Transportul de cationi organici îmbunătățit la stresul de forfecare apical în celulele renale canine Madin-Darby transfectate OCT2/MATE1-implica sensibilizarea ciliară

Pentru mai multe informatii:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz și Shuvo Roy

Departamentele de Bioinginerie și Științe Terapeutice (AJ, PS, DLK, SR) și Pediatrie (PRB),

Universitatea din California San Francisco (UCSF), San Francisco, California;

și Departamentul de Medicină, Divizia de Nefrologie, Centrul Medical al Universității Vanderbilt, Nashville, Tennessee (NF, WF)

ABSTRACT

Transport activ prinrenaltubii proximali joacă un rol semnificativ în eliminarea medicamentelor. În timpul dezvoltării medicamentului, estimările derenalexcreția sunt esențiale pentru determinarea dozei. Bioreactoarele renale care reproduc veri fiziologici ai rinichiului, cum ar fi stresul de forfecare indus de flux, pot prezice mai bine comportamentul medicamentului in vivo decât modelele in vitro actuale. În acest studiu, am investigat rolul efortului de forfecare asupra transportului activ al iodurii de 4-(4-(dimetilamino)-stiril)-N-metil piridinium (ASP plus) de către caninul Madin-Darbyrinichiceluleexprimând exogen transportatorii de cationi organici umani, transportorul de cationi organici 2 (OCT2) și proteina de extrudare multimedicamente și toxină 1 (MATE1). Celulele cultivate într-o placă paralelă sub perfuzie continuă cu mediu au format un monostrat strâns cu o barieră ridicată la inulină. Ca răspuns la nivelurile crescânde de forfecare (0.2-2 dine/cm), celulele au prezentat o creștere corespunzătoare a transportului de ASP plus , atingând o creștere maximă de 4.2-ori la 2. dine/cm² în comparație cu celulele cultivate în condiții statice. Acest transport a fost inhibat cu imipramină, indicând transportul activ prezent în condiții de forfecare. Celulele expuse la stres de forfecare de 2 dine/cm² au arătat, de asemenea, o creștere a expresiei ARN atât la oameni transfectați, cât și la OCT2 endogen (de 3,7- și, respectiv, de 2,0-ori). Îndepărtarea cililor de către sulfatul de amoniu a eliminat efectele forfecării asupra ASP plus transportul la 0.5 dine/cm² fără niciun efect asupra ASP plus transportul în condiții statice. Aceste rezultate indică faptul că efortul de forfecare afectează transportul activ al cationilor organici înrenaltubularcelulele epiteliale într-o manieră dependentă de cili.

Cistanche este bun pentru funcția renală

Introducere

În ciuda progreselor majore în metodele preclinice de selecție a candidaților optimi la medicamente, dezvoltarea de medicamente rămâne un proces lung și costisitor, care are un randament foarte scăzut de noi entități moleculare comercializate (Watkins, 2011). Un deficit major al modelelor preclinice este incapacitatea de a prezice clearance-ul și toxicitatea la om. Aproximativ 30 la sută dintre medicamentele care au succes în studiile preclinice eșuează la oameni ca urmare a valorilor de clearance-uri sau toxicități neprevăzute (Kola și Landis, 2004).

Rinichiul este o țintă deosebit de importantă pentru modelarea culturilor celulare in vitro, deoarece este responsabil pentru eliminarea a mai mult de o treime din toate medicamentele și majoritatea metaboliților (Morrissey et al., 2013). Therenaltubul proximal este important pentru testarea medicamentelor în timpul dezvoltării, deoarece efectuează cea mai mare parte a transportului activ al candidaților la medicamente și este deosebit de sensibil la leziuni toxice (Giacominiet al., 2010). Therenaltubuleste un monostrat de celule epiteliale cu filtrat care curge pe suprafața apicală. O membrană bazală stă la baza epiteliului tubular, iar capilarele peritubulare adiacente permit reabsorbția apei și a saluturilor. Micromediul tubului proximal, în special stresul de forfecare a fluidului și gradienții oncotici apicobazali, este reprodus incomplet prin tehnicile convenționale de cultură celulară. Bioreactoarele cu celule epiteliale care captează fiziologia proeminentă in vivo pot îmbunătăți acuratețea clearance-ului și predicțiilor de toxicitate derivate din testele in vitro (Pfaller și Gstraunthaler, 1998; Astashkina și colab., 2012).

