Factori funcționali anti-îmbătrânire și mecanism de Cistanche Deserticola

[Abstract] Obiectiv: Pentru a explorafactori funcționali anti-îmbătrânireși mecanismul substanței comestibile și medicinaleCistanche deserticolabazată pe farmacologia de rețea șiin vivoexperimente ale organismului modelCaenorhabditis elegans. Metode: Țintele potențiale ale componentelor majore înC. deserticola au fost prezise de baza de date și de analiză farmacologică a sistemelor de medicină chineză tradițională (TCMSP), SwissTargetPrediction, GeneCards, online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) și alte baze de date. Țintele prezise au fost introduse în platforma de analiză a rețelei STRING pentru a obține rețeaua de interacțiune proteină-proteină (PPI) a componentelor active și a țintelor bolii, astfel încât să se elimine țintele de bază. Analiza de îmbogățire a căilor Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a fost utilizată pentru a prezice și analiza căile de acțiune, iar rețeaua de căi țintă-componentă-activă a medicamentului a fost construită de Cytoscape.C. elegansa fost împărțit într-un grup alb șiC. deserticolagrupuri cu concentrații diferite. Durata de viață, capacitatea de reproducere și capacitatea de exercițiuC. elegansau fost observate direct. Activitățile superoxid dismutazei (SOD), catalazei (CAT), glutation peroxidazei (GSH-Px) și conținutul de malondialdehidă (MDA) și specii reactive de oxigen (ROS) înC. elegansau fost determinate prin testul trusei. Reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (qRT PCR) a fost utilizată pentru a determina expresia genelor legate de durata de viață și modificarea capacității de stres înC. elegans. Rezultate: Pot acționa factorii funcționali potențiali75ținte legate de îmbătrânire și8proteinele țintă de bază, inclusiv proteina de șoc termic HSP90- (HSP90AA1), receptorul de estrogen (VSH1), GTPază HRs (HRAS), protrombină (F2), metaloproteinaze de matrice-2 (MMP2), hexokinaza-2 (HK2), zaharază-izomaltaza (SI) și maltază-glucoamilază (MGAM), au fost eliminate prin analiza topologică. Analiza KEGG a arătat că Cistanche deserticola ar putea interfera cu27căi care includ calea de semnalizare a estrogenului, calea de semnalizare a cancerului, calea de semnalizare GnRH și calea de semnalizare a insulinei pentru a întârzia îmbătrânirea.Cistanche deserticolapoate prelungi semnificativ timpul mediu de supraviețuire și poate îmbunătăți capacitatea de stres oxidativC. elegans, sporesc activitățile SOD, CAT și GSH-Px și reduc acumularea de ROS și MDA și expresiadaf-2şivârsta-1au fost scăzute, în timp ce expresia luidaf-16și genele țintă din aval (gazon-3, mtl-1, Gst-4,ctl-1şictl-2) au fost majorate, precum șiskn-1și genele legate de șocul termic (hsf-1, hsp-16.1şihsp-16.2). Concluzie: Farmacologia de rețea este aplicată pentru a explica mecanismul posibil alC. deserticolaîn anti-îmbătrânire și a dovedit căC. deserticolapoate prelungi durata de viață aC. elegansși sporește capacitatea anti-stres. Mecanismul poate fi legat de inhibarea căii de semnalizare a insulinei și de activarea factorilor de transcripție din aval.daf-16și genele legate de șocul termic, sporind astfel capacitatea de stres oxidativ aC. elegans.

