Absența aparentă a conversației încrucișate între mușchii scheletici și rinichi dependente de BMAL1-la șoareci

FORMULARE PENTRU IERBA BOALA CRONICA DE RINCHI

Cuvinte cheie: gene ale ceasului circadian; funcția renală; fiziologie integrativă

1. Introducere

Ritmurile circadiene sunt proeminente în majoritatea proceselor fiziologice. Controlul acestor ritmuri este mediat parțial de un ceas central care se află în nucleul suprachiasmatic al creierului, dar și ceasurile circadiene periferice influențează ritmurile în funcția fiziologică [1]. Ceasul molecular constă dintr-o buclă de feedback de transcripție-traducere. Pe scurt, proteinele de bază aril-hidrocarbură-receptor-nuclear-translocator-like protein (ARNTL; sau BMAL1) și ciclurile de ieșire locomotorii circadiane kaput (CLOCK) reglează pozitiv transcrierea genelor Period și Cryptochrome; proteinele Period (PER) și Cryptochrome (CRY) feedback și inhibă activitatea BMAL1/CLOCK (revizuită în [2,3]). Perturbarea proceselor controlate de circadian este asociată cu multe patologii, inclusiv boli cardiovasculare și de rinichi [4,5]. Până în prezent, discuțiile între diferite sisteme de organe în urma perturbării circadiane vizate nu sunt bine înțelese. Acest studiu se concentrează pe ștergerea proteinei de bază a ceasului BMAL1 din mușchiul scheletic și pe potențialele ramificații pe care această întrerupere a ceasului le are asupra rinichilor.

Modelul de șoarece BMAL1-inductibil-knockout (iMS-BMAL1 KO) specific mușchilor scheletici a fost descris anterior ca posedă caracteristici similare cu cele observate la îmbătrânire. Acești șoareci prezintă un mers modificat, mobilitate redusă, slăbiciune musculară și absorbție redusă de glucoză [6,7]. Boala de rinichi este sinonimă cu îmbătrânirea, deoarece prevalența bolilor renale crește odată cu vârsta [8]. O altă caracteristică raportată la șoarecii iMS-BMAL1 KO este că aceștia prezintă o calcificare crescută a tendonului [6]. Rolul rinichilor în echilibrul acido-bazic și homeostazia minerală leagă în mod direct sănătatea oaselor cu boala renală. În consecință, am emis ipoteza că șoarecii iMS-BMAL1 KO ar putea fi un model pentru boala renală.

Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă întreruperea ceasului în mușchiul scheletic duce la disfuncție renală. Deleția BMAL1 în mușchiul scheletic determină o creștere a markerilor inflamatorii la nivelul rinichilor. Cu toate acestea, nici funcția renală, nici histologia rinichilor nu par să fie afectate de iMS-BMAL1 KO. Aceste date sugerează că consecința întreruperii ceasului în mușchiul scheletic duce la modificări minime ale rinichilor în condițiile testate.

2. Materiale și Metode

animale. Modelul de șoarece utilizat în acest studiu a fost generat folosind șoareci BMAL1 exonul 8 floxed [9] încrucișați cu șoareci Cre-recombinaze specifici mușchilor scheletici (actina scheletică umană-Cre). Cre a fost activat prin injecții cu tamoxifen (fabricat în etanol 15% în ulei de semințe de floarea soarelui) cu 5 săptămâni înainte de studiu (2 mg/zi; 5 zile ip.) pentru a crea iMS BMAL1 KO. Au fost utilizați ca martori șoareci Cre+ injectați cu vehicul (etanol 15% în ulei de semințe de floarea soarelui). Soarecii tineri virgini masculi au fost studiați la 17-19 săptămâni, iar șoarecii în vârstă au fost studiați la 13-14 luni. Toate experimentele au fost efectuate de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals și aprobate și monitorizate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Florida și Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din North Florida/South Georgia Veterans Administration. Șoarecii au fost găzduiți în camere cu cicluri de lumină-întuneric, cu temperatură (20–26 ◦C) și umiditate controlată. Șoarecilor li s-a oferit acces ad libitum la apă și mâncare standard de 18% proteină pentru rozătoare (nr. 2918, Harlan Teklad/Envigo, Madison, WI, SUA), dacă nu s-a menționat altfel.

Studiul cuștii metabolice. O cohortă de șoareci masculi tineri (5 martor și 5 KS-BMAL1 KO) au fost menținute în cuști metabolice pentru a colecta urina și a monitoriza aportul de hrană/apă [10]. O dietă de gel pe bază de pudră (Envigo Teklad Custom Diet) care conține 1% agar a fost preparată și utilizată în toate colecțiile cuști metabolice. Șoarecilor li s-a dat 3 zile pentru a se aclimatiza la cuștile metabolice înainte de începerea colecțiilor cu o dietă de control ({{10}},25% NaCl; 0,6% K; Envigo 99131). După o zi de înregistrare cu o dietă de control, șoarecii au fost apoi tratați cu o dietă cu deficit de potasiu (0,25% NaCl; 0,0001% K; Envigo 99134) timp de cinci zile. Probele de urină au fost colectate la fiecare 12 ore la sfârșitul perioadelor de lumină și noapte (ora Zeitgeber 0 și 12). Au fost înregistrate producția de urină, aportul de alimente și aportul de apă. Concentrațiile de electroliți din urină au fost măsurate cu un fotometru cu flacără (Cole-Parmer Model 2655- 00, Vernon Hills, IL, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Șoarecii au fost eutanasiați și țesutul a fost colectat la ora Zeitgeber 6.

Compoziția corpului. Compoziția corporală a fost cuantificată la șoareci masculi tineri conștienți înainte și la cinci zile după administrarea unei diete sărace în potasiu. Măsurătorile au fost efectuate la ora Zeitgeber 4-6 utilizând un analizor de compoziție corporală cu rezonanță magnetică cantitativă EchoMRI (Echo Medical Systems, