Efectele antimelanogeneze ale extractului de frunze și ale fitochimicelor din măslinul Ceylon (Elaeocarpus Serratus) în modelul de pește-zebră
Mar 23, 2022
A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Chi-Ya Huang 1, I-Hsuan Liu 2, Xiang-Zhe Huang 1, Hui-Jen Chen 1, Shang-Tzen Chang 1, Mei-Ling Chang 3, Yu-Tung Ho 1 și Hui-Ting Chang 1,*
Abstract:Themelanogenezaefect de inhibiție la peștele-zebră (Danio rerio) șiantitirozinazaactivitatea etanoliculuiextrageși fitochimicele sale din frunzele de măslin Ceylon (Elaeocarpus serratus Linn.) au fost investigate în acest studiu. Dintre extractul de frunze și cele patru fracții solubile, fracția solubilă în acetat de etil prezintă cea mai bună antitirozinază șiantimelanogenezaActivități. Un acid fenolic, acid gallica, și două flavonoide, miricetina, și înseamnă staniu, sunt izolate din subfracțiile active prin izolarea ghidată de biotest; structurile lor sunt elucidate pe baza analizelor spectroscopice 1D și 2D RMN, FTIR, UV și MS. Acești compuși au semnificativeantitirozinazaactivitate indiferent dacă se utilizează L-tirozină sau L-DOPA ca substrat; mearnsentin prezintă activitatea optimă. În investigația enzimechinetică, atât acidul galic, cât și mearnsetina sunt inhibitori de tip competitiv împotriva tirozinazei ciupercilor, iar miricetina acționează ca un tip mixt.tirozinazainhibitor. Frunzeextrageși fracția solubilă a acetatului de etil prezintă performanțe eficiente în inhibarea formării melaninei la embrionii de pește-zebră. Mearnsetin are, de asemenea, un efect antimelanogeneză promițător, care este anterior controlului pozitiv,arbutină. Rezultatele arată că extractul din frunze de măslin din Ceylon și fitochimicele sale, în special mearnsetina, au potențialul de a fi utilizate caantimelanogenezași ingrediente pentru albirea pielii.
Cuvinte cheie: efect antimelanogeneză; Elaeocarpus serratus; melanina; inhibitor de tirozinaza; pește-zebră
Cistanche de Herbainhibă activitatea tirozinazei.
1. Introducere
Melanina joacă un rol esențial în multe funcții biochimice; oferă protecție pielii împotriva daunelor ultraviolete (UV), eliminării speciilor reactive de oxigen (ROS) și a altor reacții biochimice [1–3]. Acumularea excesivă de melaninal provoacă, de asemenea, hiperpigmentare, melasma, pete de vârstă, întunecarea pielii etc. [4,5].În lumea estică, oamenii sunt interesați de problema efectului de albire a pielii; industria cosmetică este dedicată dezvoltării produselor cosmetice pentru albirea pielii împotriva melanogenezei. Există mai multe mecanisme, inclusivtirozinazaactivitate inhibitoare, eliminarea melanocitelor și interferență cu sinteza melaninei pentru a prezenta activitate inhibitoare a melanogenezei. Reactivii promițători care inhibă melanogeneza au fost investigați încă din anii 1940 [2,4,6,7]. Cu toate acestea, partemelanogenezainhibitorii posedă unele efecte secundare; de exemplu, hidrochinona poate provoca ocronoză exogenă și hipomelanoză permanentă [5,8].Acidul kojic în exces poate duce la alergie și tumori tiroidiene [9,10].
