Partea Ⅰ: Organoizi renali generați din celulele progenitoare eritroide ale pacienților cu boală polichistică renală autosomal dominantă

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice și colab.

Introducere

Polichistic autozomal dominantboală de rinichi(ADPKD) este cea mai frecventă cauză genetică a bolii renale cronice (CKD) la nivel mondial și este una dintre cele mai răspândite tulburări moștenite monogenice, afectând o populație estimată la 1:400-1000 [1].ADPKD (Autosomal dominant dominante). polichisticboală de rinichi) este cauzată de mutații ale genelor PKD1 (boala polichistică de rinichi de tip 1) și PKD2 (boala polichistică de rinichi de tip 2), care codifică policistina-1(PC1) și, respectiv, policistina-2 (PC2), rezultând alterarea cililor și formarea de chisturi. Ambele proteine ​​modulează numeroase căi moleculare, precum și morfogeneza și funcția tisulară. Cu toate acestea, mecanismele moleculare exacte care stau la baza cistogenezei rămân neclare. Este bine acceptat faptul că o mutație germinală urmată de o mutație somatică (a doua lovitură) în alela normală este necesară pentru cistogenie [2,3]. Mai mult, pe baza rezultatelor modelelor de șoareci ortologhi, s-a demonstrat că este necesară o ofensă renală suplimentară (a treia lovitură) pentru creșterea rapidă și severă a chisturilor în rinichii maturi [4,5]. Se pare că la om, cele mai multe lovituri secundare apar în timpul dezvoltării renale, ducând la formarea și creșterea chistică chiar și în uter. Prin urmare, severitatea și rata de progresie a bolii renale care rezultă din mutațiile PKD1 (boala polichistică de rinichi de tip 1) și PKD2 (boala de rinichi polichistică de tip 2) pot fi influențate de mai mulți factori, inclusiv momentul inactivării genelor, dezvoltarea rinichilor. stadiul, influența mediului, prezența leziunilor renale concomitente și diversitatea mutațiilor genetice.

Deși au existat nenumărate date referitoare la mecanismele fiziopatologice ale ADPKD (polichistică autosomal dominantă).boală de rinichi) colectate din studii care folosesc modele de șoarece ortologe și neortologe, sunt disponibile doar o mână de studii care se concentrează pe modele celulare umane ale cistogenezei [6]. În 2007, Takahashi și colab. [Z au reprogramat cu succes celulele somatice în celule stem pluripotente cu proprietăți embrionare, numindu-le „celule stem pluripotente induse” (iPSC). De atunci, multe surse de celule somatice au fost reprogramate în iPSC (celule stem pluripotente induse) din țesuturi animale sau umane (hiPSC) [Z], fibroblastii adulți reprezentând principala sursă a acestora din urmă. În 2013, Freedman et al.[8] hiPSC induse (celule stem pluripotente induse) din fibroblastele ADPKD (polichistice autosomal dominante)boală de rinichi) și au constatat o expresie ciliară redusă a policistenei-2, susținând utilizarea unor astfel de celule pentru a investiga patofiziologia bolii polichistice (PKD). Mai recent, Chen și colab. au raportat în 2016 că au obținut celule hiPS din celulele progenitoare eritroide [9].

În ultimii câțiva ani, au existat progrese semnificative în generarea de 3-organoizi dimensionali din iPSC-uri (celule stem pluripotente induse) [Z,10-12]. PrimarrinichiOrganoizii epiteliali tubulari pot fi derivati ​​din țesutul renal, precum și din urină, iar acești organoizi sunt un instrument important pentru modelarea personalizată a bolii, așa cum arată Schutgens și colab. [13].În studiile ulterioare, Freedman et al.[14] au putut generarinichiorganoizi derivate dintr-o linie celulară hiPS disponibilă comercial, stabilind un protocol pentru a genera tipurile de celule prezente în masa meta-nefrică care dau naștere tuturor structurilor nefronului. Apoi, prin doborârea PKD1 (polichistic de tip 1rinichiboala) sau genele PKD2 (boala polichistică renală de tip 2), acești investigatori au observat formarea chistului dinrinichitubii. Având în vedere toate aceste tehnologii avansate și inovatoare, ne-am propus să obținem iPSC-uri (celule stem pluripotente induse) din celulele progenitoare eritroide circulante ale ADPKD (polichistic autosomal dominant).boală de rinichi)pacienți și testarea dezvoltării organoidelor renale in vitro pentru a recapitula etapele implicate în organogeneză, încercând să evoce unele evenimente fiziopatologice legate de cistogenia precoce.