Dovezile în creștere indică faptul că morfologia și funcționalitatea celulelor tubulare proximale pot varia în funcție de mediul de creștere, cum ar fi porozitatea suprafeței de creștere, expunerea la fluid pe ambele părți și/sau stresul de forfecare al fluidului. Lucrări anterioare de la Essig și Friedlander (2003), precum și din laboratorul nostru (Ferrell et al.2010), au demonstrat că rearanjarea indusă de fluxul de fluid tubular în citoscheletul apical de actină al celulelor tubulare proximale (Ferrell et al., 2010) . Ulterior, mai multe studii au demonstrat că stresul de forfecare afectează nivelurile de expresie și localizarea mai multor captări și transportatori de eflux, inclusiv antiporterul de sodiu-hidrogen 3. Na/K-ATPaza, transportorii de glucoză, canalul epitelial de sodiu și receptorii de endocitoză, megalina și tubulina. (Duan et al.,2010; Raghavan et al.,2014; Jansen et al..2016; Ernandez et al.,2018). Alte lucrări au demonstrat că fluxul de forfecare într-un sistem de bioreactor tubular se orientează și se alungeșterenaltubularcelule de-a lungul căii de curgere (Venzac et al. 2018). Dovezile in vitro indică faptul că unele modificări ale structurii citoscheletice și ale funcției de transport sunt probabil legate de funcția mecanosenzorială a cililor (Overgaard et al.. 2009; Raghavan et al..2014); cu toate acestea, puține studii au luat în considerare efectul stresului de forfecare asupra transportatorilor de medicamente din celulele renale. În plus, se știe puțin despre efectul diferitelor rate de forfecare asupra funcționalității celulei, în special cu expunerea susținută la forfecarea. Cele mai multe studii au luat în considerare o singură rată a tensiunii de forfecare și au efectuat doar experimente pe termen scurt (1-6 ore), făcând dificilă distingerea dintre efectele adevărate ale forfeierii și răspunsul la stres celular la schimbări bruște în micromediu (Duan et al.2010; Jang et al2013: Maggiorani et al.2015).

Aici, un bioreactor microfluidic a fost folosit pentru a examina efectul nivelurilor gradate de forfecare asuprarenaltransportatorii de medicamente pentru celulele tubulare proximale transportorul de cationi organici 2 (OCT2) și proteina de extrudare multimedicamente și toxină 1 (MATE1). Demonstrăm că creșterea tensiunii de forfecare apicală duce la creșterea transportului de cationi organici și a expresiei transportorului și că cilii sunt implicați în acest răspuns celular la stresul de forfecare.

Materiale și metode

Fabricarea și asamblarea dispozitivelor. Am publicat anterior proiectul nostru pentru un bioreactor cu plăci paralele care oferă o cale de curgere a fluidului de înălțime reglabilă pe partea apicală a celulelor și un rezervor static pe partea bazală (Brakeman și colab., 2016). Pentru munca prezentată aici, am adaptat designul nostru anterior pentru a crea un dispozitiv multiplexat cu patru căi de curgere separate pentru a permite testarea a patru condiții biologice simultan (Fig.1). Fiecare dispozitiv este compus din trei straturi: o bază cu un rezervor apical de 5-ml, o placă de mijloc pentru a susține insertul Snapwell (Costar, Corning, Corning, NY) cu o suprafață de celule de 1,12 cm² și o placă superioară care conține un rezervor bazolateral de la 1-la 2-ml. Farfuriile

au fost prelucrate din polisulfonă pentru a permite sterilizarea prin autoclavare. Garnituri din silicon tăiate cu laser de 500- până la 1000-um înălțime au fost plasate între fiecare set de plăci pentru a etanșa compartimentele de fluid și pe partea apicală pentru a defini înălțimea canalului. Bioreactorul a fost asamblat folosind șuruburi. Rezervorul media și capcana cu bule au fost încorporate în coloană. Prizele și ieșirile au fost conectate folosind conectori ghimpați la tubulatura de silicon Masterflex LS14 cu un diametru interior de 1,6-mm (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Fluxul fluidului și, prin urmare, stresul de forfecare apicală au fost reglați și controlați de o pompă peristaltică (Cole Parmer).

Cultură și flux celular. Celulele MDCK transfectate fie cu un vector gol, fie cu o pereche de transportatori de absorbție și eflux (hOCT2/hMATE1) (Konig et al..2011) au fost furnizate de Dr. Martin Fromm (Erlangen, Germania) și cultivate în mediu esențial minim cu soluție echilibrată de sare Earle (UCSF Cell Culture Facility) cu 10% ser fetal bovin (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) și 1% penicilină-streptomicină (UCSF Cell Culture Facility). Cinci sute de micrograme per mililitru de higromicină (UCSF Cell Culture Facility) și 100 mg/h ml geneticină (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) au fost adăugate în mediu pentru celulele dublu transfectate. Pentru experimentele cu flux, celula MDCK hOCT2/hMATE1 au fost placate pe partea inferioară a inserțiilor Snapwell (Corning) la o densitate de 300,000 celule/godeu (250,000 celule/cm"), crescute în condiții statice până la confluență și apoi plasate în bioreactorul. Fluxul de mediu apic a fost crescut timp de 7 zile de la 0,1 la 1-6mlmin până la atingerea tensiunii de forfecare dorite și apoi a fost lăsat stabil timp de 72 de ore înainte de experimentare. Celulele au fost crescute în condiții statice pentru aceeași perioadă de timp ca și martorii .