Recent, cercetătorii s-au dedicat găsirii de reactivi melanogeni promițători, fără efecte secundare/ușoare de la produsele naturale din plante [11–13]. Naturaltirozinazaau fost raportați inhibitori din surse vegetale, inclusiv fenoli simpli, acizi fenolici, stilbene, flavonoide, lignani, terpenoide, chinoide etc. [2,14–16]. Solano şi colab. a afirmat că compușii fenolici și ceilalți compuși naturali au un potențial mare de inhibare a formelaninei, de exemplu, arbutina (un glucozid fenolic găsit în Arctostaphylos uva-ursi), extractul de ceai verde, acid alfa hidroxil (AHA), acid ascorbic și așa mai departe [5] ].Arbutineste utilizat pe scară largă ca ingredient cheie al produselor comerciale de albire de pe piață [4,17].Gallocatechin-3-O-galat (GCG), epigalocatechin-3-O-galat (EGCG) și epicatechin {{6 }}O-galatul (ECG) a fost identificat în ceaiul verdeextrage; acești compuși au o bună eficacitate inhibitoare a tirozinazei [17]. Arctigenina, un lignan izolat din extractul Fructus arctic, ar putea reduce conținutul de melanină al embrionilor de pește-zebră (Danio rerio) [18]. Lee et al. au raportat că ginsenozidele din frunza și boabele de ginseng Panax inhibămelanogenezaal embrionului de pește-zebră; ginsenozidele active sunt ginsenozide Rh6, vina-ginsenozide R4, vina-ginsenozide R13, ginsenozide Rh23 și floralginsenozide A [19–21].
Elaeocarpus serratus Linn. (Tiliaceae), numită în mod obișnuit măsline Ceylon, este distribuită în Africa, Australia și Asia de Sud-Est. Murăturile făcute din fructele comestibile ale măslinei Ceylon sunt obișnuite în Sri Lanka [22]. Este folosit în mod tradițional pentru a preveni păduchii și mătreața în SriLanka. Bioactivitățile extractului de E. serratus au fost evaluate în studiile aferente [22,23]. Extractul de frunze de E.serratus a avut activitate antibacteriană împotriva Plesiomonas, Salmonella typhi și Proteus spp. la concentrația de 400 µg/mL prin testul de difuzie placă-găuri [23].E. extractul de frunze de serratus a avut potențialul de a fi un reactiv antitumoral, antimicrobian și pesticid în investigarea citotoxicității testului de letalitate a creveților de saramură (Artemia salina); theLC50 al frunzeiextragea fost de 40 µg/mL împotriva creveților de saramură [23]. Flavonolglicozide antioxidante, inclusiv miricitrină, mearnsetin 3-O- -D-glucopiranozid, mearnsitrin și tamarixetin 3-O{- -L-ramnopiranozid, au fost izolate și identificate din extractul de frunze de E. serratusleaf [22].
Obiectivele acestui studiu sunt de a evalua efectele frunzei de E. serratusextrageși fracțiile sale peantitirozinazaactivitate (in vitro) șimelanogenezaactivitate de inhibiție inzebrafish (in vivo). Au fost efectuate tehnici de fracționare și izolare ghidate de biotest pentru a găsi compușii promițători ca potențiali ingrediente antimelanogeneze. Dezvoltarea ingredientelor eficiente antimelanogeneză poate crește utilizarea optimă a produselor naturale din plante în industria farmaceutică și cosmetică.
2. Materiale și metode
2.1. Material vegetal și extracție
Măslinul Ceylon (Elaeocarpus serratus), în vârstă de aproximativ 50 de ani, au fost colectate frunze de la Universitatea Națională din Taiwan, Taipei, Taiwan în septembrie. Frunzele proaspete (3,95 kg) au fost extrase cu 95% etanol timp de 7 zile la temperatura camerei. Cel filtratextragea fost uscată sub presiune redusă de un evaporator rotativ cu o temperatură a băii de 50 ◦C [24]. Randamentul extractului de frunze (0,32 kg) a fost de 12,0 procente (greutate/greutate din greutatea uscată).
cistancheextrage
2.2. Partiție lichid-lichid
Theextragea fost supus extracției succesive cu solvent organic în ordinea polarității crescătoare prin partiție lichid-lichid [24,25]. Extractul de frunze a fost fracționat în fracție solubilă în ton-hexan (HF, 9,1 la sută), fracție solubilă în acetat de etil (EF, 11,3 la sută), fracție solubilă în n-butanol (BF, 17,3 la sută) și fracție solubilă în apă (WF, 31.{ {13}} procente).
