Nanoribbonul antioxidant de oxid de grafen ca agent nou de albire inhibă mecanismul de melanogeneză

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hsin-Yu Chou, Hui-Min David Wang,* Chia-Heng Kuo, Pei-Hsuan Lu, Lin Wang, Wenyi Kang și Chia-Liang Sun*

ABSTRACT:În procesul de sinteză a melaninei, reacțiile oxidative joacă un rol esențial și este o strategie bună de a inhiba producția de melanină prin reducerea stresului oxidativ. Fullerene și derivații săi, sau complecșii, au fost considerați ca fiind puternici captatori de radicali liberi și am aplicat în continuare nanocarburi sp2 multistratificate pentru a descoperimelaninamecanisme de inhibare a sintezei. În studiul de față, am folosit nanomateriale noi, cum ar fi nanotuburi de carbon cu pereți multiplu (MWCNT-uri), MWCNT-urile de tip scurt, nanoribonurile de oxid de grafen (GONR-uri) și GONR-urile de tip scurt, ca agenți antioxidanti pentru a regla producția de melanină. Rezultatele au arătat că GONR-urile au capacități antioxidante mai bune în platformele de analiză a stresului oxidativ intracelular și extracelular decât altele. Am propus ca GONR-urile să aibă grupe funcționale care conțin oxigen. În testul cu 2′,7′-diclorodihidrofluoresceină diacetat, am descoperit că GONR ar putea chela ionii metalici pentru a elimina speciile reactive de oxigen. Din perspectiva unei perspective moleculare, am observat că aceste nanomateriale au reglat în jos sinteza melaninei prin scăderea expresiilor genetice legate de factorul de transcripție asociat microftalmiei și au existat consecințe similare în expresiile proteinelor. Pentru a rezuma, GONR-urile sunt un agent potențial ca un nou material de cosmetologie antioxidantă și de albire a pielii.

Cistanche este de asemeneaun potențial agent ca romanantioxidantși albirea pieliimaterial de cosmetologie.

1. INTRODUCERE

Pielea este organul care acoperă suprafața exterioară a corpului uman. Întrucât interfața este în contact cu mediul înconjurător, stratul de piele joacă un rol important în protejarea organismului împotriva agenților patogeni, evitarea pierderii excesive de apă, reglarea temperaturii corpului etc. Melanocitele cresc în membrana bazală a epidermei pielii și reprezintă 5% până la 10% din conținutul celular. Ele au fost caracterizate ca „glande” unicelulare având dendrite subțiri, lungi, asemănătoare cu ramificații. Melanocitele se deplasează prin celulele epidermice din imediata lor apropiere, creând o constelație de celule epidermice în jurul fiecărui melanocit. Există multe cauze interne și externe ale îmbătrânirii pielii și un astfel de factor este radiația ultravioletă (UV) de la lumina soarelui.1 În timpul expunerii la UV, nivelurile speciilor reactive de oxigen (ROS) din piele cresc dramatic, ceea ce este cunoscut sub numele de stres oxidativ. Mai mulți factori de toxicitate a mediului sporesc, de asemenea, stresul oxidativ asupra pielii, cum ar fi pesticidele, tetraclorura de carbon, metalele grele, aminele aromatice și particulele 2.5 (PM2.5).2 În mecanismul biochimic, oxidanții intracelulari sunt generați din sistem enzimatic, transformându-le în ROS pentru a declanșa calea melanogenezei.3

Pe lângă ROS, există mulți factori care afecteazăproducția de melanină, inclusiv expresia genelor, inflamația, modificările endocrine și absorbția pigmentului.1 În primii pași ai producției de melanină, tirozinaza joacă un rol în catalizarea tirozinei în fenomelanină și eumelanină. Ambele mecanisme de fabricare a pigmenților sunt similare, care includ hidroxilarea L-tirozinei la 3,4-dihidroxi-L-fenilalanină (L-DOPA) și oxidarea L-DOPA la dopachinonă. În pasul următor, dopamina este oxidată de proteina 1 înrudită cu tirozinază (TRP-1) și proteina 2 înrudită cu tirozinază (TRP{-2) din melanozom, care este reglată de factorul de transcripție asociat microftalmiei ( MITF) pentru a forma melanina. În cele din urmă, melanina este maturată și precipitată în stratul cornos.4,5 Acestea pătrund în keratinocitele vecine ale stratului bazal și își protejează ADN-ul de orice mutații sau modificări induse de UV. Melanina maturată din melanozomi este transferată către keratinocite6-9 și în cele din urmă duce la o pigmentare de lungă durată. Lentiginile, pistruii și petele maro/negre cauzează uneori probleme sociale la bărbați și femei. Blocarea stresului oxidativ sau suprimarea activității tirozinazei este o strategie de reglare în jos a sindromului de hiperpigmentare și a tulburărilor dermatologice. Antioxidanții vindecă hiperpigmentările și leziunile celulare cauzate de ROS.10,11 Prin urmare, compușii antioxidanti sintetizați au multe aplicații biofuncționale în aplicațiile de îngrijire a pielii.