Faceți clic pentru a cistanche efecte secundare și beneficii pentru rinichi

Metode Selectarea pacientului

Au fost recoltate probe de sânge de la două paciente de sex feminin neînrudite (PT1 și PT2) diagnosticate clinic cu ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) (PT1: 66 de ani, eGFR 43,8 mL/min la 1,73 m2 și PT2: 56 de ani, eGFR 60,2 mL/ min per 1,73 m2), urmată la Boala Polichistică de Rinichi. Clinica ambulatorie a Diviziei de Nefrologie a Universității Federale din Sao Paulo (UNIFESP) și un alt eșantion a fost recoltat de la o femeie sănătoasă, care a servit drept control pentru stabilizarea și normalizarea tehnicii. Diagnosticul ADPKD (Boala polichistică renală autosomal dominantă) sa bazat pe antecedentele familiale pozitive și pe prezența chisturilor renale, conform criteriilor de diagnostic ecografic de Pei și colab.[15]. Ambii pacienți aveau rinichi și ficat chistici (Imaginile prin rezonanță magnetică sunt prezentate în Fig S1B). Studiul a fost revizuit și aprobat de Comitetul consultativ de etică al Universității (CEP UNIFESP, „Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo”, Nr.1199.-0079-10/2018). După un interviu pentru a explica scopul studiului, atât pacienții, cât și controlul sănătos au semnat formularul de consimțământ informat.

Expansiunea celulelor progenitoare eritroide izolate din sânge integral Probele de sânge au fost colectate într-un tub vacutainer care conține EDTA (ca anticoagulant) la temperatura camerei. Celulele progenitoare eritroide (EP) au fost apoi separate printr-o metodă RosetteSep (15216; Stem Cell Technologies), care a îndepărtat celulele nedorite, cum ar fi eritrocite mature și trombocite, păstrând în același timp populația PE dorită. Datorită concentrației scăzute de EP în sângele integral, celulele au fost expandate și cultivate într-un mediu de cultură specific care conține citokine și suplimente (mediu X-Vivo, Lonza). Celulele EP au fost identificate prin citometrie în flux folosind receptorul transferinei (CD71) și glicoforină A (Gly A) ca markeri marcați cu GFP (S2 Fig).

Reprogramarea celulelor progenitoare eritroide

Celulele EP extinse au fost colectate și nucleofectate folosind un kit de reprogramare Epi5 Episomal iPSC (celule stem pluripotente induse) (Thermo Fisher) care conține un amestec optimizat de cinci factori de reprogramare (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc, și Klf4). Transfecția (electroporația) a fost efectuată cu vectori epizomali (fără virusi, neintegratori) dintr-un kit de factor Lonza Nucleo. După transfecție, celulele au fost placate în mediu de cultură specific ReproTeSR pentru reprogramare (Stem Cell Technologies) în condiții standard de cultură celulară (37C, 95% CO și 5% O).

Cariotiparea

Pentru a verifica dacă procesul de reprogramare a păstrat integritatea cromozomială, analiza cariotipului a fost efectuată la Departamentul de Genetică al UNIFESP. Celulele au fost tratate cu 100 ul de colchicină (0,08ug/ml) în 5 ml de iPs. mediu de cultură celulară pentru a induce oprirea ciclului celular, care a fost urmată de adăugarea unei soluții de KCI hipotonică 0,075 M pentru a induce umflarea nucleară; celulele au fost apoi fixate cu un amestec de metanol și acid acetic (3:1). Au fost recoltați cromozomii de metafază și colorarea Wright a fost utilizată pentru analiza citogene a benzilor G (S3 Fig).

Caracterizarea coloniei iPSC (celule stem pluripotente induse).