Cuvinte cheie:Cistanche deserticola YC Ma; anti-îmbătrânire; factori funcționali; mecanism; stresul oxidativ

EXTRACT DE CISTANCHE CU 75% GLICOZID

Cistanche deserticola YC Maeste un prețios material medicinal tradițional chinezesc în țara mea. Este cunoscut sub numele de „Ginsengul din deșert”. A fost înregistrată pentru prima dată în „Shen Nong’s Materia Medica” și este listată ca clasa superioară. Are gust dulce, sărat, cald în natură și revine la meridianele rinichilor și intestinului gros. Medicina tradițională chineză consideră că are efecte de hrănire a rinichilor yang, de completare a esenței și a sângelui și de hidratare a intestinelor și laxativ[1]

. În 2018, Cistanche deserticola (deșertul) a fost inclusă în „Catalogul de substanțe tradiționale atât alimentare, cât și materiale medicinale chinezești” [2], iar valoarea sa în dezvoltarea în produse de sănătate a fost recunoscută. Potrivit statisticilor, frecvența Cistanche deserticola în rețetele anti-îmbătrânire și de prelungire a vieții este a doua după ginseng [3]. Cercetările farmacologice moderne arată că Cistanche deserticola are efecte semnificative antioxidante, anti-îmbătrânire, anti-oboseală, îmbunătățire a memoriei și alte efecte [4], dar factorii săi funcționali și mecanismul anti-îmbătrânire sunt încă neclari. Caenorhabditis elegans (denumit în continuare nematod) este un organism multicelular cu un fundal genetic clar, o durată de viață relativ scurtă, reproducere rapidă și cultură ușoară. Pe măsură ce durata sa de viață crește, prezintă un fenotip de îmbătrânire similar cu cel al oamenilor. Genele, proteinele și căile de semnalizare ale C. elegans sunt foarte conservate la oameni.

Are 60% până la 80% omologie cu genele umane. În ultimii ani, nematozii au fost utilizați pe scară largă în cercetarea anti-îmbătrânire a medicinei tradiționale chineze și a medicinei naturiste [5]. Acest studiu folosește metode de farmacologie de rețea pentru a prezice ingredientele active, țintele și căile de semnalizare ale Cistanche deserticola în întârzierea îmbătrânirii; folosind nematozi ca organisme model, prin observarea duratei de viață a acestora, reproducere și alți indicatori generali, se măsoară modificările stresului oxidativ, capacitatea de efort și relația lor cu durata de viață. informații pentru sănătatea conexe

Oferiți referințe pentru dezvoltarea și aplicarea produselor de sănătate.

1 Material

1. 1 Instrumente

Microscop stereo SMZ-168 (compania Motic); Microscop cu fluorescență cu contrast de fază inversată CKX41 (compania Olympus); Cititor de microplăci Multiskan FC (compania științifică Thermo Fisher); Amplificator de genă pentru reacția în lanț a polimerazei Mycycler (PCR), instrument PCR cantitativ cu fluorescență MJ Mini™ (Compania Bio-Rad).

1. 2 Testează medicamentul

Cistanche deserticola a fost colectată de la baza de plantare Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP) din județul Yutian, Xinjiang. Acesta a fost identificat de cercetătorul Zhang Tiejun de la Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co., Ltd. ca Cistanche deserticola YC Ma; Ester al acidului dietil 2',7'-diclorodihidrofluoresceină (DCFH DA), 2% NaN3 (Sigma Company); Reactiv Trizol, kit de sinteză ADNc, Kit SYBR Green (Takara Bioengineering Co., Ltd.); kit de superoxid dismutază (SOD), kit de catalază (CAT), kit de glutation peroxidază (GSH Px), kit de malondialdehidă (MDA) (Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.); reacție cantitativă de fluorescență în lanț a polimerazei (qRT PCR) Primerii necesari au fost sintetizați de Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd., iar secvențele de primer sunt prezentate în tabelul 1.

1.3 Nematode

Cele 10 tipuri genetice diferite de nematozi utilizate în experiment au fost toate de la Centrul de Genetică Caenorhabditis. Informațiile detaliate sunt prezentate în Tabelul 2.