Fullerene (C60), nanotub de carbon (CNT), grafen și nanoribbon de grafen (GNR) sunt patru tipuri de nanocarbon sp2 cercetate pe scară largă în întreaga lume.12 Fulerenul și derivații sau complecșii săi au fost considerați puternici.captatori de radicali liberipentru mult timp. Yodh și colab. a folosit C60 solubil în apă ca agent de protecție împotriva degenerării induse de stres catabolic. Inject și colab. a concluzionat că C60(OH)24 este un compus antioxidant puternic atunci când stresul oxidativ este prea mare. Okuda și colab. a sugerat că complexele C60 pot preveni leziunile celulare mediate de NO.13,14 Tong et al. a arătat că complexele C60 ar putea fi candidați promițători pentru tratarea bolilor legate de creier cauzate de niveluri crescute de superoxid. De fapt, o companie japoneză a identificat fulerenele cu o activitate antioxidantă puternică pentru uz cosmetic în 2006. Lucente-Schultz et al. a demonstrat că capacitatea de captare a radicalilor de oxigen a CNT-urilor funcționalizate cu un singur perete (SWCNTs) este de aproape 40 de ori mai mare decât cea a dendriticului C60.15-19 Fenoglio și colab. a observat că CNT-urile multipereți (MWCNT) posedă o capacitate remarcabilă de captare a radicalilor în contact cu o sursă externă de radicali hidroxil sau superoxid.20 Calculele teoriei funcționale a densității au relevat și un model de SWCNT ca captatori de radicali liberi. În 2004, Novoselov et al. au demonstrat mai întâi că grafenul a prezentat un efect electric ambipolar puternic și ar putea fi promițător pentru aplicații electronice.21 În continuare, ei au continuat să arate că grafenul are proprietăți electronice care sunt distinctive pentru un gaz 2D de particule descris de ecuația Dirac.22,23 Deoarece acestor două lucrări inovatoare, din ce în ce mai multă atenție a fost acordată cercetării bazate pe grafen.24−30 De exemplu, Qiu și colab. în 2014 a arătat că oxidul de grafen și grafenul cu câteva straturi prezintă o activitate antioxidantă semnificativă și pot proteja diferite molecule biomoleculare de oxidare.31 Han și colab. a demonstrat experimental în 2007 că decalajul energetic al GNR-urilor poate fi controlat în timpul procesului de litografie prin modificarea lățimii panglicii.32 Dintre cele patru nanocarburi, GNR-urile au primit cea mai mică atenție. Din cunoștințele noastre, există puține cercetări privind proprietățile antioxidante ale nanoribbonurilor de oxid de grafen (GONR).31,33 Prin urmare, în acest studiu, am pregătit cu atenție MWCNT, MWCNT scurte, GONR și GONR scurte și am urmărit să comparăm proprietățile lor antioxidante și rezultate aferente în mod sistematic.

