele anti-îmbătrânire ale Piper Cambodianum P. Fourn. Extract de pe celulele fibroblastice dermice umane normale și o vindecare a rănilor

Fundal:

Îmbătrânirea pieliieste asociat cu factori de mediu, cum ar fi razele ultraviolete, poluarea aerului, gravitația și factorii genetici, toți putând duce la încrețirea pielii. Rapoartele anterioare sugerează că repararea rănilor este afectată de procesul de îmbătrânire și de strategiile de manipularevindecarea rănilor legată de vârstăsunt necesare pentru a stimula repararea.Obiectiv: Câteva extracte tradiționale de plante sunt binecunoscute pentru proprietățile lor de protecție și îngrijire a pielii.Extract de Cistanche Tubulosa(Extract de Cistanche), un membru al Piperacecae este o plantă găsită în Vietnam care ar putea avea proprietăți terapeutice. Prin urmare, efectele extractului de tulpină și frunze ale extractului de Cistanche asupraprocesul de îmbătrânireau fost investigate in vitro și in vivo.Metode: Extractul de extract de Cistanche dizolvat în metanol a fost investigat folosind Western blot, reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă cantitativă în timp real, citometrie în flux și teste de vindecare a rănilor celulare. Am evaluatefectul anti-îmbătrânire al extractului de Cistanchela șoareci folosind testul de vindecare a rănilor. Rezultatele au fost analizate prin testul t nepereche al lui Student; *P,0.05 și **P,0,01 au fost considerate a indica valori semnificative și, respectiv, foarte semnificative, în comparație cu controalele corespunzătoare. Rezultate: Extract de Cistanchetratamenta demonstrat activitate anti-îmbătrânire in vitro și in vivo. Analiza Western blot a celulelor fibroblastice dermice umane normale tratate cu extract de Cistanche a arătat acreșterea dependentă de doză a expresiei genelor matricei extracelulareprecum colagenul și elastina, darscăderea expresiei metaloproteinazei matricei genei de îmbătrânire-3. Reacția cantitativă a polimerazei în lanț a arătat că celulele tratate cu extract de Cistanche au prezentat o creștere dependentă de doză a nivelurilor de expresie a ARN mesager de colagen, elastina și hialuronan sintetaza-2 și niveluri de expresie scăzute ale genei de îmbătrânire ale metaloproteinazei matriceale-1. Extract de CistancheTratament anti-imbatranirea condus la scăderea producției de specii reactive de oxigen în celulele supuse iradierii ultraviolete. În plus, extractul de extract de Cistanche a arătat efecte pozitive de vindecare a rănilor la șoareci.Concluzie: Acest studiu a demonstrat căefectele anti-îmbătrânire și de vindecare a rănilor ale extractului de extract de Cistanche. Prin urmare, extract de Cistanche Extractreprezintă un nou agent terapeutic promițător pentru tratamentele anti-îmbătrânire și de vindecare a rănilor. 

Cuvinte cheie:Extract de Cistanche, anti îmbătrânire, vindecarea ranilor, Antioxidant, ROS, fibroblaste dermice umane normale

Faceți clic aici pentru a obține mai multe informații despre extractul de Cistanche pentru vânzare

Introducere

Pielea umană este formată din țesuturi epidermice, dermice și subcutanate. Epiderma este afectată negativ de factori abiotici1, iar îmbătrânirea implică modificări structurale, funcționale și biochimice.2 Îmbătrânirea pielii este asociată cu factori de mediu precum razele ultraviolete (UV), poluarea aerului, gravitația și factorii genetici,3 toate care poate duce la încrețirea pielii.4,5 Specii reactive de oxigen (ROS), inclusiv radical anion superoxid (⋅O2 −), peroxid de hidrogen (H2 O2 ), radical hidroxil (⋅OH), oxigen singlet (1 O2 ), lipide peroxizii (LOOH) și radicalii lor (LOO⋅) se formează în pielea expusă la UVA (320–400 nm) și UVB (290–320 nm). Acești factori induc îmbătrânirea pielii, fototoxicitatea, inflamația, formarea de tumori maligne și distrugerea membranelor celulare.6–8 Mai multe extracte tradiționale de plante au efecte binecunoscute pentru protecția și îngrijirea pielii. Piper cambodianum P. Fourn. (Extract de Cistanche), un membru al Piperacecae este o plantă găsită în Vietnam care ar putea avea proprietăți terapeutice, deoarece Piper betel Linn., care aparține aceleiași familii, este utilizat într-o varietate de decocturi pentru vindecarea rănilor, arsurilor, limfangitei și eczemă. În plus, sucul din frunza de Kammaru, care este o varietate de gândacul Piper, are capacitatea de a vindeca faringita, durerile abdominale și umflarea. Rădăcinile și fructele sale sunt bine cunoscute pentru utilizarea în tratamentul malariei și astmului.9,10 Acțiunea mecanică și funcția farmaceutică a extractului de Cistanche în protecția pielii nu au fost încă investigate în detaliu. Acest studiu a investigat potențialele efecte anti-îmbătrânire și de vindecare a rănilor ale extractului de tulpină și frunze ale extractului de Cistanche în celulele normale de fibroblast dermic uman (NHDF) și un model de șoarece de vindecare a rănilor.