2 Metoda

2.1 Screeningul factorilor funcționali și țintele Cistanche deserticola

Prin revizuirea literaturii de specialitate și combinând caracterizarea anterioară a acestui grup de cercetare a grupului de material de Cistanche deserticola, principalele componente chimice și componente sanguine au fost eliminate [{{0}}]. Desenați structura compusului în software-ul ChemDraw 19.0, introduceți-o în baza de date SwissTargetPrediction (http://new.swisstargetprediction.ch/) și utilizați metoda de potrivire inversă a farmacoforului pentru a obține rezultate de screening virtual. În același timp, a fost utilizată baza de date și platformă de analiză farmacologică a sistemului de medicină tradițională chineză (TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php). Utilizați funcția de căutare UniProtKB în baza de date UniProt (http://www.uniprot.org/) și Reviewed

Swiss-Prot filtrează proteinele, limitează specia la „umană” și corectează proteina țintă a compusului la numele genei. Integrați rezultatele țintă ale celor două baze de date pentru a obține o bibliotecă țintă potențială de compuși.

2.2 Analiza predictivă a țintelor legate de îmbătrânire

Utilizați bazele de date GeneCards (https://www.genecards.org/) și OMIM (https://omim.org/) pentru a căuta cu cuvintele cheie „vechi, senil, decrepit, senescență, slab, caducitate”, unde GeneCards cu au fost verificate un scor mai mare sau egal cu 10%, rezultatele celor două baze de date au fost fuzionate, gene duplicate au fost eliminate și ținte legate de îmbătrânire au fost în cele din urmă obținute. Apoi combinați țintele factorilor funcționali de la punctul 2.1 cu țintele legate de îmbătrânire menționate mai sus, luați intersecția și desenați o diagramă Venn.

2.3 Construirea rețelei de interacțiune proteină-proteină (PPI).

Introduceți ținta de intersecție obținută în platforma de date STRING 11.5 (http://string-db.org/), limitați specia la „Homo sapiens”, cel mai înalt nivel de încredere al scorului de interacțiune este 0.900, și obțineți rețeaua PPI. Salvați datele în format .TSV și importați-le în Cytoscope

3. 8.0 software, ajustați dimensiunea nodului și adâncimea culorii cu valoarea gradului pentru a obține rețeaua PPI de ingrediente active Cistanche deserticola și ținte de boală. Punctele ai căror trei parametri de grad, distanță și apropiere au fost toți mai mari decât mediana au fost selectate ca ținte de bază și au fost obținute un total de 8 ținte de bază după screening.

2. 4 Bioanaliza Ontologiei Genelor (GO) și Genele și Genele Kyoto

Analiza de îmbogățire a căii Encyclopedia of Groups (KEGG) utilizează baza de date OmicsBean (http://www.omicsbean.cn/login/) pentru a efectua analiza funcțională GO și analiza de îmbogățire a căii KEGG pe țintele intersecției, sortați în funcție de valoarea P, și Analizați căile rezultate.

2.5 Materiale medicinale-componente-tinte-constructia retelei de trasee

Importați materiale medicinale, componente, ținte și căi în software-ul Cytoscope 3.8.0 pentru a construi o rețea de materiale medicinale Cistanche deserticola-componentă-țintă-căi.

2.6 Cultura de nematozi

Nematodele au fost cultivate la 20 grade folosind mediu NGM (conținând 0,750 g NaCl, 0,625 g triptonă și 4,250 g agar în 250 ml apă dublu distilată). Escherichia coli OP50 sterilizată (65 grade, 45 min) a fost utilizată ca sursă de hrană și a fost răspândită uniform pe suprafața mediului de cultură NGM. Utilizați soluție de liză (5% NaClO, 5 mol·L–1 NaOH) pentru a sincroniza nematozii și cultivați nematozii sincronizați la stadiul L4 într-un incubator de 20 de grade. Nematozii din stadiul L4 au fost selectați aleatoriu și împărțiți în grupul de control (mediu NGM) și grupuri de administrare Cistanche deserticola cu diferite concentrații de masă pentru experimente.