2. REZULTATE ȘI DISCUȚII

2.1. Morfologia MWCNT-urilor și GONR-urilor.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm până la 2−3 μm. Concomitent, s-a observat că tratamentul cu acid azotic îngrozește suprafețele netede ale tuburilor. Unele crestături și forme neregulate sunt afișate în imaginea cu mărire mare. În plus, folosind MWCNT și MWCNT scurte prin reacții cu microunde se obține GONR și, respectiv, GONR scurt. De asemenea, am ilustrat imaginile TEM cu mărire scăzută și mare ale GONR și GONR scurt. Datorită deschiderii longitudinale majore și tăierii orizontale minore, se pare că GONR-urile au fost mai scurte decât MWCNT-urile. Pe de altă parte, imaginile cu mărire mare au arătat diametre mai mari, adică 0.11−0,18 μm, ale GONR-urilor decât cele ale MWCNT-urilor, indicând că procesul de dezarhivare a avut succes. În mod similar, GONR-urile scurte au prezentat o lungime mai mică și un diametru mai mare decât MWCNT-urile scurte. În compresorul de aer al noului nostru proces de desfășurare, structurile stratificate subțiri ale GONR-urilor au fost mai puțin decât cele obținute în raportul timpuriu pentru aceeași putere de microunde de 250 W, menținând în același timp MWCNT-urile centrale mai groase.12 Aceasta însemna un MWCNT cu carcasă de miez. Heterostructura /GONR ar apărea mai probabil în locul structurii nanoribbon complet dezarhivate prin toate puterile cu microunde în noul proces. Pentru a compara cu GONR scurt din studiile noastre anterioare,34 puterea mai mare a microundelor a generat mai multe crestături pe partea laterală a benzilor și nu a format margini frumoase și netede ale panglicii. Rețineți că am folosit două tipuri diferite de grile de Cu în Figura 1a. Pentru MWCNT-uri și GONR-uri cu lungime suficientă, a fost utilizată grila Gu cu un formvar lacey stabilizat cu carbon (nr. produs 01881-F, Ted Pella, Inc., SUA). Găurile deschise dintr-o peliculă de carbon din dantelă au împiedicat o imagine de transmisie suprapusă între nanocarboni și filmul de carbon. Rețelele gri închis aparțin peliculei de carbon din dantelă. Cu toate acestea, grila Gu cu formvar stabilizat cu carbon (nr. produs 01800-F, Ted Pella, Inc., SUA) a fost necesară pentru MWCNT scurt și GONR scurt. Acest lucru s-a datorat faptului că găurile mari din pelicula de carbon din dantelă au cauzat probleme pentru a ține eficient MWCNT scurt și GONR scurt. După cum este ilustrat în Figura 1, contrastul gri deschis de sub MWCNT-urile scurte și GONR-urile scurte este un strat ușor de carbon. Acest strat de carbon a stabilizat filmul formvar expus la fasciculul de electroni prin proprietățile sale conductoare de căldură și electricitate.

2.2. Configurații de legătură ale MWCNT-urilor și GONR-urilor.

Spectrele Raman ale celor patru nanocarburi sunt prezentate în Figura 1b; banda D a GONR-urilor a fost mai mare decât cea a MWCNT-urilor după procesul de dezarhivare. Acest lucru a fost atribuit nivelului de oxidare mai mare și numărului mai mare de structuri de margine ale GONR în comparație cu MWCNT. Acest fenomen este, de asemenea, similar cu ceea ce am observat în 2011.12. Datorită nivelului ridicat de grafitizare, banda G a MWCNT-urilor a avut cea mai mică lățime completă la jumătatea numărului maxim. Raporturile ID/IG ale celor patru nanocarburi au fost {{10}}.{076, 0,502, 0,483 și, respectiv, 0,700. Pe scurt, scăderea lungimii și oxidarea suprafeței a crescut nivelul defectelor și astfel a făcut ca rapoartele ID/IG să fie mai mari. Vârful D′ este prezent în toate grafenele defecte și este privit ca o măsură a calității.35 Așa cum este ilustrat în Figura 1b, vârfurile D′ din cele patru spectre devin mai proeminente fie după procesul de tăiere, fie după procesul de deblocare, ceea ce sugerează că sunt distructive. procese care introduc multe defecte. Figura 1c, d afișează spectrele de spectroscopie de fotoelectroni cu raze X ale celor patru nanocarburi. Aparent, vârful D′ este cel mai clar pentru GONR-urile scurte. După cum se arată în Figura 1c, nivelul de O a crescut semnificativ de la 7,6 la sută (MWCNT) la 19,9 la sută (GONR) datorită capacității puternice de oxidare a KMnO4 într-un mediu acid. Pe de altă parte, nivelul de O a crescut ușor cu 0,8 la sută de la MWCNT la MWCNT scurt. Important este că cel mai mare nivel de O este de 38,3% pentru GONR scurt, ceea ce implică faptul că capetele nanoribbonurilor ar fi mai ușor de atașat grupelor funcționale de oxigen decât suprafețele plane sp2. Numărul mai mare de lățime completă la jumătatea maximă și trecerea la o energie de legare mare a vârfurilor C 1s după procesul de dezarhivare atât a MWCNT-urilor cât și a MWCNT-urilor scurte sunt ilustrate în Figura 1d. Pentru oxizii de grafen, vârfurile deconvolute din partea cu energie de legare ridicată ar putea fi atribuite legăturilor C-C(CC), C-O, CO și COOH.36 Am caracterizat GONR (200 W) în 2013. ,37 și rezultatele au fost similare cu rezultatele acestui studiu. Acest studiu a concluzionat fenomenele spectrelor Raman, ceea ce înseamnă că au fost generate mai multe grupuri funcționale care conțin oxigen în timpul transformării tub în panglică (Figura 2).