Imunofluorescență. Celulele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă (Thermo Fisher Scientific), permeabilizate cu 0,1% Triton-Xin PBS (Sigma-Aldrich) și blocate cu albumină serică bovină (Sigma-Aldrich). Ulterior, au fost incubați cu o diluție 1:50 de anticorp monoclonal de șoarece marcat cu Alexa 488 zonula occludens-1 (Life Technologies, Carlsbad, CA) sau un anticorp monoclonal de șoarece primar acetilat -tubulină (Life Technologies) timp de 60 de minute. Celulele tratate cu anticorpul a-tubulină au fost apoi incubate cu un anticorp secundar de capră 561 anti-șoarece (Life Technologies) și faloidină (Thermo Fisher Scientific) pentru colorarea cu F-actină. Imaginile au fost efectuate folosind un microscop confocal spectral Nikon (Tokyo, Japonia) cu un obiectiv de ulei de 40x.

Performanță barieră. Inulina, un polimer de 5000 Da, este un marker binecunoscut al ratei de filtrare glomerulară și este un marker al scurgerii tubului proximal in vivo (Sohtell et al, 1983):

Inulina marcată cu FITC (Sigma-Aldrich) a fost adăugată în mediul apical și a fost lăsată să curgă prin dispozitive. Probele au fost colectate din rezervorul bazal la fiecare 24 de ore și analizate pentru conținutul de inulină folosind un cititor de plăci cu fluorescență Genios Pro (Tecan, Mannedorf, Elveția). Funcția de barieră a monostratului celular a fost calculată din nivelurile de inulină măsurate în compartimentele apicale și bazale, așa cum este descris de ecuația 1. Aici, Capital este concentrația de inulină în compartimentul apical și C Mal este concentrația din compartimentul bazal. Inulinleak a fost calculată ca concentrația din compartimentul bazal (donator) împărțită la aria celulei după 24 de ore.

ASP plus Transport. Genele transportoare transduse au fost induse cu 10 mM Na-butirat (Sigma-Aldrich) cu 24 de ore înainte de un experiment de transport, așa cum s-a descris anterior (Konig et al, 2011). Când este cazul, celulele au fost incubate cu un inhibitor (500 μM imipramină sau 1 mM cimetidină (Sigma-Aldrich)) pe partea bazală timp de 30 de minute, urmat de adăugarea a 25 μM 4-（4-dimetilamino）- stiril-N-metil piridiniu (ASP plus) (Life Technologies) și incubare timp de 1 oră. Probele au fost colectate din mediile apicale și bazale. Celulele au fost apoi clătite cu soluție salină tamponată cu fosfat rece cu gheață de trei ori și lizate pentru măsurarea ASP plus acumulare și transport. Experimentele de transport au fost efectuate simultan pe celule sub forfecare și cultivate în condiții statice. Concentrația ASP plus a fost cuantificată pe un cititor de plăci cu fluorescență Genios Pro (Tecan) la o lungime de undă de excitație de 485 nm și o lungime de undă de emisie de 590 nm.

Cuantificarea proteinelor. Celulele au fost lizate cu tampon de liză NaOH SDS-10M 1% în timp ce se agită peste noapte. Conținutul de proteine ​​a fost măsurat folosind un kit standard de analiză a proteinei Pierce BCA (Thermo Fisher). Acolo unde a fost cazul, conținutul de proteine ​​a fost normalizat la zona de creștere celulară.

Expresia ARN. ARN-ul a fost extras din celule folosind un kit de extracție RNeasy ARN (Qiagen, Hilden, Germania), iar cADN-ul a fost generat folosind un kit de script (Bio-Rad, Hercules, CA). ADNc a fost utilizat pentru detectarea OCT2 și MATE1 la om și la câine și glicoproteina P de câine (P-GP) prin reacția cantitativă în lanț de transcriptază inversă-polimerază folosind un test Tagman și sonde (Applied Biosystems) pe instrumentul Fast Realtime PCR (Applied Biosystems). Proteina ribozomală S18 (RS-18) a fost utilizată ca control menajer. Efectul efortului de forfecare asupra expresiei transportorului a fost analizat utilizând metoda 4ACt utilizând nivelurile de transportor exprimate în raport cu RS-18 (Peters et al.2007; Schmittgen și Livak, 2008). P-GP a fost folosit ca măsură a efectelor globale ale tensiunii de forfecare asupra expresiei transportorului.