2.7 Prepararea medicamentelor

Se ia 10 g de material medicinal Cistanche deserticola, se adaugă apă distilată conform raportului material-lichid de 1:10, se refluxează și se extrage de două ori, 2 ore de fiecare dată, se combină extractele de apă, se filtrează și se concentrează până la uscare sub presiune redusă. Utilizați apă distilată sterilă pentru a prepara o soluție mamă cu o concentrație de masă de 50 mg·mL–1 (pe baza cantității de medicament brut). Utilizați mediu de cultură NGM pentru a prepara soluții cu concentrații de masă finale de 0, 25, 50, 75, 100, 200 și 500 ug·mL–1 pentru utilizare ulterioară.

2.8 Test de toxicitate

Nematozii N2 au fost transferați în vase Petri care conțineau diferite concentrații de masă de Cistanche deserticola (0, 25, 5{0, 100, 200, 500 ug·mL–1), 100 în fiecare grup. Ziua de administrare a fost socotită drept ziua 0. Schimbați mediul care conține medicament proaspăt în fiecare zi și înregistrați moartea nematozilor pentru a obține intervalul de dozare sigur de Cistanche deserticola.

2.9 Experiment de stres

Nematozii N2 au fost transferați în celule care conțineau diferite concentrații de masă de Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL–1

) în vasul Petri, 100 în fiecare grup. Ziua administrării medicamentului a fost socotită ca fiind ziua 0. Mediul de cultură proaspăt care conţine medicament a fost înlocuit în fiecare zi. Un experiment de stres a fost efectuat în a 7-a zi de administrare a medicamentului. În experimentul de stres oxidativ, nematozii din fiecare grup au fost transferați în mediu NGM (s-au adăugat 10 μL de 30% H2O2 la fiecare 10 ml de mediu NGM), iar supraviețuirea nematozilor a fost înregistrată la fiecare 30 de minute. În experimentul de stres termic, nematozii au fost expuși continuu la 35 de grade și cultivați, iar starea de supraviețuire a nematozilor a fost înregistrată la fiecare 2 ore.

2. 10 Experiment de îndoire a corpului

Luați nematozi N2, grupați-i și administrați aceleași tratamente ca în 2.9. În a 3-a și a 7-a zi după administrarea medicamentului, a fost efectuat un experiment de îndoire a corpului. Au fost prelevați 20 de nematozi din fiecare grup și a fost detectat și înregistrat numărul de îndoiri ale corpului nematozilor în 30 de secunde.

2. 11 Experimentul pompei faringiene

Luați nematozi N2, grupați și administrați-i în aceleași condiții ca 2.9, puneți 1 nematod în fiecare vas Petri și setați 5 paralele pentru fiecare concentrație de masă. Observați sub un stereomicroscop în zilele 0, 3 și 7 de administrare. Frecvența de înghițire a nematodelor a fost observată timp de 60 s de fiecare dată și a fost înregistrat numărul de pompe faringiene.

2.12 Experiment de reproducere

Luați nematozii N2 în stadiul L1 și plasați-i în mediul medicament-medicament și cultivați-i până la stadiul L4. Apoi, transferați-le într-un mediu nou care conține medicamente cu diferite concentrații de masă în fiecare zi și măsurați numărul de ouă depuse de nematozi. Plăcile vechi care conţin ouă sunt aşezate după cultură timp de 48 de ore la 20 de grade, s-a determinat numărul descendenţilor. Fiecare placă Petri conține 1 nematod și 5 paralele sunt stabilite pentru fiecare concentrație de masă.

2.13 Determinarea acumulării de lipofuscină

Luați nematozi N2, grupați și administrați aceleași tratamente ca în 2.9, cu 100 de nematozi în fiecare grup. Experimentele de măsurare a lipofuscinei au fost efectuate în ziua a 7-a și a 11-a de administrare a medicamentului. 35 de nematozi au fost selectați aleatoriu și plasați pe foi de agaroză 2%, anesteziați cu 2% NaN3 și au folosit un microscop cu fluorescență (lungimea de undă a luminii de excitație a fost de 360~370 nm, iar lumina emisă (lungime de undă: 420~460 nm) Observați albastrul autofluorescență în nematod și utilizați software-ul imageJ 1.51 pentru a cuantifica intensitatea fluorescenței.