2.3. Proprietățile antioxidante ale MWCNT și GONR.

2.3.1. Determinarea 1,1-difenil-2-picrilhidrazil Teste de activitate de captare a radicalilor liberi.

1,1- Difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) activitatea de captare a radicalilor liberi este o platformă antioxidantă aplicată pentru a detecta capacitatea antioxidantă; rezultatele pentru cele patru nanocarburi sunt descrise în Tabelul 2. În testul DPPH, vitamina C la o concentrație de 100 μM a fost utilizată ca martor pozitiv. Pentru a testa activitățile antioxidante ale MWCNT, MWCNT scurte, GONR și GONR scurte, au fost incubate doze de 1, 5 și 10 mg/L în soluția de reacție pentru a măsura proprietățile. MWCNT-urile, MWCNT-urile scurte, GONR-urile și GONR-urile scurte au avut abilități inhibitorii moderate la 10 mg/L (19,2 ± 0,3, 12,1 ± 0,3, 26,8 ± 0,3 și 30,0 ± 0,4 la sută), în timp ce vitamina C a avut o stare similară la 100 μM (93,4 ± 0,1 la sută) pentru suprimare.

2.3.2. Analiza activității de chelare ionică.

În situația de stres oxidativ, ferozina poate dezvolta un complex cu Fe2 plus pentru a fi măsurat cantitativ. În prezența mediatorilor chelatori, complexul este rupt, determinând reducerea ionilor feroși de la o culoare roșu închis a complexului Fe2 plus. Am folosit EDTA ca control pozitiv. Tabelul 2 arată că MWCNT-urile, MWCNT-urile scurte, GONR-urile și GONR-urile scurte au avut activitate de chelare la 10 mg/L (29,2 ± {{0}},8, 28,7 ± 0 0,7, 69,7 ± 0,6 și 68,9 ± 0,3 la sută), în timp ce controlul pozitiv a avut o condiție similară la 100 μM (93,4 ± 0,1 la sută).

2.3.3. Măsurarea puterii antioxidante reducătoare de feric.

Testul potențialului de reducere a fericului este un test simplu și de încredere utilizat pentru a cuantifica sinteza complexului de fericianură Fe(III). În acest test, puterea de reducere a celor patru nanocarboni care produc complexul feros Fe(III)-TPTZ a fost detectată prin modificări ale culorii soluției de la galben la verde și albastru. Tabelul 2 demonstrează că puterile reducătoare ale MWCNT, MWCNT scurt, GONR și GONR scurt au fost densitatea optică (OD) 1,11, 1,13, 1,15 și 1,11 la 10 mg/L.

2.3.4. MWCNT-urile și GONR-urile inhibă acumularea intracelulară de ROS.

Multe rapoarte au arătat că ROS distruge integritatea structurală a membranelor celulare, inclusiv membranele celulare și membranele nucleare, pentru a duce la deteriorarea celulelor și la pierderea funcției normale.38-40 În plus, ROS este, de asemenea, unul dintre factorii importanți pentru catalizarea formării tirozinazei. melanina, iar inhibarea producției de ROS este o strategie bună pentru a regla în jos sinteza melaninei. În acest studiu, am folosit testul de colorare cu 2′,7′-diclorodihidrofluorescein diacetat (DCFDA) pentru a analiza nivelul de stres oxidativ intracelular în celulele de tratament MWCNT și GONR. Phorbol 12-miristat 13-acetat (PMA) a indus stimulări oxidative în grupurile MWCNT și GONR și a fost folosit ca control negativ.41 Când concentrația de PMA a fost de 20 ng/mL, a indus stresul oxidativ, crescând valoarea la 38 la sută; după tratarea GONR și MWCNT, nivelurile de ROS au fost reglate în jos la nivelul normal. Datele au arătat că ambele materiale au inhibat nivelurile de stres oxidativ, iar efectul antioxidant al GONR-urilor a fost mai mare decât cel al MWCNT-urilor (Figura 3). Tabelul 1 prezintă o listă de consecințe similare. Am susținut că există trei motive pentru noile noastre constatări: în primul rând, ordinea de solubilitate a acestor materiale a fost următoarea: GONR scurte > GONR > MWCNT scurte > MWCNT, ceea ce înseamnă că aria de contact a GONR scurte a fost cea mai mare, așa că a fost superior pentru captarea ROS. În al doilea rând, GONR-urile și MWCNT-urile erau structuri de carbon sp2-care puteau distruge electricitatea ROS prin formarea de aduct sau prin transferul de electroni.42 Am descoperit că efectele antioxidante ale structurilor nanoribbon au fost mai bune decât cele ale structurilor nanotuburilor, așa că nanoribbonurile îl fac. mai ușor de transferat electroni decât nanotuburile. În cele din urmă, în Figura 1b, observăm că situl de carbon GONR sp2-conținea mai multe grupări funcționale oxigen decât MWCNT-urile, grupările de acid carboxilic ar putea chela ionii metalici, iar grupările hidroxil ar putea fi un donor H pentru a elimina ROS și inhiba productia de melanina.