Materiale și metode

Prepararea extractului de PFF

Extractul PFF a fost furnizat de Institutul de Cercetare din Coreea de Bioștiință și Biotehnologie (KRIBB). Materialul uscat sub formă de pulbere a fost extras în metil etanol 99,9 la sută timp de 3 zile cu SD-Ultrasonic Cleaner (Seul, Coreea de Sud) la 45 de grade timp de 72 de ore. Extractul a fost filtrat și concentrat la 45 de grade (Evaporator rotativ, N-1000SWD-EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Bohemya, NY, SUA) și uscat la 70 de grade timp de 24 de ore cu Modul spin 40 (Biotron Corporation, Alberta, Canada). Extractul de Cistanche extras a fost diluat cu apă pură în doze diferite pentru fiecare experiment.

Anticorpi și reactivi

Au fost utilizați următorii anticorpi: anti-elastină (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, SUA), metaloproteinază anti-matrice (MMP)-3 (Santa Cruz), kinază reglată de semnal anti-extracelular (ERK) (Santa Cruz), anti-colagen (Abcam, Cambridge, Marea Britanie), anti-actină (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, SUA), receptor anti-factor de necroză tumorală (TNFR)-1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA), receptor al factorului de creștere anti-epidermic (EGFR) (Thermo Fisher Scientific), anti-pp38 (Thr180/Tyr182; Cell Signaling Tech, Danvers, MA, SUA), anti-c-Jun ( Santa Cruz), anti-p53 (Cell Signaling Tech) și anticorpi secundari (anti-șoarece sau anti-iepure) de la Komabiotech (Seul, Coreea de Sud).

Cultură de celule

Celulele de fibroblaste dermice primare umane adulte normale (NHDF) au fost achiziționate de la ATCC (PCS-201-012, Manassas, VA, SUA). Celulele NHDF au fost menținute în culturi în mediu de vultur modificat de Dulbecco (1:1) care conține 10% ser fetal bovin și 1% antibiotic. Celulele NHDF au fost crescute la 37 de grade în CO2 umidificat cu 5 procente.

Analiza viabilității celulare

Celulele NHDF au fost placate la o densitate de 1,0×104 celule/godeu în plăci de cultură 96-godeuri pentru atașarea completă la 37 de grade cu 5% CO2 timp de 24 de ore. Celulele au fost apoi tratate cu extract de Cistanche în doze de 1, 10 și 50 pg/ml timp de 24 de ore. Mediul de cultură a fost apoi îndepărtat, urmat de incubare cu 90 mL de EXCyto (Lucigen Corporation, Middleton, WI, SUA) 10 µL la 37 de grade timp de 3 ore. Absorbția a fost măsurată la 450 nm (referit la 659 nm) cu un cititor de test imunoabsorbant legat de enzime (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, SUA). Rezultatele au fost exprimate ca viabilitatea relativă celulară a celulelor tratate față de cele ale martorilor.

Testul de vindecare a rănilor celulare (testul de migrare celulară)

Pentru testul de migrare celulară, monostraturile au fost zgâriate cu atenție folosind un vârf de pipetă de 10 μL. Celulele au fost apoi tratate cu Extract de Cistanche în doze de 1, 10 și 50 mg/mL timp de 24 de ore și apoi zona rănită a fost fotografiată.

Analiză prin reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă cantitativă în timp real

Analiza cantitativă de transcripție inversă-reacția în lanț a polimerazei (qRT-PCR) a fost efectuată așa cum s-a descris anterior.11,12 ARN-ul total a fost extras din probe de celule NHDF folosind kitul RNeasy (Qiagen NV, Venlo, Țările de Jos). ADN-ul complementar a fost sintetizat din ARN total cu sistemul SuperScript First-Strand Synthesis (Thermo Fisher Scientific) și primeri hexameri aleatori. Măsurarea PCR în timp real a ADN-urilor individuale complementare a fost efectuată utilizând colorant verde SYBR pentru a măsura formarea duplex a ADN-ului cu sistemul Thermo Fisher Scientific (StepOne Plus) și a fost normalizată la expresia gliceraldehidei 3-fosfat dehidrogenazei. Primerii și sondele utilizate în qRT-PCR în timp real sunt explicate în Tabelul 1.