Celulele EP au fost reprogramate de vectori epizomali au format colonii tipice iPSC (celule stem pluripotente induse) și au prezentat un cariotip normal (S3 Fig). Caracteristicile coloniei iPSC (celule stem pluripotente induse) au fost comparate cu cele ale unui control stabilit derivat din linia celulei H9 (hESC, Human Embryonic Stem Cells, WA09, disponibil de la Wicell Research Institute, SUA)( Fig 1B). Deoarece iPSC-urile (celulele stem pluripotente induse) au prezentat o morfologie tipică, markerii de pluripotență au fost identificați prin imunofluorescență. Celulele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă timp de 30 de minute la temperatura camerei. După fixare, probele au fost spălate cu PBS de trei ori, blocate în 5% PSA și 0,3% Triton-X-100/DPBS și incubate peste noapte cu anticorpi primari (Cell Signaling, Ma, EUA), și anume, OCT4(1). :400 diluție) ca test de pluripotență. În ziua următoare, o nouă lamă a fost pregătită, spălată în PBS și incubată cu un anticorp secundar Alexa Fluor (diluție 1:200, semnalizare celulară) și a fost adăugat DAPI (1:1000, Invitrogen, MA, SUA) pentru nuclear Identificare.

Fig 1. Generarea și caracterizarea iPSC-urilor(celule stem pluripotente induse). iPSC-urile au fost reprogramate din celule progenitoare eritroide extinse (EP) de la un control sănătos (HC) și doi pacienți diferiți cu ADPKD (PT1 și PT2).

A. Generarea schematică în trepte a organoidelor renale B. Similitudinea iPSC (a. imagine tipică a iPSC din celulele embrionare H9 comerciale. b. iPSC din celulele eritroide progenitoare de la controlul sănătos)

C. Morfologia coloniilor iPSC D. Caracterizarea pluripotentei iPSC observată la un microscop cu fluorescență digital inversat EVOS fl.

Etichetarea anticorpului OCT4 a fost utilizată ca marker de pluripotență pentru a caracteriza natura de pluripotență a coloniilor HC, PT1 și PT2.

Nucleele celulare au fost etichetate cu DAPI (bară de scară pentru Fig 1B: 200 μm; bară de scară pentru Fig 1C: 1000 μm; bară de scară HC / PT2 pentru Fig 1D: 1000 μm; bară de scară PT1 pentru Fig 1D: 200 μm).

Capacitatea iPSC-urilor (celule stem pluripotente induse) de a se diferenția în toate cele trei straturi germinale

iPSC-urile (celule stem pluripotente induse) au fost crescute în 6-plăci de godeuri acoperite cu Matrigel (1:10, BD Biosciences, NY, EUA) în mediu de cultură mTeSR1 (Stem Cell Technologies, BC, Canada). Pentru a preveni diferențierea iPSC-urilor (celule stem pluripotente induse), coloniile au fost trecute manual prin fragmentare mecanică cu un vârf de pipetă la microscop sau au fost disociate prin digestia enzimatică folosind Gentle Cell (Life Technologies) (S4 Fig). Folosind aceste metode, iPSC-urile (celule stem pluripotente induse) au fost menținute pentru 22 de treceri în serie pentru a se asigura că celulele au încorporat corect factorii de reprogramare. IPSC-urile (celule stem pluripotente induse) au fost apoi stimulate să se diferențieze în cele trei straturi germinale folosind un kit de diferențiere STEMdiff Trilineage (Stem Cell Technologies). După cinci zile, celulele au fost recoltate pentru analiza markerilor specifici vârstei liniei de mezoderm și endoderm, iar după șapte zile au fost analizate pentru ectoderm, conform protocolului STEMdiff Trilineage Differentiation (S5 Fig).

Caracterizarea moleculară a tuturor celor trei linii germinale prin qRT-PCR

ARN total din culturile celor trei straturi germinale a fost extras folosind un kit GE RNA Spin Mini (GE Healthcare, SUA) și apoi convertit în ADNc folosind un kit de transcripție inversă de mare capacitate (Applied Biosystems, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. PCR cantitativă în timp real (gRT-PCR) a fost efectuată folosind un kit SYBR Green PCR (Applied Biosystems, SUA) conform protocolului producătorului. Nivelurile de expresie a ARNm au fost calculate folosind metoda 2^Ct. Hidroximetilbilan sintaza (HMBS) și gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) au fost utilizate ca controale interne, iar expresia OCT4 a fost utilizată ca control cantitativ. Expresia SOX17 a fost folosită pentru a identifica diferențierea în endoderm, CXCR4 a fost utilizat pentru a identifica diferențierea în mezoderm și PAX6 a fost utilizat pentru a identifica diferențierea în ectoderm (S6 Fig). Toate secvențele de primeri sunt specificate în Tabelul S1 și curba de eficiență a fost evaluată pentru fiecare pereche de primeri.