2.4. Citotoxicitatea MWCNT-urilor și GONR-urilor tratate în celulele fibroblastelor dermale umane.

Pentru a evalua Proprietățile citotoxice ale GONR-urilor pe celulele Hs68 (Figura 3), iar celulele au fost cultivate în doze diferite de 1, 5 și 10 ug/mL. Am examinat că viabilitățile celulare ale MWCNT au fost 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9 și 94,1 ± 4,7 procente la concentrații de 1, 5 și, respectiv, 10 mg/L; viabilitățile pentru MWCNT scurt au fost calculate în aceeași ordine și s-au dovedit a fi 93,9 ± 2,2, 86,4 ± 3,0 și 98,9 ± 2,1 la sută. Am observat că celulele B16-F10 au fost incubate în concentrații mari, iar supraviețuirea celulară a celulelor Hs68 a fost mai mare de 80%, ceea ce sugerează că MWCNT și MWCNT scurt nu au avut niciun efect toxic asupra celulelor fibroblastelor dermice umane. Viabilitățile celulare ale GONR și GONR scurt au fost 86.24 ± 2,1, 90,87 ± 3,5, 88,58 ± 2,5, 89,03 ± 3,6, 90,71 ± 2,8 și 90,64 ± 2,5 la sută. De asemenea, se subliniază în Figura 4a că GONR și GONR scurt nu au avut un efect citotoxic perceptibil asupra celulelor HS68. În rapoartele anterioare, utilizarea nanomaterialelor netestate în scopuri cosmetice putea fi considerată discutabilă43,44 și, de obicei, se datora atacului ADN-ului după ce nanoparticulele au intrat în celule. După testul de citotoxicitate, am constatat că materialele noastre nu au cauzat toxicitate pentru celulele normale ale pielii. Am ajuns la concluzia că, după ce nanomaterialele au intrat în celule, nanomaterialele pur și simplu inhibă producția de melanină prin scăderea stresului oxidativ și prin chelarea ionilor metalici și nu dăunează mitocondriilor sau ADN-ului, ceea ce înseamnă că MWCNT și GONR-urile au fost sigure pentru a fi utilizate.

2.5. Două tipuri de MWCNT și GONR în activitatea tirozinazei celulare B16-F10 și conținutul de melanină.

În calea de sinteză a melaninei, tirozinaza joacă un rol critic. Tirozinaza oxidează și formează eumelanina și feomelanina printr-o serie de reacții biochimice. Pentru a determina dacă GONR-urile și MWCNT-urile inhibă activitățile tirozinazei și provoacă o scădere a producției de melanină, am analizat activitatea tirozinazei în celulele B16-F10. Am descoperit că MWCNT-urile și MWCNT-urile scurte au inhibat activitatea tirozinazei cu aproximativ 17,1% și 23% la 10 mg/L. GONR-urile și GONR-urile scurte au avut un efect mai bun în suprimarea activității tirozinazei la aceleași concentrații, comparativ cu un alt GONR. Ele au fost, de asemenea, într-o manieră dependentă de doză și au inhibat 49,8% și 44,7% din activitatea tirozinazei, așa cum se arată în Figura 4b.