2.3. Cromatografia pe coloană și cromatografia în strat subțire
Fracția solubilă în acetat de etil bioactiv a fost fracționată în continuare prin cromatografie pe coloană cu silicagel (CC). Cromatografia în coloană deschisă a fost efectuată prin eluare treptată cu raporturi diferite de n-hexan și acetat de etil [26]. Nouăsprezece subfracții (E1–E19) au fost obținute prin cromatografie în strat subțire (TLC) [27]. Randamentele subfracțiilor au fost E1(1,05 la sută), E2 (8,21 la sută), E3 (1,64 la sută), E4 (0,74 la sută), E5 (1,52 la sută ), E6 (0,74 la sută ), {59}}.86 la sută ), E7 (1,51 la sută ), E8 (9,50 la sută ), E9 (7,78 la sută ), E10 (3,97 la sută ), E11 (2,65 la sută ), E12 (8,49 la sută ), E13 (5,58 la sută), E14 (4,43 la sută), E15 (5,31 la sută), E16 (1,14 la sută), E17 (1,87 la sută), E18 (0,76 la sută) și E19 (2,96 la sută).
2.4. Cromatografie lichidă de înaltă performanță
Subfracțiile active ale fracției solubile în acetat de etil au fost analizate și izolate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC, L-2130, Hitachi, Tokyo, Japonia) echipată cu o coloană preparativă RP-18 (Purospher®, STAR RP{{ 3}} capat, 250 × 10 mm, 5 µm). Faza mobilă de gradient a constat din apă (A) și acetonitril (B). Debitul a fost de 3 ml/min. Programul de eluție a implicat un gradient liniar de la 30 la 35 la sută B în A timp de 0-15 min, 35 la 100 la sută B în A la 15-25 min și urmat de 5 minute de echilibru cu 100 la sută B. Picurile eluate au fost detectate de un detector UV la 254 nm [25,28].
2.5. Identificarea compușilor izolați
Structurile compușilor izolați au fost determinate și caracterizate prin analize spectrale, inclusiv spectroscopie ultraviolet-vizibil (UV/VIS, V-550, Jasco, Tokyo, Japonia), spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR, FTS{{2} }, Bio-rad, Hercules, CA, SUA) și spectroscopie de masă (MS, MAT-958, Finnigan, MA, SUA). Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară (RMN), inclusiv 1D (1H-NMR, 500 MHz; 13C-NMR, 125 MHz) și 2D RMN (HSQC și HMBC), au fost înregistrate cu un spectrometru Bruker AVIII RMN (Bruker Avance, Rheinstetten, Germania) [ 29–32].
2.6. Testul antitirozinazei și studiul cinetic al enzimelor
In vitroantitirozinazatestul a fost o analiză spectrofotometrică bazată pe metodele descrise anterior [33–35]. L-DOPA (3,4-dihidroxifenilalanina) și, respectiv, L-tirozină au fost utilizate ca substrat. În microplăcile de 96-godeuri, s-au amestecat 40 µL de soluție de probă și 70 µL de tampon fosfat de potasiu (0,1 M, pH 6,8), care a fost urmat de adăugarea a 50 µL de 200 unități/mL de tirozinază de ciuperci ( EC1.14.18.1) după incubare la 25 ◦C timp de 10 min. Apoi, am adăugat 40 uL de substrat 2,5 mM (L-tirozină/L-DOPA) în godeu și amestecul a fost incubat timp de 10 minute. După incubare, absorbanța la 475 nmo din fiecare godeu a fost măsurată cu cititorul ELISA (testul imunosorbent legat de enzime) (SPECTROstar Nano, BMG LABTECH, Offenburg, Germania). Controlul pozitiv a fostarbutină, iar numărul de replicări a fost de trei. Inhibarea procentuală atirozinazaactivitatea a fost calculată prin următoarea ecuație: Inhibație ( procente )=[(Acontrol–Acontrol’s blank)–(Asample–Asample’s blank)/(Acontrol–Acontrol’s blank)] × 100. Apoi, concentrația inhibitorie jumătate maximă ( IC50) a probei a fost calculată din curba concentrație-răspuns.