Analiza Western blot

Analiza Western blot a fost efectuată așa cum s-a descris anterior. 13-15 celule NHDF au fost tratate cu extract de Cistanche Extract timp de 24 de ore, spălate de două ori în soluție salină tamponată cu fosfat rece cu gheață și omogenizate la 4 grade în tampon de liză care conține 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1% Triton X{{10}}, 3{00 mM NaCI, 0,1 mM fluorură de fenilmetilsulfonil, 0,1 mM vanadat de sodiu, 20 mM -glicerol fosfat, 2 mM ditiotreitol, 1 mM leupeptină și 10 mM p-nitrofenil fosfat. Omogenații au fost centrifugați la 15,000xg timp de 10 minute și supernatanții au fost utilizați pentru analiza Western blot. Concentrația de proteine ​​a lizatelor a fost măsurată prin testul proteinei albuminei serice bovine și 50 ug de lizate celulare au fost fracționate cu 10% gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă și tamponate pe membrană de difluorură de poliviniliden. După blocarea cu 5% lapte degresat tamponat cu Tris, conținând 0,02% Tween 20, membrana a fost testată cu anticorpii relevanți și vizualizată prin chemiluminiscență îmbunătățită, conform instrucțiunilor producătorului (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, SUA). Actina a fost folosită pentru controlul încărcării.

Tabelul 1 Set de primeri pentru PCR în timp real

Analiza ROS

Celulele NHDF au fost placate și incubate la o densitate de 1,0×106 celule/godeu în plăci de cultură cu șase godeuri timp de 24 de ore. A doua zi, celulele au fost iradiate cu UV la 40 J timp de 180 de secunde cu UV Crosslinker (Vilber Loirmat, Eberhardzell, Germania), netratate și tratate cu extracte de Cistanche Extract timp de 24 de ore. Celulele au fost apoi spălate și colorate cu 5 mM CM-H2 DCFDA (Thermo Fisher Scientific) în soluție echilibrată de sare Hank, incubate la 37 de grade timp de 30 de minute. Citometrul de flux FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA) a fost utilizat pentru măsurarea activității H2O2, folosind un filtru de emisie de 532 nm. Cel puțin 10,000 celule au fost analizate în fiecare dintre cele trei experimente independente.

Tratamente de vindecare a rănilor cu șoareci

Șoarecii masculi C57Bl/6 (în vârstă de 7 săptămâni, n=3) de la Jungang Animal Company (Seul, Coreea) au fost mai întâi anesteziați, iar zona desemnată pentru rănire a fost rasă. Pe pielea dorsală au fost create patru răni de excizie de 0.25 cm2 (0}.5×{0.5 cm) (martor negativ și 1, 10, 50 µg/mL extract de extract de Cistanche) ). Tratamentul pielii rănite cu extracte din Extract de Cistanche s-a făcut cu un tampon de bumbac timp de 4 zile (o dată pe zi). Șoarecii au fost găzduiți în cuști standard pentru șoareci, cu un ciclu de lumină/întuneric de 12-oră. Protocolul animal din studiul nostru a fost aprobat de comitetul de îngrijire și etică a animalelor al Universității Naționale Chungnam. Toate procedurile de manipulare a animalelor au fost efectuate conform Ghidului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator al Institutului Național de Sănătate din Coreea și au urmat liniile directoare ale Legii privind bunăstarea animalelor.

Analiza statistică Cuantificarea analizei Western blot a fost efectuată utilizând programul ImageJ (NIH, Bethesda, MD, SUA). Datele sunt prezentate ca medie ± SD. Rezultatele au fost analizate prin testul t neîmperecheat al lui Stu dent (software SPSS versiunea 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, SUA). *P,0.05 a fost considerat semnificativ, iar **P,0,01 a fost foarte semnificativ în comparație cu valorile de control corespunzătoare.

Rezultate

Viabilitatea celulară și efectele de vindecare a rănilor ale extractului de extract de Cistanche în celulele NHDF

Extractul de Cistanche a fost extras din frunza de Kammaru (Figura 1A). Celulele NHDF au fost tratate cu extract de extract de Cistanche în doze de 1, 10 și 50 ug/mL timp de 24 de ore. Celulele tratate cu extract de extract de Cistanche în doze de 0, 10 și 50 pg/mL nu au prezentat niciun efect asupra viabilității celulare în comparație cu celulele martor netratate (Figura 1B). Într-un test de vindecare a rănilor celulare, monostraturile de celule confluente au fost rănite prin provocarea unei zgârieturi și apoi au fost tratate cu extracte de extract de Cistanche la concentrații de la 1 la 50 pg/mL timp de 24 de ore. Celulele tratate cu extract de Cistanche au prezentat o reparare îmbunătățită a zonei zgâriate într-o manieră dependentă de doză (Figurile 1C și D).