Melanina este un pigment indispensabil în corpul uman, dar supraexprimarea melaninei declanșează adesea o serie de boli. În studiile anterioare, Xiao și colab. a folosit un material similar, Radical Sponge, o nanoparticulă de fullerenă, ca agent anti-melanin.45 Au fost unele rezultate bune; aproximativ 20 procente din producția de melanină ar putea fi inhibată. Pentru a-și îmbunătăți eficiența, am îmbunătățit și mai mult materialul de testare pentru a măsura rata de inhibare a melaninei și mecanismul său molecular, așa cum se arată în figurile 4c și 5. MWCNT-urile și MWCNT-urile scurte au scăzut conținutul de melanină cu 17,6 ± 5,5 și 13,2 ± {{ 16}}.2 la sută la 10 mg/L şi într-o manieră dependentă de doză. GONR-urile și GONR-urile scurte au redus puternic valorile la 32,0 ± 2,3 și 35,3 ± 3,4% la 10 mg/L. Rezultatele experimentale au sugerat că toate cele patru tipuri ar putea inhiba sinteza melaninei, iar GONR-urile au avut un efect mai puternic. Pe de altă parte, am observat, de asemenea, că GONR scurt are un efect mai bun în inhibarea producției de melanină. Concluzionăm că GONR-urile scurte au mai multe grupuri funcționale și pot preveni eficient tirozinaza catalizată de ioni metalici, inhibând și mai mult producția de melanină (Figura 2). În tabelul 1, observăm că efortul de chelare a ionilor metalici de tip scurt este mai mare decât cel normal; aceasta înseamnă că aceste GONR scurte ar putea fi potențial aplicate în domeniul cosmetic ca agenți de îngrijire a pielii.

2.6. Mecanismul MWCNT-urilor și GONR-urilor a inhibat conținutul de melanină celulară B16-F10.

Celulele răspund la stresul oxidativ extern prin reglarea expresiei proteinelor. Celulele B16-F10 îmbunătățesc expresia genei c-myc și AMPK reglat în sus pentru a scădea nivelurile oxidative,46 și în această lucrare, MITF este un factor de transcripție specific al tirozinazei pentru a regla calea semnalului de sinteza moleculară a melaninei.47-49 În figură. 5a, MWCNT-urile și GONR-urile reduc factorul de transcripție asociat microftalmiei prin reducerea stresului oxidativ, iar apoi, genele TRP-1 și TRP-2 din aval au fost, de asemenea, reglate în jos. Pentru nivelul proteinei, a fost găsit un fenomen similar, prin care MWCNT-urile și GONR-urile au reglat în jos calea de melanogeneză legată de MITF și apoi au redus în cele din urmă conținutul de melanină (Figura 5b).

3. MATERIALE ŞI METODE EXPERIMENTALE

3.1. Pregătirea MWCNT-urilor și GONR-urilor.

Procesul relevant pentru realizarea GONR a fost raportat într-o lucrare anterioară.12 MWCNT (0.{05 g) a fost suspendat în 9:1 H2SO4/H3PO4 și tratat cu un reactor cu microunde (CEM-Discover) cu puterea setată la 250 W timp de 2 min. După adăugarea de KMnO4 (0,25 g) la soluții, soluțiile au fost tratate cu aceeași putere a microundelor la 65 de grade timp de 4 minute12. Apoi am modificat acest proces utilizând un timp mai scurt de microunde din a doua etapă de 8 minute utilizând un compresor de aer. Aici, compresorul de aer este utilizat pentru a controla temperatura reactorului cu microunde în timpul procesului. Puterea cuptorului cu microunde a fost setată la 250 W în testele preliminare.

3.2. Pregătirea MWCNT-urilor scurte și a GONR-urilor scurte.

Procesul relevant pentru realizarea de GONR scurte a fost raportat în lucrarea noastră anterioară.34 Timpul de tratament cu acid a fost ales ca 8 ore. Puterea cuptorului cu microunde a fost setată la 250 W, care este aceeași cu cea pentru obținerea GONR-urilor.

3.3. Activitate de eliminare radicală a DPPH.

DPPH a fost frecvent utilizat pentru a decide capacitatea de captare a probelor și proprietățile de antioxidare.50 DPPH este un reactiv violet care schimbă culoarea de la violet la galben dacă radicalul liber este transferat la analit. La soluție s-au adăugat probe antioxidante pozitive cu concentrații adecvate, iar probele au fost analizate la 517 nm timp de 30 de minute. Am folosit procentele DPPH rămase pe lângă probele de testare pentru a măsura cantitatea de antioxidant necesară pentru a reduce radicalii anteriori DPPH. Vitamina C la 100 μM a fost utilizată ca control pozitiv. Activitatea de captare (procent) a fost măsurată ca

