Ciclopentanona exercită activități anti-melanogeneză și antirid în melanomul B16F10

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 și Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Abstract:Expunerea la radiații ultraviolete (UV) este cauza principală a îmbătrânirii extrinseci a pielii, care are ca rezultat hiperpigmentarea și încrețirea pielii. În acest studiu, am investigat efectul de albire al (2E,5E)-2,5-bis({3-hidroxi{-4-metoxibenziliden)ciclopentanonă (BHCP) asupra melanomul B16F10 și anti- activitatea ridurilor asupra celulelor fibroblastelor Hs27. Sa constatat că BHCP inhibă puternic tirozinaza, cu valori ale concentrației de inhibiție de 50% (IC50) de 1,10 μM și 8,18 μM de formicofenolat (L-tirozină) și difenolază (L-DOPA), iar studiul cineticii enzimatice a arătat că BHCP este un inhibitor de tip competitiv. . În plus, BHCP a inhibat semnificativ conținutul de melanină și activitatea tirozinazei celulare și a reglat în jos nivelurile factorului de transcripție asociat microftalmiei (MITF), nivelurile fosforilate ale proteinei de legare a elementului de răspuns cAMP (CREB) și tirozinaza indusă de hormonul de stimulare a melanocitelor (-MSH). Celulele de melanom B16F10. În plus, BHCP a inhibat fosforilarea p65 și expresia metaloproteinazelor matriceale (MMP-1, MMP-9, MMP{-12 și MMP{-13) în fibroblastele Hs27 stimulat cu radiații UV. Prin urmare, rezultatele noastre demonstrează că BHCP poate fi un bun candidat pentru dezvoltarea agenților terapeutici pentru bolile asociate cu hiperpigmentarea și ridurile.

Cuvinte cheie: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroxi{-4-metoxibenziliden)ciclopentanonă (BHCP); inhibitor de tirozinază; anti-melanogeneză; antirid

Cistanche esteanti-rid.

1. Introducere

Îmbătrânirea pielii este un proces complex și progresiv care duce la modificări funcționale și estetice ale pielii, factorii intrinseci și extrinseci fiind responsabili [1]. Îmbătrânirea extrinsecă a pielii este cauzată de agresorii mediului, cum ar fi radiațiile ultraviolete (UV), stresul sau fumatul. Cu toate acestea, este cauzată în principal de expunerea repetată la UV de la soare, care se numește fotoîmbătrânire. Fotoîmbătrânirea pielii se caracterizează prin riduri grosiere și profunde, grosime, rugozitate, dispigmentare și modificări histologice [2-4].

Tirozinaza (EC 1.14.18.1), cunoscută și sub numele de polifenol oxidază, este una dintre enzimele multifuncționale care conțin cupru implicate în sinteza melaninei și se găsește pe scară largă în natură [5]. Tirozinaza este de obicei prezentă în majoritatea microorganismelor, plantelor, si animale. La plante, tirozinaza acționează prin oxidarea monofenolilor în difenoli (activitatea micofenolatului) și este implicată în oxidarea o-difenolilor în o-chinone (activitatea difenolazei), urmată de oxidarea chinonelor în pigmenți brun-închis [6].

Melanogeneza este transformarea L-tirozinei în 3,4-dihidroxifenilalanină (L-DOPA), prin care L-DOPA este transformată în DOPA chinină [7]. Prin urmare, tirozinaza joacă un rol important în producerea de melanină în melanocite, iar inhibarea tirozinazei este o țintă atractivă pentru ameliorarea tulburărilor legate de pigmentare și pentru dezvoltarea agenților de albire [8,9]. Sinteza melaninei este indusă de mai mulți stimuli, cum ar fi UV și substanțe chimice, inclusiv izobutilmetilxantina (IBMX) și hormonul de stimulare a alfa-melanocitelor (-MSH). -MSH se leagă de receptorul său receptor de melanocortină 1 (MC1R), crescând ulterior nivelul AMP ciclic citoplasmatic (AMPc). Nivelul crescut de cAMP activează protein kinaza A (PKA), care induce expresia factorului de transcripție asociat microftalmiei (MITF) prin fosforilarea proteinei de legare a elementului de răspuns al cAMP (CREB). MITF induce expresia tirozinazei, a proteinei înrudite cu tirozinaza (TRP)-1 și a TRP-2, ceea ce are ca rezultat în final sinteza crescută a melaninei [10]. MITF este considerat un factor cheie de transcripție al melanogenezei; prin urmare, au fost efectuate multe studii pentru a controla expresia MITF pentru a inhiba melanogeneza [11].

Se știe că formarea ridurilor este strâns asociată cu degradarea matricei extracelulare a pielii, iar radiațiile UV activează factorul nuclear κB (NF-κB), crescând astfel producția de fragmentare a colagenului și a metaloproteinazelor matriceale (MMP) [2]. MMP-urile sunt endopeptidaze dependente de zinc care sunt importante în remodelarea structurii matricei extracelulare din piele. Prin urmare, degradarea excesivă a colagenului și a matricei de către MMP-urile induse de UV este o trăsătură caracteristică a pielii fotodeteriorate, iar MMP-urile sunt utilizate ca marker major al fotoîmbătrânirii induse de UV, precum și al inflamației pielii [12].

Derivații de schelet diarilheptanoid asemănător curcuminei au fost inclusiv antioxidanți, raportate anticancer, activități, schele, inclusiv (2E,5E)-2,5-bis({3-hidroxi-4-metoxibenziliden)ciclopentanonă (BHCP) (Figura 1),pentru a prezenta o gamă largă de antiinflamație, anti-melanogeneză, în special, Leow și colab. [19] raportate în bioactivități și anti-tirozinaze [13–18]dibenzilidene-ciclopentanonă 2014 care ar putea contribui la efectele protectoare asupra osteosarcomului uman prin reglarea căii Wnt/-cateninsignaling. Cu toate acestea, efectele anti-melanogeneză și antirid ale BHCP rămân de descoperit, iar mecanismele moleculare care stau la baza activității sale nu au fost încă clar stabilite.

Figura 1. Structura (2E,5E)-bis(3-hidroxi{-4-metoxibenziliden)ciclopentanonă (BHCP).

În studiul de față, am investigat potențialul anti-melanogeneză și antirid al BHCP și am căutat să identificăm mecanismul implicat, în special în ceea ce privește conținutul de melanină și activitatea tirozinazei celulare, care au fost explorate folosind testul de inhibare a tirozinazei și analiza cineticii enzimatice. Mai mult, am demonstrat că BHCP exercită un efect inhibitor asupra melanogenezei și ridurilor care este asociat cu reglarea în jos a CREB/MITF/tirosinazei în celulele melanomului de șoarece B16F10 induse de -MSH și inhibarea fosforilării p65 și a expresiei MMP în fibroblastele umane Hs27 induse de UV.

ierburi de dragon cistanche

2. Rezultate și discuții

2.1. Sinteza (2E,5E)-2,5-Bis({3-hidroxi{-4-metoxibenziliden)ciclopentanonă (BHCP)

O soluție de {{0}}hidroxi-4-metoxibenzaldehidă (100 mg, 0,66 mmol, izovanilină) și ciclopentanonă (0,03 mL, 0,33 mmol) în soluție 1 N de HCI-acid acetic (0,02 mL) a fost agitată la 25°C timp de 2 ore. După repaus timp de 1 zi, amestecul de reacție a fost tratat cu apă rece în prezența unei cantități mici de metanol, filtrat și spălat cu apă rece pentru a produce BHCP (65,9 mg) cu un randament de 56,9 procente. BHCP a fost identificat prin metode spectroscopice, inclusiv 1H și 13C-RMN, precum și prin comparație cu datele spectrale publicate și analiza cromatografiei în strat subțire (TLC) [19]. Structura este prezentată în figura 1.

BHCP: pulbere amorfă galbenă (CHCI3); 1H-RMN (50{0 MHz, DMSO-d6) 5: 9,25 (s, 2H, 2 × OH), 7,28 (s, 2H, 2 × vinilicH), 7,14 (d, 2H) , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7,11 (dd, 2H, J=8,5, 2,0 Hz, 2×6- H), 7,01 (d, 2H, J=8,5 Hz, 2 × 5-H), 3,81 (s, 6H, 2 × OMe), 3,01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6) 5: 195,5, 149,9, 147,2, 136,0, 133,1, 129,1, 124,3, 117,5, 112,8, 56,3, 26,6; ESI-MS: m/z 351 (M-H)-.

2.2. Efectul inhibitor al BHCP asupra activității tirozinazei ciupercilor

După cum se arată în Tabelul 1, BHCP a inhibat tirozinaza cu valori IC50 de 1,10 ± 0,12 μMand 8,18 ± 0,44 μM, în timp ce acidul kojic (control pozitiv) a avut valori IC50 de 18,68 ± 1,43 μM și ± 1,43 μM și ± 1,43 μM. μM pentru monofenolază și, respectiv, difenolază. În studiul nostru anterior al inhibitorilor potențiali de sinteză ai tirozinazei, am găsit mecanismul prin studii de modelare moleculară prin care grupările 3-hidroxi și {4-metoxi ale benzilidenei au avut tendințe mari de legare la situsul activ al tirozinazei [20]. Din rezultatul acestui studiu, s-a arătat că grupurile sale funcționale (3-grupele hidroxi și 4-metoxi) au fost asociate cu o creștere semnificativă a activității inhibitoare a tirozinazei.

Tabelul 1. Activitatea inhibitoare a tirozinazei și analiza cinetică enzimatică a BHCP.

În plus, mecanismul responsabil pentru inhibarea tirozinazei de către BHCP a fost investigat printr-o analiză cinetică enzimatică în prezentul studiu (Tabelul 1 și Figura 2). Graficele Lineweaver-Burk au fost desenate folosind datele obținute din studiile cinetice, iar constanta de inhibiție (Ki) a fost obținută din diagramele Dixon. Graficele duble reciproce Lineweaver–Burk au indicat o inhibiție de tip competitiv. După cum se arată în Figura 2a–c, BHCP a acționat ca un inhibitor competitiv atât al L-tirozinei, cât și al L-DOPA. În plus, interceptările pe axa x ale diagramelor Dixon sunt de obicei utilizat pentru a determina tipurile de constante de inhibiție a enzimei (Ki) pentru un complex enzimă-inhibitor [21,22], unde valoarea axei x indică valoarea lui -Ki. După cum este prezentat în Figura 2b-d, valorile Ki ale BHCP au fost de 1,7 μM și 10,5 μM ca substraturi pentru L-tirozină și, respectiv, L-DOPA. Deoarece valoarea Ki reprezintă concentrația necesară pentru a forma un complex enzimă-inhibitor, o valoare Ki mai mică sugerează o inhibare mai eficientă împotriva tirozinazei.

Figura 2. Grafice Lineweaver-Burk (a, c) și Dixon (b, d) pentru inhibarea enzimei tirozinazei de către BHCP.

2.3. Efectele BHCP asupra viabilității celulare a melanomului B16F10 și a celulelor fibroblastelor Hs27

Înainte de a determina dacă BHCP a exercitat activități anti-melanogeneză și antirid, am examinat citotoxicitatea BHCP la celulele B16F10 și celulele Hs27 prin tratament cu diferite concentrații de BHCP pentru diferite intervale de timp, iar viabilitatea celulară a fost măsurată cu testul EZ-Cytox. După cum se arată în Figura 3a, b, până la 10 μM de BHCP timp de 48 de ore nu au redus supraviețuirea nici a celulelor B16F10, nici a celulelor Hs27. Ulterior, studii suplimentare in vitro asupra activităților anti-melanogeneză și antirid ale BHCP au fost efectuate cu 1, 5 și 10 μM.

2.4. Inhibarea BHCP împotriva conținutului de melanină și a activității tirozinazei celulare în celulele melanomului B16F10

Pentru a determina dacă BHCP exercită potențial inhibitor asupra conținutului de melanină al celulelor B16F10 induse de -MSH, celulele au fost pretratate cu diferite concentrații indicate (1, 5 și 10 μM) de BHCP sau acid kojic (5 mM) timp de 24 de ore și apoi stimulate. cu -MSH timp de 48 h. După cum se arată în Figura 4a, conținutul de melanină din celulele tratate cu BHCP în prezența -MSH a scăzut într-o manieră dependentă de concentrație, prezentând 113% la 1 μM, 106% la 5 μM și 102% la 10 μM, comparativ cu grupul de control tratat numai cu -MSH (186 la sută). Interesant, BHCP (1 μM) a inhibat conținutul de melanină mai puternic decât acidul kojic (5 mM). Mai mult, a fost efectuat un test al activității tirozinazei celulare pentru a măsura efectul inhibitor al BHCP asupra celulelor B16F10. După cum se arată în Figura 4b, BHCP a scăzut într-o manieră dependentă de concentrație cu activitatea tirozinazei cu 120% la 1 μM, 116% la 5 μM și 105% la 10 μM, comparativ cu grupul de control tratat numai cu -MSH (181). procent ).Efectul inhibitor al BHCP a fost mult mai puternic decât cel al acidului kojic; inhibarea BHCP la 1 μM a fost superioară celei a acidului kojic la 5 mM (131 la sută). Aceste rezultate sugerează că BHCP are un efect de albire prin inhibarea biosintezei melaninei și a sintezei tirozinazei intracelulare în melanocitele B16F10.

Figura 4. Inhibarea conținutului de melanină (a) și a activității tirozinazei celulare (b) a BHCP pe celulele melanomului B16F10.

2.5. Efectele BHCP asupra expresiei MITF/tirozinazei și CREB fosforilat în celulele B16F10

MITF, un factor de transcripție specific, joacă un rol esențial în activarea eficientă a melanogenicgenelor, inclusiv tirozinaza, catalizand etapa de limitare a vitezei în biosinteza melaninei: TRP-1 și TRP-2. Expresia MITF ar putea fi crescută prin fosforilarea CREB [23]. CREB este un promotor important de MITF [24,25], iar fosforilarea CREB în melanocite crește expresia MITF prin legarea de CREB (proteina de legare a elementului de răspuns c-AMP) din melanocite [26]. Pentru a elucida căile moleculare responsabile pentru efectul anti-melanogenic al BHCP asupra celulelor B16F10, am examinat nivelurile de proteine ​​ale moleculelor cheie, inclusiv CREB și MITF, care joacă un rol important în melanogeneză prin analiza Western blot. Celulele au fost tratate cu BHCP sau acid kojic și apoi stimulate de -MSH timp de 48 de ore. Intervalul de timp pentru măsurători a urmat metodologia descrisă în studiile anterioare [27]. După cum se arată în Figura 5, nivelurile de tirozinază și MITF au crescut cu -MSH, dar BHCP a scăzut aceste niveluri de proteine. În plus, fosforilarea CREB a fost suprimată semnificativ de BHCP. Reglarea fosforilării CREB indusă de -MSH este cunoscută a fi potențial importantă în reglarea pigmentării [28]. Aceste rezultate indică faptul că efectele anti-melanogenice ale BHCP rezultă din reglarea în jos a MITF și a tirozinazei prin reglarea în jos a CREB fosforilat. Prezentul studiu sugerează că elucidarea mecanismului de inhibare a BHCP asupra tirozinazei și melanogenezei este crucială și trebuie investigată în continuare în viitor. Deși linia celulară de melanom B16F10 este în general mai potrivită pentru investigarea mecanismelor de semnalizare in vitro, linia celulară B16F10 este a unui melanom de rozătoare. Prin urmare, vor fi necesare studii suplimentare asupra melanocitelor umane pentru a confirma concluziile.

2.6. Efectul BHCP asupra activării NF-κB p-p65 indusă de UV în celulele Hs27

Apoi am investigat efectul BHCP asupra expresiei induse de UV a mediatorilor inflamatori folosind fibroblaste Hs27. S-a raportat anterior că fosforilarea p65 (Ser536) este esențială pentru capacitatea sa de a transactiva genele [29]. Prin urmare, nivelurile de proteine ​​ale p-p65 (Ser536) și p65 au fost examinate în fracția de nucleu prin Western blot. După cum se indică în Figura 6a, b, în ​​celulele Hs27, UV a crescut nivelurile de proteine ​​ale p-p65 (Ser536) în nucleu, în timp ce tratamentul cu BHCP a scăzut nivelurile de proteină din nucleu p-p65 (Ser536). În mod corespunzător, cantitatea totală de p65 a fost scăzută în citoplasmă de UV și restaurată de BHCP (Figura 6c, d). Deși nivelurile de expresie ale proteinei p65 au fost scăzute în citoplasmă și au crescut în nucleu după inducția UV, pretratamentul cu BHCP a inversat aceste tendințe într-o manieră dependentă de doză. Astfel, aceste rezultate sugerează că inhibarea p-p65 de către BHCP ar putea contribui la efectele protectoare asupra pigmentării pielii și distrugerii colagenului împotriva UV.

Figura 6. Efectele BHCP asupra nivelurilor de expresie ale p-p65 (Ser536) în celulele fibroblaste umane Hs27 induse de UV.

2.7. Efectul BHCP asupra expresiei MMP-urilor în celulele Hs27

MMP-urile joacă un rol vital în îmbătrânirea pielii. Iradierea UV modifică țesuturile conjunctive ale pielii prin reglarea în creștere a expresiei MMP-urilor [30,31]. MMP-1 este o enzimă care descompune colagenul care accelerează descompunerea colagenului sintetizat din procolagenul de tip I. MMP-9 este o enzimă care descompune gelatina care descompune fibrele de colagen tăiate de MMP-1, crescând producția de riduri și pierderea elasticității. Pentru a examina efectul antirid al BHCP împotriva inducției UV, am determinat nivelurile de proteine ​​MMP-1 și MMP{-9 prin Western blot. În plus, celulele induse de UV au prezentat un nivel semnificativ crescut de MMP-13, care inițiază degradarea colagenului de tip I și III în loc de MMP-1 [32]. Am investigat creșterea MMP-urilor (MMP1, MMP9, MMP12 și MMP13) după tratamentul celulelor Hs27 induse de UV cu BHCP la 1 și 10 μM. După cum se arată în Figura 7, nivelurile de exprimare a MMP-1, MMP{-9, MMP{-12 și MMP{-13 au crescut după inducția UV; cu toate acestea, tratamentul cu BHCP a scăzut expresia într-o doză. -maniera dependenta. Rezultatele noastre sugerează că BHCP ar putea contribui la prevenirea formării ridurilor prin reducerea producției anormale de MMP induse de expunerea la UV. Aceste rezultate implică faptul că BHCP inhibă expresia MMP în fibroblastele Hs27 pentru a preveni descompunerea colagenului și, astfel, producerea de riduri. Prin urmare, BHCP prezintă potențialul de utilizare ca medicament preventiv și de tratament al bolilor legate de piele.

beneficii cistanche stem

3. Material și Metode

3.1. Produse chimice și instrumente

Tirozinaza de ciuperci (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tirozină, 3,4-dihidroxifenilalanină (L-DOPA), dimetil sulfoxid (DMSO) și acid kojic au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM), serul fetal bovin, streptomicina și amfotericina au fost achiziționate de la Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA, SUA). Anticorpi împotriva MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tirozinaza, MMP-1, MMP-9, MMP{-12, MMP-13, TFIIB și -actin au fost achiziționate de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, SUA). Membrane de difluorură de poliviniliden (PVDF) au fost obținute de la Millipore Corporation (Bedford, MA, SUA). Articole sterile din plastic pentru culturi de țesuturi au fost achiziționate de la SPL Labware (Seul, Coreea). Sursa de lumină UV a fost furnizată de unitatea de lampă Crosslinker 800 series (UVP, CA, SUA) 6 (8 wați/lampă). Cromatografia în strat subțire și silicagel 60 (mesh 230–400) au fost efectuate pe silicagelF{{27} }plăci preacoperite de la Merck Millipore (Darmstadt, Germania). Spectrele RMN au fost înregistrate folosind instrumente Varian Unity INOVA 400 (400 MHz pentru 1H, 100 MHz pentru 13C) și Varian Unity AS 500 (500 MHz pentru 1H). Valorile deplasării chimice (5) sunt raportate cu referire la solventul rezidual respectiv sau vârfurile deuterate (5H 2,50 și 5C 39,51 pentru DMSO). Datele de spectrometrie de masă cu rezoluție scăzută au fost obținute cu un spectrometru de masă Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, SUA).

3.2. Testul de inhibare a tirozinazei de ciuperci

Activitatea inhibitoare a tirozinazei de ciuperci a fost determinată folosind atât substraturi L-tirozină, cât și L-DOPA, pe baza procedurii descrise de Jung și colab. [23]. Pe scurt, s-au adăugat 190 μL de enzimă tirozinază (1000 U diluat cu tampon tirozinază de ciuperci, inclusiv 1 mM L-tirozină și soluție L-DOPA), în prezența sau absența compușilor (concentrația finală variind de la 1 la 20 μM, dizolvată în 100% DMSO), în fiecare godeu al unei plăci de 96-godeuri, pentru a furniza un volum final de 200 μL. Placa a fost incubată la 37 °C timp de 30 de minute. Activitatea tirozinazei a fost cuantificată prin măsurarea absorbanței la 492 nm folosind un cititor de microplăci (TECAN, Salzburg, Austria) și procentul de inhibiție (procent) a fost obținut din următoarea ecuație:

inhibiție procentuală=(Ac − As)/Ac × 100 (1)

unde Ac este absorbanța controlului și As este absorbanța probei. Valorile IC50 au fost calculate din curbele log-liniare și din ecuațiile acestora. Sunt afișate rezultatele medii pentru trei determinări. Acidul kojic a fost utilizat ca martor pozitiv.

3.3. Analiza cinetică a inhibării tirozinazei

Pentru a determina mecanismele cinetice, au fost utilizate în mod complementar două metode cinetice (diagramele Lineweaver–Burk și Dixon) [21,22,33]. Pentru diagramele duble reciproce Lineweaver-Burk (un grafic de 1/viteza enzimei (1/V) versus 1/concentrația de substrat (1/[S])), tipul de inhibiție a fost determinat utilizând diferite concentrații de L-tirozină (1, 2, și 4 mM) și L-DOPA (0.5, 1 și 2 mM) ca substraturi în prezența diferitelor concentrații de BHCP. Concentrațiile de BHCP au fost următoarele:0, 0,5, 1,{{20}} și 2,0 μM pentru L-tirozină; și 0, 2,5, 5 și 10 μM pentru L-DOPA. Graficul Dixon este o metodă grafică (graficul vitezei 1/enzimei (1/V) față de concentrația inhibitorului (I)) pentru determinarea tipului de inhibiție a enzimei și a fost folosită pentru a determina constanta de disociere sau Ki pentru complexul enzimă-inhibitor. Diagramele Dixon (diagrame reciproce unice) ale inhibării au fost obținute în prezența substratului de L-tirozină la 1, 2 și 4 mM și {{40}}, 0.5, 1.{ {47}} și 2.0 μM pentru BHCP; și L-DOPAsubstrat la {{5{0}},5, 1,0 și 2,0 mM și 0, 2,5, 5,0 și 10,0 μM pentru BHCP.

planta cistancheeste un inhibitor al tirozinazei.

3.4. Liniile celulare și cultura celulară

Celulele de melanom murin B16F10 au fost obținute de la Korean Cell Line Bank. Linia celulară de fibroblast de piele umană Hs27 a fost achiziționată de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, SUA). Aceste celule au fost menținute în DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 100 U/ml penicilină și 100 mg/ml streptomicină într-un incubator umidificat cu 5% CO2 la 37 °C. Fibroblastele dermice pe o placă de 100 mm au fost tratate cu BHCP și expuse la 50 mJ/cm2UV în DMEM fără ser (sursă de lumină UV, UVP). Celulele Hs27 au fost cultivate la 70-80% confluență într-o placă cu diametrul de 100 mm și au fost utilizate între numerele de trecere 5 și 15.

3.5. Test de viabilitate celulară

Viabilitatea celulelor a fost evaluată folosind testul kit EZ-Cytox. Pe scurt, celulele B16F10 și fibroblastele Hs27 au fost însămânțate într-o placă de 96-godeuri la o densitate de 1 × 104 celule/godeu și incubate la 37 ◦ C timp de 24 de ore. Celulele au fost hrănite cu DMEM proaspăt, fără ser, care au conținut diferite concentrații (0, 1, 2, 5 și 10 μM) de BHCP și au fost incubate timp de 24 și 48 de ore. Ulterior, 10 μL de soluție EZ-Cytox au fost încărcate în fiecare godeu și celulele au fost incubate timp de 2-4 ore. Măsurarea absorbanței celulelor în absența oricărui tratament a fost considerată ca supraviețuire celulară de 100%. Fiecare tratament a fost efectuat în triplicat și fiecare experiment a fost repetat de trei ori.

3.6. Determinarea conținutului de melanină

Efectul BHCP asupra melanogenezei induse de -MSH în celulele B16F10 s-a bazat pe o metodă utilizată anterior, cu ușoare modificări [34]. Pe scurt, celulele B16F10 (5 × 104 celule/godeu) din plăcile de 6-godeuri au fost lăsate să crească până la o confluență de 70-80%. Celulele au fost apoi tratate cu diferite concentrații de BHCP (1, 5 și 10 μM) sau acid kojic (5 mM) timp de 24 de ore și apoi stimulate cu -MSH (5 μM) timp de 48 de ore. După tratament, celulele au fost spălate de două ori cu PBS rece cu gheață, dizolvate în 90 μL soluție de NaOH 1 M inclusiv DMSO (5 procente) la 60 °C timp de 1 oră, iar absorbanța a fost măsurată la 405 nm cu un spectrofotometru cu microplacă (TECAN, Salzburg). , Austria). Pentru a măsura cantitatea de melanină din experiment, rata de inhibare în grupurile de tratament a fost calculată din absorbanța concentrațiilor cunoscute de melanină sintetică, care au fost corectate la cantitatea totală de proteină care a fost prezentă în supernatantul lizatelor celulare. Absorbanța celulelor netratate a fost măsurată în trei exemplare.

3.7. Analiza activității tirozinazei celulare

Analiza activității tirozinazei celulare a fost efectuată prin măsurarea ratei de oxidare a L-DOPA [35]. Celulele B16F10 la o densitate de 5 × 104/celule au fost plasate în vase de 6-godeuri și incubate peste noapte. Celulele au fost apoi tratate cu diferite concentrații de BHCP (1, 5 și 10 μM) sau acid kojic (5 mM) timp de 24 de ore și apoi stimulate cu -MSH (5 μM) timp de 48 de ore. Celulele au fost spălate cu PBS și lizate într-o soluție care conține 100 μL de tampon fosfat 50 mM (pH 6,5), 0,1 mMfenilmetilsulfonilfluorură (PMSF) și 1% Triton X-100. Apoi, celulele au fost plasate într-o mașină de congelare (-80 ◦ C) timp de 30 de minute. După decongelarea celulelor, extractele celulare au fost purificate prin centrifugare la 12,000 rpm timp de 30 de minute la 4 ◦C. Un total de 80 μL de supernatant și 20 μL de L-DOPA (2 mg/mL) au fost adăugate pe o placă de godeuri 96-, iar absorbanța la o lungime de undă de 492 nm a fost măsurată la fiecare 10 minute timp de 1 oră la 37 ◦ C cu un cititor de plăci ELISA (TECAN, Salzburg, Austria).

3.8. Prepararea extractelor citosolice și nucleare de celule Hs27

Celulele Hs27 au fost spălate cu PBS răcit cu gheață și recoltate. Un tampon care conține 10 mM Tris(pH 8.0), 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1% NP{-40 și inhibitori de protează a fost utilizat pentru extracția fracțiilor citosolice prin centrifugare la 12,000 rpm la 4 ◦C timp de 15 min, iar fracțiile nucleare au fost extrase din pelete folosind un tampon care conține 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl și inhibitori de protează, incubate pe gheață timp de 30 de minute, și apoi centrifugate la 13,000×g timp de 30 min la 4 ◦C pentru a obține fracții nucleare.

3.9. Western Blotting

Probele de lizat au fost fierte timp de 10 min în tampon de încărcare cu gel (125 mM Tris-HCl, 4% sulfat de sodiu dodecil (SDS), 10% 2-mercaptoetanol și 0,2% bromofenol albastru; pH 6,8) la un raport de volum de 1:1. Echivalenții totale de proteine ​​pentru fiecare probă au fost separați prin gelelectroforeză SDS-poliacrilamidă (PAGE) folosind geluri de acrilamidă conform procedurii descrise de Laemmli [36] și transferate pe membrane PVDF la 80 V timp de 2 ore utilizând sistemul de transfer umed. Membranele au fost plasate imediat într-un tampon de blocare (5% lapte degresat) în 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mMNaCl și 0,1% Tween-20. Petele au fost blocate pentru a preveni legarea nespecifică la 25 °C timp de 2 ore. Ulterior, membranele au fost incubate cu un anticorp primar specific la 4 °C peste noapte, urmată de incubare cu un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean la 25 °C timp de 1 oră. . Marcarea anticorpilor a fost detectată prin chemiluminiscență îmbunătățită în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Cuantificarea proteinelor a fost efectuată utilizând Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seul, Coreea). Pentru determinarea greutății moleculare au fost utilizați markeri de proteine ​​pre-colorate.

3.10. Analize statistice

Toate datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Datele au fost analizate prin analiză unidirecțională a varianței (ANOVA) pentru diferențele dintre tratamente, urmată de testul post-hoc Bonferroni. O valoare de p < 0,05="" a="" fost="" considerată="" semnificativă="" din="" punct="" de="" vedere="">

4. Concluzii

În rezumat, constatările prezentului studiu au demonstrat că BHCP are un efect de albire a pielii prin inhibarea tirozinazei, care este o enzimă cheie pentru biosinteza melaninei în melanocitele B16F10 induse de -MSH. În plus, BHCP a scăzut expresia nivelurilor de proteine ​​MMP în fibroblastele induse de UV, care se așteaptă să aibă un efect antirid. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru a confirma efectele de albire și antirid ale BHCP prin studii clinice și pe animale. În cele din urmă, BHCP a fost identificat ca având atât efecte de albire, cât și efecte antirid, indicând potențialul său pentru dezvoltarea agenților terapeutici pentru bolile asociate cu hiperpigmentarea și ridurile.

ce este o cistanche

Pentru mai multe informații, vă rugăm să faceți clic aici.