Niveluri îmbunătățite de expresie a genei matricei extracelulare în celulele NHDF tratate cu extract de Cistanche

Colagenul este proteina structurală majoră prezentă în spațiul extracelular al diferitelor țesuturi conjunctive la animale.16 Elastină este o proteină elastică a țesutului conjunctiv care ajută la menținerea formei țesutului după întindere sau contractare, asigurându-se că țesuturile revin la poziția inițială. Hialuronanul sau acidul hialuronic (HA) este o componentă a matricei extracelulare (ECM) implicată în lubrifierea articulațiilor și în umplerea spațiului prin care celulele pot migra. În timpul vindecării rănilor și al reparării țesuturilor, HA oferă un cadru pentru fibroblaste. HAS-2 este o hialuronan sintază (HAS) nou identificată. După tratamentul cu diferite doze de extract de extract de Cistanche timp de 24 de ore, genele ECM, cum ar fi colagenul, elastina și nivelurile de expresie HAS-2 au crescut semnificativ într-o manieră dependentă de doză. MMP-1 codificată de gena MMP1 la om este cunoscută ca o colagenază interstițială și fibroblastică.16–18 MMP-urile sunt implicate în defalcarea ECM în procesele fiziologice normale și în remodelarea țesuturilor, iar MMP-1 se rupe în mod specific colagenul interstițial de tip I, II și III. Am demonstrat că nivelul de ARN mesager al MMP-1 a fost semnificativ scăzut în celulele tratate cu extract de Cistanche într-o manieră dependentă de doză (Figura 2).

Figura 1 Viabilitatea celulară și testele de vindecare a rănilor. Note: Cistanche Extract frunze și imagine tulpină. (A) Extractul de Cistanche aplicat la 1 și 10 ug/mL nu a arătat nicio citotoxicitate în testul EXCyto folosind celule NHDF. (B) Testul de vindecare a rănilor celulare a fost fotografiat la 24 de ore după zgârierea monostratului celular și tratarea cu extract de extract de Cistanche la dozele indicate. (C) Odată ce celulele au ajuns la confluență, s-a făcut o singură rană în centrul monostratului folosind un vârf de pipetă de 10 ml, iar celulele au fost tratate cu concentrația indicată de extracte de extract de Cistanche. După o incubare de 24-oră, a fost făcută o fotografie la mărire ×10 la microscop. (D) Imaginile fotografice de la (C) într-o serie de doze au fost analizate pentru zona golului. Rezultatele sunt prezentate ca medie ± abatere standard a trei experimente independente. **P, 0,01. Abrevieri: Conc, concentrare; NHDF, fibroblast dermic uman normal; Extract de Cistanche, Piper cambodianum P. Fourn.

Expresie îmbunătățită a proteinei ECM în celulele NHDF tratate cu extract de Cistanche

Extractele proteice ale celulelor netratate sau tratate cu extract de Cistanche au fost analizate prin analiză Western blot. Celulele tratate cu extract de Cistanche au prezentat niveluri crescute de proteine ​​​​de colagen și elastină în comparație cu martorii netratate (Figura 3). Calea de semnalizare ERK reglează expresia genei de colagen de tip I în fibroblastele umane.17 Datele noastre au arătat că nivelurile de proteine ​​ale ERK au fost îmbunătățite semnificativ, iar enzima colagenază interstițială MMP-3 a fost reglată în mod semnificativ de extractul de extract de Cistanche într-o doză dependentă. mod (Figura 3). Nivelurile de ARN mesager de colagen și elastina au fost corelate cu modificările nivelurilor lor de proteine. Aceste rezultate au sugerat că efectele anti-îmbătrânire ale extractului de Cistanche asupra celulelor NHDF sunt legate de reglarea translațională și transcripțională a moleculelor implicate în ECM.

Figura 2 Nivelul expresiei genei ECM prin q-PCR. Note: ARN-urile din celulele netratate sau tratate cu extract de Cistanche au fost analizate prin q-PCR în timp real cu (A) colagen-, (B) elastina-, (C) hialuronan sintază (HAS) -2 și (D) ) primeri specifici metaloproteinazei de matrice (MMP)-1-. Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SD a trei experimente independente. *P,0.05, **P,0,01. Abrevieri: Conc, concentrare; ECM, matrice extracelulară; HAS, hialuronan sintază; MMP, metaloproteinaza matricei; ARNm, ARN mesager; NHDF, fibroblast dermic uman normal; Extract de Cistanche, Piper cambodianum P. Fourn.; q-PCR, reacție cantitativă în lanț a polimerazei; ARN, acid ribonucleic; SD, abatere standard.