Capacitate de eliminare ( procente )=(Eșantion − Ablank) / (Acontrol − Ablank) × 100 la sută (1)

3.4. Activitate de chelare a metalelor.

Ionul metalic este factorul care provoacă oxidarea excesivă a lipidelor, iar Fe2 plus este unul dintre cei mai influenți ioni.50 Diferite concentrații de nanobiomaterial (1 μL) au fost încărcate într-o placă de godeuri 96-, care conținea 2 mM FeCl2·4H2O. (10 μL) și apoi încărcat în ferozină (5 mM, 20 μL). Amestecul a fost amestecat complet cu 69 μL de mentol și ținut la temperatura camerei timp de 10 minute. Apoi, soluția de reacție a probei a fost observată la 562 nm. EDTA a fost folosit ca martor pozitiv la 100 μM, iar formula de calcul a activității de chelare a metalelor s-a bazat pe ecuația 1.

3.5. Reducerea puterii.

Calculul puterii de reducere se bazează pe un studiu anterior.50 Mai întâi, 2,5 μL de materiale grafen au fost amestecate cu tampon PBS (67 mM, pH 6,8) și K3Fe(CN)6 (2,5 μL, 20 la sută) și apoi incubate la 50 de grade. timp de 20 min. Apoi, acid tricloroacetic 10% (160 μL) a fost amestecat cu reactivii la 300 g centrifugați timp de 20 de minute. Lungimea de absorbție a fost determinată la 700 nm după ce a fost amestecată cu 25 μL FeCl3 (2 procente). Hidroxianisolul butilat (BHA) a fost utilizat la 100 μM.

3.6. Examene de proliferare celulară.

Linia celulară de fibroblaste dermice umane HS68 a fost utilizată pentru a analiza raportul de proliferare celulară. HS68 a fost incubat în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) care conține 10% ser fetal bovin și 1% penicilină și streptomicina amestecate.50,51 După ce a fost tratat cu diferite concentrații de probe, am aplicat MTT pentru a detecta raportul de proliferare celulară. 8000 de celule au fost însămânțate în 96-plăci de godeuri și tratate cu probe timp de 24 de ore. Soluția de supernatant a fost îndepărtată și am folosit soluția MTT pentru cultură timp de 2 ore la 37 de grade. După incubare, am îndepărtat mediul care conține MTT și l-am dizolvat cu dimetil sulfoxid (DMSO). Soluția a fost citită la OD 590 nm și viteza a fost calculată prin ecuația 1.

3.7. Evaluarea conținutului de melanină celulară.

Am folosit o metodă cu modificări minore, bazată pe testul anterior.52,53 Peletele celulare de B16−F10 de la Centrul de Colectare și Cercetare Bioresource (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Taiwan) au fost dizolvate într-un amestec de 2,0 N NaOH și 10% DMSO. Proba a fost ulterior încălzită timp de 1 oră la 90 de grade și centrifugata la 10,000g încă 10 minute pentru a obține supernatantul clarificat. Numărul de melanină a fost determinat prin monitorizarea DO a supernatantului la 475 nm.

3.8. Activitatea tirozinazei celulare B16-F10.

Pentru activitatea tirozinazei celulare B16-F10, ne-am referit la lucrările anterioare cu unele modificări. 50 Celulele au fost cultivate în plăci de 12-godeuri la 105 celule fiecare godeu. După tratamente cu probe, celulele au fost lizate în 1% Triton X-100/PBS și 2 mM L-tirozină (50 μL) timp de 3 ore. După incubare, am îndepărtat mediul și am citit absorbanța la OD 590 nm. Formula activității tirozinazei a fost calculată prin ecuația 1.

Cistanche este un inhibitor al tirozinazei.

3.9. Detectarea ROS prin colorare DCFDA.

Referindu-ne la studiul anterior,54 1.2 1.105 celule B16-F10 au fost însămânțate în 6-plăci de godeuri și tratate cu diferite concentrații de probe. Celulele au fost suspendate în PBS și apoi încărcate cu DCFDA (5 μM) în DMEM non-roșu de fenol timp de 30 de minute la 37 de grade. Citometrul de flux (Guava, Merck, Germania) a fost utilizat pentru a detecta semnalul fluorescent al DCFDA. Lungimile de undă de excitare și emisie ale DCFDA au fost de 488, respectiv 535 nm.