Studiul cinetic enzimatic este analizat prin diagrama reciprocă Lineweaver-Burk a vitezei de reacție și a concentrației substratului pentru a evalua efectul specimenului asupra afinității substratului și a enzimei. Concentrarea detirozinazaa fost menținut constant la 200 unități/mL, în timp ce concentrația de substrat (L-tirozină/L-DOPA) a fost variată la 0,5, 0,75,1,0 , 1,25 şi 1,5 mM. Reacția a fost similară testului de antitirozinază descris mai sus; 40 µL de soluție de probă și 70 µL de tampon fosfat de potasiu (0,1 M, pH 6,8) au fost amestecate, care a fost urmată de adăugarea a 50 µL de 200 unități/mL de tirozinază, după incubare la 25 ◦ C timp de 10 min. Apoi, am adăugat 40 µL de substrat în godeu și l-am amestecat bine, iar măsurătorile cinetice ale soluției au fost măsurate imediat pentru o perioadă de 3 minute la lungimea de undă detectată (475 nm). Ambii parametri cinetici, constanta Michaelis–Menten (Km) și viteza maximă (Vmax), au fost calculați din ecuația liniară Lineweaver–Burk [36–38].
2.7. Evaluarea efectului antimelanogenezei la peștele zebră
Peștii zebră (Danio rerio) din tulpina AB de tip sălbatic au fost menținuți într-un mediu acvatic sănătos la 26-30 ◦ C, cu un ciclu lumină-întuneric de 14:10 h. După 9 ore post-fertilizare (hpf), embrionii au fost plasați într-o placă de 24-godeuri (3 embrioni per godeu), tratați cu diferite concentrații finale de specimene dizolvate în 1% DMSO și incubați la 28 ◦ C timp de 48 de ore. (la 57 CP). Imaginea digitală a unui embrion de pește zebra viu a fost luată printr-un stereomicroscop (Olympus SZ61, Tokyo, Japonia) la o mărire totală de 40×; apoi, conținutul de melanină al embrionului de pește-zebră a fost analizat de software-ul ImageJ. Controalele pozitive au fostarbutină(ingredient comercial pentru albirea pielii) și 1-fenil-2-tiouree (PTU, un inhibitor al sintezei melaninei). Numărul de replicări a fost de șase [21,39,40].
2.8. Analize statistice
Datele obținute în studiu au fost analizate prin Statistical Analysis System (SAS) v 9.2 (Cary, NC, SUA) cu testul Scheffe, care este o metodă de comparație multiplă post-hoc. Intervalul de încredere a fost stabilit la 95 la sută.
dr vita OPC înalbirea pielii
3. Rezultate si discutii
3.1. Activitatea antitirozinazică a extractului de frunze de E. serratus și a fracțiilor sale
Schema schematică de extracție, izolare, identificare,antitirozinazaactivitate șiantimelanogenezaefectul frunzei de E. serratusextrageeste prezentat în Figura 1. Extractul de frunze a fost fracţionat în continuare în fracţiune solubilă în n-hexan (HF), fracţiune solubilă în acetat de etil (EF), fracţiune solubilă în n-butanol (BF) şi o fracţiune solubilă în apă (WF) prin lichid -partitie lichida.
Tirozinaza, produsă de celulele melanocitelor, joacă un rol cheie în catalizarea complicatei sinteze a melaninei; explorareatirozinazainhibitorul este una dintre modalitățile proeminente de retardmelanogeneza[2,5,41]. Activitățile de inhibare a tirozinazei ale frunzelorextrageși patru fracții sunt prezentate în Figura 2. Când se folosește L-tirozină ca substrat, numai fracția solubilă în acetat de etil a avut efect de inhibare împotriva tirozinazei la o concentrație de 400 ug/mL. Extractul de frunze, fracția solubilă în acetat de etil și fracția solubilă în n-butanol au prezentat activitate antitirozinazei la schimbarea L-DOPA ca substrat. Dintre extractul de frunze și patru fracții, fracția solubilă în acetat de etil a demonstrat cea mai bunăantitirozinazaactivitate cu valorile IC50 de 279,38 și 166,95 ug/mL când se utilizează L-tirozină și, respectiv, L-DOPA ca substrat (Tabelul 1).
Tabelul 1. Valorile IC50 ale subfracțiilor active împotriva tirozinazei de ciuperci.
Fracția solubilă în acetat de etil a fost supusă fracționării ghidate de biotest folosind tehnici cromatografice pe coloană preparativă și cromatografice în strat subțire și au fost obținute nouăsprezece subfracții (E1-E19). Printre aceste subfracții, subfracțiile E7-E10 au arătat efectul inhibitor al tirozinazei mai mare în ambele teste de substrat (L-tirozină și L-DOPA). Valorile concentrației inhibitorii semi-maximum (IC50) ale subfracțiilor active împotrivatirozinazasunt date în Tabelul 1. Valorile IC50 ale tuturor subfracțiilor E7–E10 au fost sub 200 µg/mL; Subfracțiile E7 și E9 au arătat chiar performanțe mai bune în comparație cuarbutină, care este un ingredient comercial de albire.
3.2. Izolarea și identificarea compușilor din subfracții bioactive
Trei compuși (ES1–3) au fost izolați din subfracțiile bioactive (E7–E10) prin cromatografie lichidă de înaltă performanță. Acid galic (ES1): pulbere albă; mp 257 grade; UV (MeOH) Amax (log e) 215,5 (3,94), 268,0 (3,46) nm; IR (KBr) vmax 3495, 3416, 3285, 1647, 1542 și 1220 cm-1; EI-MS m/z 171 [M plus H] plus, în acord cu formula moleculară C7H6O5. Myricetin (ES2): ac galben; mp 358 grade; UV (MeOH) Amax (log e) 252,5 (4,43) şi 374,0 (4,50) nm; IR (KBr) vmax 3421, 1663, 1596, 1520, 1229, 1202 şi 1171 cm-1; EI-MS m/z 319,36 [M plus H] plus, formula moleculară C15H10O8. Mearnsetin (4′-O-metil miricetină, ES3): pulbere galbenă; mp 184 grade; UV (MeOH) Amax (log e) 259,5 (4,21) şi 364,5 (4,26) nm; IR (KBr) vmax 3409, 2960, 2927, 2853, 1661, 1599, 1507, 1208 şi 1163 cm-1; EI-MS m/z 333,0 [M plus H] plus, formula moleculară C16H12O8. Datele RMN ale acestor compuși sunt rezumate în Tabelul 2. Structurile chimice ale compușilor identificați sunt prezentate în Figura 3.
Tabelul 2. Datele 1H, 13C și HMBC RMN ale compușilor.
Dintre acești compuși, acidul galic este un acid fenolic; miricetina și mearnsetina aparțin flavonoidelor. Conținutul fiecărui compus din fracția solubilă în acetat de etil și subfracțiile E7–E10 sunt enumerate în Tabelul 3. Subfracția E7 a fost bogată în mearnsetin (433,38 mg/g); subfracția E8 primară conținea acid galic (417,64 mg/g). Componenta majoră a subfracțiilor E9 și E10 a fost miricetina (406,41 și, respectiv, 336,41 mg/g). Conținutul a trei compuși din fracția solubilă în acetat de etil a fost 59,72 mg/g (acid galic), 45,21 mg/g (miricetină) și 22,66 mg/g (mearnsetin).
3.3. Activitatea antitirozinazei și studiul cinetic enzimatic al compușilor izolați
Antitirozinazaactivitatea acestor compuși din subfracțiile active a fost reprezentată în Tabelul 4. Când se folosește L-tirozina ca substrat, ordinea activității antitirozinazei a compușilor examinați a fost mearnsetin > miricetin > acid galic > arbutin; mearnsetin a avut cel mai bun efect de inhibiție cu valoarea IC50 de 56,57 µg/mL (0,17 mM). Rezultate similare au fost observate în L-DOPA utilizat ca substrat; eficacitatea a trei fitochimice a fost superioară celei aarbutină.
Un adevărat inhibitor enzimatic conține patru moduri de inhibiție, inclusiv competitiv, necompetitiv, mixt (atât competitiv, cât și necompetitiv) și necompetitiv [12]. Constantele cinetice, Km și Vmax, sunt determinate de rata inițială a enzimei la diferitele substraturi. concentrații în parcela Lineweaver–Burk; se intersectează pe axa y este echivalent cu 1/Vmax și se intersectează pe axa x este -1/Km. În cinetica enzimatică studiul compușilor terpenoizi din uleiul esențial de coajă de citrice împotrivatirozinaza, citralact ca un inhibitor necompetitiv, iar mircenul a fost un inhibitor competitiv [36]. Mecanismul de inhibare a 3,7-dioleilquercetinei împotriva tirozinazei de ciuperci a fost prin modelul de inhibiție competitivă pentru a suprima producția de melanină [42].