Imunofluorescență pentru diferitele straturi germinale

iPSC-urile (celule stem pluripotente induse) au fost induse să se diferențieze pe lamele de acoperire în plăci cu șase godeuri. După diferențiere, lamelele au fost îndepărtate din godeurile originale și transferate pe o nouă placă, unde celulele au fost fixate cu paraformaldehidă 4% și apoi spălate cu PBS, așa cum este descris mai sus. Au fost utilizați anticorpi primari împotriva OCT4 (1:400; Cell Signaling), CXCR4 (1;100; Cell Signaling), PAX6 (1:100; Thermo Fisher) și SOX17 (1:100; R&D Systems). Fluorescența a fost evaluată folosind un anticorp secundar Alexa Fluor (1:200; Semnalizare celulară).

Diferențierea organoide renale de iPSC (celule stem pluripotente induse)

Renalorganoizii au fost generați urmând protocolul descris de Cruz și colab. [6] cu unele adaptări. Pe scurt, 50,000 iPSC (celule stem pluripotente induse) de la HC și doi pacienți cu ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) au fost utilizate pentru a produce suspensii de celule individuale cu soluție de detașare Accutase (Stem Cell Technologies). Celulele unice au fost suplimentate cu inhibitor de Rho-kinaza 10 uM (Y27632, Stem Cell Technologies sau Stemgent). După 16 ore, mediul de cultură a fost înlocuit cu 1 ml de mTeSR1 plus 2,5% Matrigel plus 10 μuM Y27632. După 20 de ore, mediul a fost înlocuit doar cu 1 ml de mTeSRI; 14 ore mai târziu, mediul de cultură a fost înlocuit și celulele au fost induse cu 6 uM CHIR99021 (AT104; Stem Cell sau Stemgent GSK-3b inhibitor/Wnt pathway agonist) plus Advanced RPMI (Thermo Fisher) plus Glutamax (Life Technologies) plus 10 ug/ml antibiotic (Ampicilină; 1:1000; Gibco ). În cele din urmă, 36 de ore mai târziu, mediul de cultură a fost înlocuit cu mediu DRB care conține RPMI avansat (Thermo Fischer) plus Glutamax (Thermo Fischer) plus supliment B27 (17504-044; Life Technologies) plus antibiotic. Mediul DRB a fost schimbat la fiecare trei zile timp de 28 de zile. Această perioadă (28 de zile) a fost suficientă pentru ca organoizii să fie vizibili la microscopie.

Caracterizarea moleculară a organoizilor prin RT-PCR

Expresia genică semi-cantitativă a fost evaluată prin RT-PCR în timpul procesului embriogen, ARN-ul total fiind purificat din structurile celulare formate la zile 0(iPSCs (celule stem pluripotente induse)) și la 14, 21, 28 și 35 de zile după inducerea diferențierii. Expresia WT1 (rinichi în curs de dezvoltare), AQP1 (tub proximal) și ECAD (marker epiteliu chist) a fost evaluată. GAPDH a fost utilizat ca control intern. Expresia OCT4 a fost folosită ca standard cantitativ.

Rezultate

Obținerea iPSC-urilor (celule stem pluripotente induse) de la progenitori eritroizi (EP)

Este rezumat protocolul folosit pentru a obține organoizi renali de la progenitorii eritroizi. Expansiunea EP a dus la celule de 1x10 grade după aproximativ 20 de zile (S2A Fig), iar aproximativ două luni mai târziu, EP-urile au fost identificate prin exprimarea markerilor CD71 și Gly A. Eficiența metodei de separare a relevat expresia; 88% din celule au fost CD71 pozitivi, iar 57,4% au fost Gly A pozitivi (S2BFig).

După verificarea faptului că celulele sunt EP, acestea au fost transfectate cu factori de reprogramare (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc și klf4) și apoi au fost menținute într-un mediu specific pentru reprogramare (ReproTeSR, Stem Cell Technologies) timp de aproximativ cinci zile. iPSC-urile (celule stem pluripotente induse) au dezvoltat caracteristici celulare tipice prin formarea de colonii cu o morfologie diferită de cea a celulelor nereprogramate prezente în aceeași cultură de celule. Celulele au fost monitorizate până când am observat colonii tipice asemănătoare iPSC (celule stem pluripotente induse) care erau similare cu coloniile din linia celulară comercială H9 (Eig 1B). Coloniile iPSC (celule stem pluripotente induse) au fost, de asemenea, recunoscute prin dimensiunea lor relativ mai mare, împachetare celulară strânsă, formă omogenă bine definită și margini regulate. Identificarea a fost facilitată de gradul scăzut de creștere excesivă a coloniei din celule diferențiate într-un mediu de reprogramare fără alimentator (Eig 1C). Nu s-au găsit diferențe detectabile între coloniile iPSC de la pacienții cu HC și ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) (PTl și PT2) în ceea ce privește morfologia coloniei și markerii de pluripotență, așa cum se arată în Fig 1D.

iPSC-urile (celule stem pluripotente induse) au fost caracterizate în continuare prin capacitatea lor de a se diferenția în cele trei straturi germinale. Imaginile tipice ale progresiei dezvoltării stratului germinativ în celulele din HC sunt prezentate în Fig. S5. Dezvoltarea celor trei straturi germinale a fost verificată prin morfologie tipică (Eig 2A) și prin imunofluorescență marcare pentru markerii de diferențiere, și anume, FOXA2 pentru endo-derma. , actina musculară netedă (SMA) pentru mezoderm și SOX2 pentru ectoderm (Eig2B-2D). Controalele negative pentru anticorpi sunt prezentate în S7. Fig. 2E prezintă nivelurile de expresie a genei ale markerilor specifici ai endodermului (SOX17), mezodermului (CXCR4) și ectodermului (PAX6), așa cum au fost detectați prin RT-PCR.

Fig 2. Caracterizarea celor trei straturi germinale. Pacienți de control sănătos (HC) și ADPKD1 (PT1 și PT2).

A. Morfologie tipică a celor trei straturi germinale. Straturile germinale au fost caracterizate prin colorare prin imunofluorescență folosind anticorpi specifici. B. Endoderm (FOXA2),

C. Mezoderm ( SMA) și D. Ectoderm (SOX2). Nucleii celulari au fost colorați cu DAPI. Ultimele coloane arată imagini îmbinate.

E. Expresia genică a OCT4 indică pluripotența iPSC-urilor, SOX17 a fost un marker pentru endoderm, CXCR4 a fost un marker pentru mezoderm și PAX6 a fost un marker pentru ectoderm (n=2).

Expresia OCT4 de către iPSC a fost folosită ca control cantitativ intern. Expresia OCT4 a fost nedetectabilă în celulele celor trei straturi germinale (scara: 200 μm).

Generarea de organoizi renali din iPSC (celule stem pluripotente induse)

Structurile renale tridimensionale au fost generate din iPSC (celule stem pluripotente induse) derivate de la HC și de la pacienții cu ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) urmând pași care recapitulează dezvoltarea embrionară. În fig.3 sunt prezentate etapele care sunt necesare pentru obținerea structurilor embrionare respective. Coloniile iPSC (celule stem pluripotente induse) (Eig 3A) au fost disociate cu Accutase (Fig 3B) pentru a obține iPSC unice (celule stem pluripotente induse) (Fig 3C). Având în vedere procesul embriogen normal, este de așteptat ca coloniile să se diferențieze într-o blastulă și apoi într-o gastrulă, dar diferențierea spontană a iPSC-urilor (celule stem pluripotente induse) în cultură este încă o provocare, deoarece celulele suferă spontan apoptoză [16]. Pentru a evita acest rezultat nedorit, un inhibitor de semnalizare ROCK (inhibitor de Rho-kinaza Y27632 de 10 μM) a fost adăugat la 16 ore după stadiul cu o singură celulă. Inhibarea căii ROCK împiedică celulele să declanșeze căile morții, permițându-le să supraviețuiască și să se adapteze pentru a continua către procesul de diferențiere. IPSC-urile (celule stem pluripotente induse) au crescut apoi până la atingerea stadiului de epiblast, care este caracterizat prin prezența cavităților sferoide (Fig 3D). Apoi, a fost adăugat un inhibitor puternic GSK-3b/agonist al căii Wnt (CHIR99021), care a fost urmat de adăugarea de mediu DRB pentru a induce tranziția epitelial-mezenchimală (Fig. 3E și 3E) și, în final, tranziția mezenchim-epitelială ( Fig 3G); acești pași au permis epitelizarea și formarea secvențială a agregatelor pre-tubulare și a veziculelor renale (Eig 3H), care au permis în cele din urmă formarea de organoizi tubulari renali (Fig 3D). Toate aceste etape de embriogeneză in vitro au fost similare pentru celulele derivate atât de la pacienți cu HC, cât și de la ADPKD (boală polichistică renală autozomal dominantă).

Prezența structurilor tubulare a fost verificată prin exprimarea unor markeri specifici prin imunofluorescență: NHE3 și AQP1 pentru tubii proximali (Eig4A) și NPHS2 pentru glomeruli (Eig 4B). În schimb, marcarea AQP2 nu a fost detectată (Eig 4B), confirmând că aceasta metodologia a permis doar dezvoltarea masei metanefrice dar nu si a mugurelui ureteral. Markerul ECAD nu a fost detectat în absența forskolinei (Fig 4B).

Pentru a verifica prezența markerilor specifici exprimați pe parcursul procesului de dezvoltare a rinichilor progenitori, toate probele (HC, PT1 și PT2) au fost colectate în cinci puncte ale întregului proces de diferențiere: ziua 0(iPSCs (tulpina pluripotentă indusă). celule)), zilele 14, 21, 28 și apoi în ziua 35 (7 zile după inducerea chistului). Cursul de timp al expresiei genelor a relevat diferențierea în timpul procesului de embriogeneză, așa cum se arată în Fig 5A-5C. Markerul de pluripotență OCT4 a fost exprimat prin iPSC (ziua O), dar nivelurile sale au fost reduse pe parcursul a 14 zile, atingând niveluri foarte scăzute după diferențiere. În schimb, expresia markerilor specifici ai mezenchimului metanefric (WT1) și ai tubului proximal (AQP1) a crescut progresiv atunci când procesul de diferențiere a fost inițiat până în ziua 14, atingând un platou în ziua 21. Figura 5D arată expresia ECAD, o cistogenie. marker, în ziua 35, adică 7 zile după inducerea chistului de către forskolină. În absența forskolinei, expresia ECAD a fost foarte scăzută, chiar și la pacienții cu ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă). Cu toate acestea, când a fost adăugată forskolina (ziua 28), ambii pacienți au prezentat o expresie crescută a ECAD; dar același model nu a fost observat în organoid HC care a rămas cu niveluri scăzute de expresie ECAD chiar și în prezența forskolinei.

Prezența chisturilor formate din organoizii stimulați cu forskolin a fost evidentă pentru pacienții cu ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă), așa cum se arată în Eig6. Panoul superior prezintă imagini ale organoizilor în ziua 28, înainte de adăugarea forskolinei (Eig6Aa). forskolina arătând prezența unor structuri asemănătoare chistului în probele de la ambii pacienți (PT1 și PT2), dar nu și în proba HC. Prezența chisturilor a fost verificată și prin colorare prin imunofluorescență (Fig 6B). Etichetarea ECAD nu a fost detectată în organoidul HC, dar a fost observată în mod clar în organoizii de la ambii pacienți. Interesant este că poate fi observată și prezența unui lumen de chist.

Fig 3. Generarea organoidelor tubulare.

Imagini de contrast de fază ale generării de organoizi renali tubulari epiteliali la 28 de zile din iPSC-uri generate din grupurile HC, PT1 și PT2. În primele 36 de ore, iPSC-urile au fost menținute în cultură 3D.

Apoi, au fost disociate, transformate în celule unice și tratate cu Y-27632, ceea ce a permis reorganizarea celulară și supraviețuirea, producând sferoizi epiblasti (d).

Apoi, s-au adăugat CHIR99201 și DRB, activând calea Wnt/-catenină și permițând diferențierea în organoizi tubulari (I).

Morfologia dintre sferoizii derivați de la pacienții cu ADPKD și de la un donator de HC este similară. (Bară de scară pentru a și f: 1000μm; bară de scară pentru b, cd, e, g, h și i: 200μm).

CLICK AICI PENTRU PARTEAⅡ