Decilierea. Celulele au fost crescute până la confluență și apoi incubate în absența sau prezența sulfatului de amoniu 30 mM (Fluka AG) timp de 24 de ore înainte de măsurarea ASP plus transport (Oxergard și colab. 2009). Prezența cililor a fost determinată prin imagistica a-tubulinei așa cum este descris deja aici.

Statistici. Toate experimentele au fost efectuate în trei exemplare, cu minim două replici tehnice în cadrul fiecărui experiment. Datele sunt exprimate ca medie ± SD și sunt reprezentate grafic ca diagrame cu casete și mustăți. Analizele statistice au fost efectuate prin analiză nepereche unidirecțională sau bidirecțională a varianței și o valoare P a<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Rezultate

Morfologia celulară și funcția de barieră. Analiza recentă Immunofluo a celulelor plasate sub flux a dezvăluit formarea uniformă a monostratului cu proteina cu joncțiune strânsă, zonula occludens-1, localizată în joncțiunile strânse dintre celule atât în ​​condiții statice, cât și în condiții de flux (Fig. 2, A-C). Cuantificarea conținutului total de proteine ​​a demonstrat o creștere de până la 1.6-ori a conținutului de proteine ​​pe centimetru pătrat al monostratului ca răspuns la solicitarea de forfecare (Fig. 2D). Apoi, am măsurat permeabilitatea inulinei, un marker al scurgerii tubului proximal, de-a lungul monostratului. Dispozitivele au păstrat o rată de performanță a barierei de 97,9% 6 1,42% pe parcursul a 7 zile de cultură sub până la 2 dine/cm2 de efort de forfecare (Fig. 2E), rezultând o rată finală de scurgere de inulină în ziua 6 a { {15}},13–0,69 mg/cm2 pe zi.

Efectul tensiunii de forfecare asupra transportului de cationi organici. Transportul ASP plus, un substrat auto-fluorescent de OCT2 și MATE1, a fost măsurat timp de 1 oră la diferite niveluri de efort de forfecare (0.2-2 dine/cm²). Celulele MDCK care exprimă exogen hOCT2 și hMATE1 au arătat o creștere de 4.2-ori a ASP plus transportul ca răspuns la stresul de forfecare de 2 dine/cm², așa cum se reflectă atât în ​​măsurarea acumulării celulare (Fig. 3A) cât și a transportului transcelular (Fig. 3B). Efectul efortului de forfecare asupra ASP plus acumularea sau transportul transcelular a fost similar sub o tensiune de forfecare de 0.5 și 2 dine/cm². Pentru a determina dacă transportul ASP activ plus a fost crescut, transportul ASP plus de către celulele expuse la 0,2 din/cm de efort de forfecare a fost măsurat cu sau fără pretratare cu imipramină 500 uM, un OCT{{20} } și inhibitor specific1-MATE. Transportul ASP plus a fost inhibat de imipramină 60,3% ± 15,8% în condiții de forfecare, comparativ cu 47,6% ±19,7% în condiții statice (Fig.3C).

Pentru a înțelege mai bine această observație, efectul stresului de forfecare asupra expresiei OCT2 uman (transfectat), OCT2 canin (endogen) și P-GP canin (endogen) a fost măsurat în celulele expuse la diferite niveluri de forfecare timp de 72 de ore după o creșterea lentă a forfecarea timp de 7 zile (Fig. 4). În comparație cu celulele cultivate în condiții statice, celulele MDCK expuse la forfecare au prezentat o expresie crescută a OCT2 uman și endogen transfectat (până la 3,7- și, respectiv, de 2,0-ori), fără niciun efect semnificativ. asupra expresiei MATE1 transfectat sau P-GP endogen.

Rolul Cilia în răspunsul la forfecare. Imagistica a arătat că celulele MDCK dublu-transfectate exprimă cili atât în ​​condiții statice, cât și în condiții de flux (Fig. 5, A și E). Expunerea celulelor la 30 mM sulfat de amoniu timp de 24 de ore a cauzat o pierdere completă a cililor (Fig. 5, C și G). Este important că decilierea nu a avut efecte brute asupra joncțiunilor celulă-membrană, așa cum este măsurată prin imagistica actinei F, care ancorează proteinele cu joncțiune strânsă la joncțiunile celulă-membrană din celulele epiteliale (Fig. 5.D și HD (Stevenson și Begg. 1994). Deși există o oarecare îngroșare a colorației cu F-actină în aceste imagini, aceasta nu a fost o constatare consecventă și, prin urmare, nu am cuantificat acest efect. Deciliația nu a avut niciun efect asupra transportului de către celulele cultivate în condiții statice, dar a fost complet. a eliminat efectele efortului de forfecare asupra ASP plus transportul în celulele expuse la 0,5 dine/cm² de forfecare (Fig. 6).

Discuţie

Rinichiul joacă un rol central în eliminarea medicamentelor din corpul uman. Este important să se mimeze cu exactitate complexitatea fiziologiei renale pentru testarea medicamentelor in vitro, în special în ceea ce privește fluxul de fluid. S-a demonstrat că stresul de forfecare din fluxul fluidului afectează morfologia celulară și transportatorii de ioni in vitro, dar se știe puțin despre efectele asupra transportatorilor de medicamente (Duan și colab., 2010; Ferrell și colab., 2012; Jansen și colab., 2016) . În plus, majoritatea studiilor anterioare au măsurat doar efectul forfeirii pe termen scurt (1-6 ore), care este puțin probabil să izoleze complet efectele tensiunii de forfecare de alte răspunsuri celulare la stres (Duan și colab., 2010; Jang și colab. 2013; Maggiorani et al..2015).În aceste studii, ne-am concentrat pe efectele tensiunii de forfecare susținute (7 zile) din fluxul de fluid asupra transportului de droguri pentru a imita mai bine efortul de forfecare susținut experimentat derenaltubularcelule in vivo.

Înțelegerea modului în care transportatorii de medicamente răspund la stresul de forfecare susținut poate îmbunătăți predicțiile in vitro ale manipulării medicamentelor in vivo de către rinichi. Modelele de rinichi proiectate cu precizie in vitro pot standardiza testarea preclinica si pot reduce ratele de esec al medicamentului.

În această lucrare, a fost utilizat un bioreactor microfluidic cu plăci paralele pentru a determina efectele tensiunii de forfecare susținute asupra transportului de cationi organici de către OCT2 și MATE1 într-unrenaltubullinie celulara. Au fost luate în considerare mai multe linii celulare pentru aceste studii, inclusiv linii de celule umane, cum ar fi celulele tubulare umane proximale din grupul Hopfer (Orosz et al, 2004) și RPTECs (CRL-4031: American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser et al., 2008), dar celulele hOCT2/hMATE1 MDCK dublu transfectate au fost considerate cea mai potrivită alegere pentru acest studiu din mai multe motive. În primul rând, celulele MDCK demonstrează în mod constant atașarea robustă la inserțiile transwell, ceea ce le permite să reziste la stresul inițial al fluxului de fluid. În al doilea rând, aceste celule formează monostraturi strânse, ceea ce previne scurgerea și este esențial pentru studiul transportului transcelular al substraturilor marker. În cele din urmă, expresia exogenă a transportatorilor permite o detectare îmbunătățită a transportului activ și a efectului perturbațiilor.

Celulele plasate sub flux au format un monostrat confluent și au localizat o proteină cu joncțiune strânsă la periferia celulei. Ei au păstrat, de asemenea, o funcție de barieră ridicată, măsurată prin permeabilitatea la inulină. Capacitatea celulelor epiteliale de a forma un monostrat care previne scurgerile de lichide și proteine ​​este extrem de importantă pentru buna funcționare a tubului. Aici, scurgerea prin celulele MDCK a fost minimă la mai puțin de 1 ug/cm² pe zi și semnificativ mai mică decât cea prin celulele umane. Am arătat anterior că monostraturile de celule renale umane au o scurgere de inulină de 10-20 ug/cm² pe zi (Brakeman și colab., 2016), susținând concluzia că celulele hOCT2/hMATE1 MDCK au format un monostrat robust.