Tabelul 4. Valorile IC50 ale compușilor împotriva tirozinazei de ciuperci
Tipul de inhibiție asupra tirozinazei a trei substanțe fitochimice a fost elucidat printr-un studiu cinetic in vitro enzimatic. Figura 4 a arătat diagrama Lineweaver-Burk (diagrama dublă reciprocă) a mearnsetinului. În analizele ambelor substraturi, L-tirozină și L-Dopa, linia de regresie liniară a diferitelor concentrații de mearnsetin a avut aceeași interceptare pe axa y și pe panta crescătoare. Parametrii cinetici ai acidului galic, miricetinei și mearnsetinei sunt rezumați în tabelul 5. În prezența acidului galic sau a mearnsetinei, s-a observat o creștere a Km și o constantă a Vmax, indicând faptul că atât acidul galic, cât și mearnsetinul au fost inhibitorii competitivi ai tirozinazei. A indicat că acidul galic și mearnsetina s-ar putea lega libertirozinazacu afinitate mare și previne legarea substratului (L-tirozină sau L-DOPA) la locul activ al tirozinazei. Miricetina s-a dovedit a fi un inhibitor de tip mixt, care conține inhibiție competitivă și necompetitivă, deoarece Km a crescut și Vmax a fost scăzut.
3.4. Efectele antimelanogenezei ale extractului, fracțiilor și fitochimicelor izolate
Peștele-zebră (Danio rerio) este un organism model nou și valid pentru cercetarea melanogenezei în studii recente [18–21,40]. Theantimelanogenezaefectele extractului de frunze și ale celor patru fracții în testul in vivo pește-zebra sunt prezentate în Figura 5. Frunzaextrageși fracția solubilă în acetat de etil a prezentat o performanță bună în inhibarea formării de melanină a embrionilor de pește zebra. La o concentrație de 200 µg/mL, extractul de frunze și fracția solubilă în acetat de etil au inhibat 27,72% și 35,60% din producția de melanină a embrionilor de pește zebra, respectiv. Toate tratamentele nu au influențat creșterea embrionilor de pește-zebră cu o rată de supraviețuire de 100%.
Figura 6 a prezentat efectele compușilor și martorilor pozitivi, PTU și arbutina, asupramelanogenezade pește-zebră la o concentrație de 50 µM. PTU este un puternictirozinazainhibitor pentru a preveni producerea de melanină, în timp cearbutinăeste un agent comercial de albire a pielii; ambele controale pozitive ar putea reduce formarea de melanină la peștele zebra. Printre cele trei fitochimice, miricetina a arătat un efect ușor de inhibare a melaninei, în timp ce mearnsetina a avut o activitate mai bună de inhibare a melanogenezei la peștele-zebra.
Concentrațiile efective demelanogeneza inhibition activity in zebrafish of compounds are listed in Table 6. IC50 values of PTU and arbutin were 26.29 µM and 323.69 µM, respectively. The order of antimelanogenesis activity of examined compounds was PTU >mearnsetin >arbutinăiar miricetina > acid galic. Mearnsetin a prezentat cea mai bună eficacitate cu o valoare IC50 de 121,01 µM dintre fitochimicele examinate.
Pentru mai multe informații, dați clic pe imagine.
4. Concluzii
Themelanogenezaefect de inhibiție șiantitirozinazaactivitatea extractului de frunze din măslin Ceylon (E. serratus) a fost evaluată în acest studiu. Printre frunzeextrageși cele patru fracțiuni ale sale, fracția solubilă în acetat de etil a avut cea mai bunăantitirozinazaactivitate. Fitochimicele, inclusiv acidul galic, miricetina și mearnsetina, au fost izolate și identificate din subfracțiile active prin cromatografie ghidată de biotest și analize spectrale. Ordinea activității antitirozinazei a acestor compuși a fost mearnsetin > miricetin > acid galic. Studiul cinetic al enzimelor in vitro dezvăluie că acidul galic și mearnsetina erau inhibitori competitivi ai tirozinazei, iar miricetina era un inhibitor de tip mixt. Rezultatele testului pește-zebră in vivo au arătat că o fracție solubilă în acetat de etil și trei substanțe fitochimice au deținut semnificativmelanogenezaefecte de inhibiție. Efectul antimelanogeneză al mearnsetinei a fost superior celui al controlului pozitiv,arbutină, în pește-zebră.