3.10. Reacție cantitativă în lanț a polimerazei în timp real.

Am urmat metodele lui Lin et al. (2018).1 Reacția în lanț a polimerazei de transcripție inversă cantitativă în timp real (qRT-PCR) a constat dintr-o sondă de primer exclusivă pentru a genera fluorescență. A folosit o tehnică de detectare a fluorescenței care detectează fiecare ciclu folosind un sistem 7500 qRT-PCR (Applied Biosystems, SUA). Acesta a detectat ciclul pe baza cantității de fluorescență eliberată, iar apoi produsul fiecărui ciclu a fost calculat pentru conținutul generat, ceea ce a dus la atingerea unor scopuri cantitative în timp real. Trizol (Invitrogen, SUA) a fost folosit pentru a extrage un ARN complet al țesutului pulmonar, conform instrucțiunilor date de producător. Ulterior, a fost folosit un kit de transcriere inversă (Takara, Japonia) pentru a genera ADN. În qRT-PCR folosind primeri, enumerați în Tabelul 1, mai întâi, proba a fost încălzită pentru a forma o singură catenă de ADN; apoi a avut loc o legare a primerului pentru a forma un ADN dublu catenar (dsDNA), după care s-a combinat SYBR Green dsDNA, pentru care s-a folosit trusa de reactiv SYBR green plus (Roche, Basel, Swiss), care a dus la eliberarea fluorescenței. Rezultatul a fost trecut printr-un sistem de detectare a fluorescenței. Detectarea semnalelor fluorescente a avut loc în timpul fazei de alungire sau de recoacere a fiecărui ciclu; după detectare, conținutul probei a fost împins înapoi de intensitățile de fluorescență detectate.55 Nivelurile de expresie ale genelor țintă au fost normalizate la niveluri de tubulină folosind metoda 2−ΔΔCt.

miricetina

3.11. Testul Western Blot.

Celulele B16-F10 au fost lizate la 4 grade peste noapte cu un tampon de testare de radioimunoprecipitare (Thermo Scientific Co., SUA), care conține inhibitori de protează. Kitul de analiză a proteinei acidului bicinchoninic (BCA, Sigma-Aldrich Corp., SUA) a fost utilizat pentru a cuantifica cantitatea de proteine. Proteinele eșantionului au fost separate pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă 10% și transferate pe o membrană de difluorură de poliviniliden (PVDF) (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, SUA). Membrana PVDF a fost blocată cu un tampon de blocare (Thermo Scientific) timp de 1 oră și incubată cu anticorpul primar specific peste noapte la 4 grade. Apoi, membrana a fost spălată cu soluție salină tamponată Tris-tampon Tween 20 de două ori și incubată cu anticorpi secundari timp de 1,5 ore. După aceea, membrana a fost scufundată în reactivi de detectare a chimioluminiscenței (Thermo Scientific) și analizată de către un aparat de imagine MiniChemi Chemiluminiscence (Beijing Sage Creation Science, China). Sursele de anticorpi au inclus iepure anti-MITF, iepure anti-TRP-1, iepure anti-TRP-2 și -actina (Thermo Scientific).

3.12. Analiza materialului.

TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV) a fost utilizat pentru a observa morfologia nanocarbonilor. Un micro spectrometru Raman (PTT, RAMaker) a fost aplicat pentru a verifica modurile de rezonanță ale nanocarbonilor. Pentru determinarea analizei compoziționale s-au efectuat și măsurători prin spectroscopie de fotoelectroni cu raze X (XPS, Kratos Axis Ultra DLD).

3.13. Analize statistice.

Toate probele și experimentele standard au fost repetate de cel puțin trei ori. Am aplicat testul t al lui Student pentru a compara și exprima statistic media valorilor medii ± abaterea standard.

4. CONCLUZII

Pentru a rezuma, am observat că GONR scurt era un material potențial pentru produsele de îngrijire a pielii datorită proprietăților sale biofuncționale multiple (Figura 6). Rezultatele au arătat că nanocarburile au jucat un rol de antioxidant extracelular și intracelular. Între timp, nanocarbonul a inhibat activitatea tirozinazei și conținutul de melanină și nu a provocat nicio vătămare gravă a celulelor pigmentare. Această lucrare a stabilit funcțiile anti-melanogeneză a patru tipuri de nanocarburi; studiile viitoare vor fi examinate mecanismul acestor compuși asupra expresiilor specifice genelor și proteinelor legate de maturarea, transportul și acumularea melaninei.

Cistanche îmbunătățește albirea.

Dați clic pe imagine și obțineți mai multe detalii.