Transportul ASP plus a fost semnificativ crescut în celulele hOCT2/hMATE1 MDCK expuse la diferite niveluri de forfecare timp de 72 de ore în comparație cu controalele statice. ASP plus este preluat de OCT2(SLC22A2) și efluxat de MATE1 (SLC47A1), doi transportatori de cationi organici care lucrează în comun pentru a facilitarenalsecreția de medicamente utilizate în mod obișnuit, cum ar fi metformin și cisplatin (Biermann et al.2006; Wittwer et al.2013). Efecte similare ale tensiunii de forfecare au fost raportate pentru transportoarele de ioni din tubul proximal. Au fost raportate creșteri ale captării albuminei, reabsorbției ionilor și ale expresiei și funcției megalinei și tubulinei ca răspuns la creșterea tensiunii de forfecare (Overgaard și colab., 2009; Duan și colab., 2010: Ferrell și colab., 2012: Raghavan și colab., 2014). Expunere arenalcelulele tubulare proximale la stresul de forfecare este, de asemenea, asociat cu o apoptoză redusă și o recuperare mai rapidă de la toxicitatea acută a cisplatinei și o inhibare sporită a transportului de anioni organici (Jang și colab.2{1}}13). Deoarece stresul de forfecare din fluxul de fluid este prezent în mod constant în tubul proximal, aceste constatări susțin în mod colectiv utilizarea unor sisteme model in vitro mai fiziologice pentru a prezice dispoziția și toxicitatea medicamentelor renale. Este de remarcat faptul că nu există nicio diferență semnificativă în funcția transportorului între 0.5 și 2.0 din/cm² de efort de forfecare. Studiile anterioare ale lui Essig și Friedlander (2003) au descoperit că este necesar un nivel minim de forfecare de 0,17 dine/cm2 pentru a provoca o modificare a morfologiei celulare, iar alte studii au măsurat efectele asupra fiziologie de până la 1 dină/cm² (Duan și colab., 2010). Acesta este primul studiu care explorează efectele unei game de niveluri de forfecare mai mari și susținute asupra funcționalității transportatorilor renali de medicamente și este posibil ca mărimea diferenței biologice între 0,5 și 2,0 dine/cm² de forfecare pe care o avem. evaluat nu a fost suficient de mare pentru a permite identificarea diferențelor dintre aceste niveluri de efort de forfecare în testele noastre. Deși sunt necesare investigații suplimentare, rezultatele noastre pun în lumină condițiile necesare pentru modelele relevante din punct de vedere fiziologic și efectele nivelurilor crescute de forfecare din cauza bolii asupra manipulării medicamentelor renale.

Una dintre limitările metodelor noastre experimentale este că am abordat doar transportul la pH 7,4 folosind medii cu pH 7,4 atât pe părțile apicale, cât și pe cele bazale, mimând metodele experimentale descrise anterior pentru celulele hOCT2/hMATE1 MDCK (Konig et al..2011). Un gradient de pH apic la bazal poate afecta funcția OCT2 și MATE1 și, de obicei, există un gradient de pH în condiții fiziologice (Muller și colab., 2013). Prin urmare, metodele noastre ne-au limitat capacitatea de a evalua interacțiunea dintre un gradient de pH apic la bazal și stresul de forfecare asupra funcției OCT2 și MATE1. Deoarece am folosit un pH constant de 7,4 în toate condițiile experimentale, este puțin probabil ca această lipsă a gradientului de pH să fi afectat constatările noastre, dar limitează potențial aplicabilitatea constatărilor noastre la transportul OCT2 și MATE1 în prezența unui gradient de pH apic la bazal.

În mod surprinzător, expresia ARNm a OCT2 umană și endogenă transfectată a fost crescută în celulele expuse la toate nivelurile de forfecare în comparație cu controalele statice. Această suprareglare a expresiei transportorului a fost specifică, fără niciun efect măsurabil asupra expresiei P-GP endogene sau MATE1 transfectat. Reglarea în sus a expresiei transportorului oferă o perspectivă asupra mecanismului din spatele transportului crescut și poate fi rezultatul stabilității îmbunătățite a ARNm sau al transcripției crescute a ARNm. Este interesant de remarcat faptul că atât transportatorii transfectați, cât și cei endogeni au fost suprareglați, ceea ce este neașteptat deoarece OCT2 transfectat a fost exprimat sub un promotor de citomegalovirus și nu ar trebui să fie supus mecanismelor de reglare a expresiei genice endogene. Deși surprinzătoare, această observație nu este fără precedent. A fost raportat un efect similar asupra celulelor tubulare proximale transfectate cu OAT1 expuse la perfuzie, dar mecanismul pentru creșterea expresiei rămâne neclar (Jansen și colab., 2016). Într-un alt studiu, s-a constatat că semnalizarea Nrf2 joacă un rol în creșterea expresiei endogene MATE2-K ca răspuns la stresul de forfecare (Fukuda et al., 2017). Studii suplimentare în acest sens sunt justificate și vor face obiectul unor investigații viitoare.

Am identificat, de asemenea, că introducerea fluxului de forfecare apical a crescut conținutul de proteine ​​pe centimetru pătrat de celule. Acest efect a fost de aceeași magnitudine atât pentru 0,5, cât și pentru 2dyne/cm² de forfecare, similar cu efectul observat pentru expresia ARNm și transportul ASP plus. Există unele dovezi că efortul de forfecare induce mai înalterenalcelule epiteliale, ceea ce ar avea ca rezultat un volum mai mare de celule pe centimetru pătrat și astfel o creștere probabilă a proteinei pe centimetru pătrat; cu toate acestea, acest fenomen publicat anterior a fost doar o observație minoră într-un corp mai mare de date și nu a fost cuantificat (Long și colab., 2017). Creșterea proteinelor totale în celulele crescute în prezența fluxului de forfecare apical poate reprezenta conținutul normal de proteine ​​pentru sănătate.renaltubularcelule epiteliale care pot fi realizate numai prin expunerea celulelor la fluxul de forfecare apical. Prin urmare, nivelurile mai scăzute de conținut de proteine ​​în celulele crescute în cultură statică pot reprezenta o stare celulară anormală, așa cum ar putea apărea clinic în situații de flux apical scăzut de filtrat, cum ar fi leziunea acută a rinichilor. Acest fenomen merită un studiu suplimentar.