2. 14 Determinarea conținutului de MDA, ROS și a activității enzimelor antioxidante

Luați nematozi N2, grupați și administrați aceleași tratamente ca în 2.9, cu 100 nematozi în fiecare grup. În a 7-a zi după administrare, nematozii de pe mediul de cultură al fiecărui grup au fost spălați cu soluție de clorură de sodiu 0,9% și colectați într-un tub de centrifugă de 1,5 ml, omogenizați pe gheață și centrifugați la 3000 r·min{{ 10}} timp de 10 minute (raza centrifugă 42,5 mm), luați supernatantul după centrifugare și utilizați un kit pentru a măsura activitățile conținutului de SOD, CAT, GSH-Px și MDA. În experimentul de determinare a ROS, nematozii au fost spălați de trei ori cu tampon M9, plasați într-o soluție DCFH-DA cu o concentrație finală de 10 μmol·L–1 și incubați la 37 de grade în întuneric timp de 20 de minute, agitând la fiecare 5. min. Apoi se spală de două ori cu tampon M9 și se așează nematozii pe o lamă de sticlă. Faceți fotografii folosind un microscop cu fluorescență (lungime de undă a luminii de excitare 485 nm, lungime de undă a luminii de emisie 520 nm) și utilizați software-ul ImageJ 1.51 pentru a evalua intensitatea relativă a fluorescenței.

2. 15 Factor de accelerare a dezintegrarii-16 (DAF-16), translocarea nucleară a SKN-1 și SOD-3, glutation S-transferaza-4 (GST{{ 8}}), proteina de șoc termic-16. 2 (HSP -16. 2) Vizualizarea utilizând nematozi transgenici TJ356 și, respectiv, LG333 pentru experimentele de translocare nucleară a proteinei DAF{-16 și SKN-1.

Nematozii transgenici CF1553, CL2166 și TJ375 au fost utilizați pentru a determina expresia proteinelor SOD-3, GST-4 și HSP-16.2. Gruparea și administrarea sunt aceleași cu cele de la 2.9. În a 7-a zi după administrarea medicamentului, a fost folosit un microscop cu fluorescență pentru a fotografia nematozi din fiecare grup și a fost folosit software-ul ImageJ 1.51 pentru a cuantifica intensitatea fluorescenței GFP.

2. 16 Determinarea duratei de viață a nematodelor mutante

Experimentele au fost efectuate folosind nematozi CF1038, EU1, PS3551 și, respectiv, DA1116 și au fost împărțite în grupul de control și grupul de administrare Cistanche deserticola 75 ug·mL–1. Rata de supraviețuire a nematozilor din fiecare grup a fost numărată în fiecare zi. 2. 17 experiment qRT-PCR: nematozii N2 din stadiul L4 au fost transferați în mediu de cultură NGM (conținând 150 μmol·L–1 pentfluorouracil) care conține diferite concentrații de masă de Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL–1), 20 Se incubează la grad timp de 6 zile. ARN-ul total din nematozi a fost extras folosind metoda Trizol și transcris invers în ADNc pentru cuantificarea ARNm. Datele au fost procesate folosind metoda 2–ΔΔCt, iar act-1 a fost folosit ca genă de referință internă.

2. 18 Analiza datelor

Pentru analiza statistică a fost folosit software-ul SPSS 19.0, iar datele sunt exprimate ca (-x ± s). Diferențele dintre grupuri au fost analizate prin ANOVA unidirecțional și P<0.05 was considered a statistically significant difference.

3. Rezultat

3.1 Potențiale ingrediente active și ținte ale Cistanche deserticola

Prin revizuirea literaturii și combinând cu cercetările anterioare ale acestui grup de cercetare, 12 componente chimice, inclusiv glicozide feniletanoide, iridoide și lignani, au fost selectate ca compuși țintă pentru cercetarea farmacologică de rețea. Informațiile specifice sunt prezentate în Tabelul 3. După eliminarea duplicatelor din baza de date, s-au obținut un total de 86 ținte pentru 12 ingrediente active potențiale.