Se știe că cilii au roluri mecanosenzoriale în tubul proximal (Raghavan și Weisz, 2016). Prin urmare, pentru a determina dacă acestea joacă un rol critic în creșterea transportului mediat de OCT2 și MATE1-raportat aici, a fost măsurat efectul îndepărtării cililor asupra funcției transportorului. Blocarea completă a creșterilor dependente de forfecare a ASP plus transportul prin îndepărtarea cililor în studiile noastre este similară cu efectul găsit în studiile lui Raghavan și colab. (2014), care a demonstrat o reglare ascendentă dependentă de cili în endocitoză ca răspuns la fluxul de fluid. Sulfatul de amoniu are probabil alte efecte necaracterizate asupra comportamentului și funcționalității celulelor care pot avea un impact indirect asupra transportului de dizolvat. În ciuda posibilelor efecte în afara țintei, această metodă de deciliere testează rolul detecției ciliare asupra mișcării mediate de transportor a substanțelor dizolvate organice. Mecanismul de semnalizare dintre proteinele mecano-senzoriale din cili și transportor este în prezent necunoscut. O ipoteză este că funcția transportatorilor de cationi organici este modificată prin transportul ionic modificat. Îndepărtarea cililor este cunoscută pentru a modifica motilitatea soluților în celulele tubulare proximale, în special prin reducerea Nat/K plus. Localizarea membranei ATPazei și modificarea transportului paracelular (Overgaard și colab., 2009). Este posibil ca acest lucru să ducă la modificări ale funcției MATE1, un antiportor dependent de gradientul H. O altă ipoteză este că detectarea tensiunii de forfecare afectează expresia transportatorilor de cationi organici. Stresul de forfecare modulează funcția MATE2-K prin semnalizarea Nrf2 (Fukuda și colab., 2017). Alți transportatori de cationi organici pot răspunde în mod similar la solicitarea de forfecare, care ar fi eliminată atunci când cilii mecanosenzoriali sunt îndepărtați. Multe dintre acestea sunt necunoscute și necesită studii suplimentare. În mod interesant, îndepărtarea cililor nu a avut un efect semnificativ asupra ASP plus transportul de către celulele expuse la 0,2 dine/cm² de efort de forfecare, dar a fost observat un efect robust când tensiunea de forfecare a fost crescută la 0,5 dine/cm2. Acest lucru sugerează că cilii simt un nivel de prag de forfecare; la rândul lor, cilii semnalează modificări în expresia și funcția transportorului înainte de a se aștepta efecte măsurabile asupra transportului. În general, dependența transportului de cationi organici de detectarea ciliară a tensiunii de forfecare oferă o perspectivă asupra căii de semnalizare mecanosenzorială implicată și a nivelului minim de stres care ar putea fi necesar pentru a declanșa un răspuns robust la forfecare.

În rezumat, aceste date demonstrează că efortul de forfecare din fluxul fluidului are un efect semnificativ asupra funcției și expresiei transportorului de cationi organici în celulele MDCK. În plus, reglarea în sus a transportului de cationi organici a fost dependentă de prezența cililor. Propunem că efortul de forfecare apicală este o componentă importantă a oricărei modelări in vitro arenaltubularcelulelor și este probabil să fie o componentă importantă a modelării clearance-ului secretor renal și a nefrotoxicității medicamentelor. Mecanismul specific prin care semnalele de stres mecanic cresc activitatea și expresia transportorului este încă neclar și necesită studii suplimentare.

Referințe

Astashkina A, Mann B și Grainger DW (2012) O evaluare critică a modelelor de cultură celulară in vitro pentru screening-ul și toxicitatea medicamentelor cu randament ridicat. Pharmacol Ther 134:82–106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E și Ciarimboli G (2006) Caracterizarea mecanismelor de reglementare și a stărilor transportorului uman de cationi organici 2. Am J Physiol Cell Physiol 290: C1521–C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH și Ferrell N (2016) Un bioreactor microfluidic modular cu debit îmbunătățit pentru evaluarea celulelor epiteliale renale polarizate. Biomicrofluidics 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S și Wang T (2010) Modificări induse de stres de forfecare ale localizării și expresiei transportorului membranar în celulele tubulare proximale de șoarece. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY și Feraille E (2018) Nefrectomia de unire și stresul de forfecare a fluidului apical scad abundența ENaC în celulele principale ale conductelor colectoare. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763–F772.

Essig M și Friedlander G (2003) Stresul de forfecare tubular și fenotipul celulelor tubulare proximale renale. J Am Soc Nephrol 14 (Suppl 1): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD și Fissell WH (2010) Un bioreactor microfluidic cu electrozi de măsurare a rezistenței electrice transepiteliale (TEER) integrate pentru evaluarea celulelor epiteliale renale. Biotechnol Bioeng 107:707–716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT și Fissell WH (2012) Manipularea albuminei de către celulele epiteliale tubulare renale într-un bioreactor microfluidic. Biotechnol Bioeng 109:797–803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT și Fissell WH (2012) Un bioreactor microfluidic pentru studiile celulelor epiteliale în condiții de forfecare fluidă. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M și Kawamata Y (2017) Stresul de forfecare fluid stimulează expresia MATE2-K prin activarea căii Nrf2. Biochem Biophys Res Commun 484:358–364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM și colab.; International Transporter Consortium (2010) Transportatori de membrană în dezvoltarea medicamentelor. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY și Ingber DE (2013) Tubul proximal al rinichiului uman pe un cip pentru transportul medicamentelor și evaluarea nefrotoxicității. Integr Biol 5:1119–1129.

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF și colab. (2016) Tubulii renali bioinginerești excretă eficient toxinele uremice. Sci Rep 6:26715.

Kola I și Landis J (2004) Poate industria farmaceutică să reducă ratele de uzură? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C și Fromm MF (2011) Celule MDCK dublu transfectate care exprimă OCT1/MATE1 sau OCT2/MATE1 uman: determinanți ai absorbției și translocației transcelulare a cationilor organici. Br J Pharmacol 163:546–555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ și Weisz OA (2017) Endocitoza apicală a tubului proximal este modulată de stresul de forfecare a fluidului printr-o cale dependentă de mTOR. Mol Biol Cell 28:2508–2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL și colab. (2015) Alterarea indusă de forfecare a organizării epiteliale în celulele tubulare renale umane. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L și Giacomini KM (2013) Transportatori renali în dezvoltarea medicamentelor. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503–529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K și Fromm MF (2013) Rolul transportorului de cationi organici OCT2 și proteinelor de extruziune multidrog și toxinelor MATE1 și MATE2-K pentru transportul și interacțiunile medicamentoase ale lamivudinei antivirale. Biochem Pharmacol 86:808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI și colab. (2004) Potențialul de creștere, imortalizare și diferențiere al celulelor tubulare proximale umane adulte normale. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A și Yeaman C (2009) Deciliația este asociată cu remodelarea dramatică a joncțiunilor celulelor epiteliale și a domeniilor de suprafață. Mol Biol Cell 20:102–113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR și Day MJ (2007) Dezvoltarea și aplicarea unor teste interne multiple de gene de referință (de menaj) pentru normalizarea precisă a studiilor expresiei genelor canine. Vet Immunol Immunopathol 117:55–66.

Pfaller W și Gstraunthaler G (1998) Testarea nefrotoxicității in vitro--ce știm și ce trebuie să știm. Environ Health Perspect 106 (Supliment 2): 559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD și Weisz OA (2014) Reglarea dependentă de stres de forfecare a endocitozei apicale în celulele tubulare proximale renale mediate de cilii primari. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506–8511.

Raghavan V și Weisz OA (2016) Discernând rolul mecanosenzorial în reglarea funcției tubului proximal. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD și Livak KJ (2008) Analizarea datelor PCR în timp real prin metoda comparativă C(T). Nat Protoc 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B și Ulfendahl H (1983) FITC-inulină ca marker de tubul renal la șobolan. Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stevenson BR și Begg DA (1994) Efectele dependente de concentrație ale citocalazinei D asupra joncțiunilor strânse și a filamentelor de actină în celulele epiteliale MDCK. J Cell Sci 107: 367–375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S, et al. (2018) Proiectare tuburi mici cu modificări de diametru pentru studiul organizării celulelor renale. Biomicrofluidics 12: 024114.

Watkins PB (2011) Științe privind siguranța medicamentelor și blocajul în dezvoltarea medicamentelor. Clin Pharmacol Ther 89:788–790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J și Grillari-Voglauer R (2008) hTERT singur imortalizează celulele epiteliale ale tubilor proximali renali fără a le modifica caracteristicile funcționale. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y și Giacomini KM (2013) Descoperirea inhibitorilor potenți, selectivi ai transportului de extrudare a multidrogului și a toxinelor 1 (MATE1, SLC47A1) prin profilarea medicamentelor prescrise și modelarea computațională. J Med Chem 56:781–795.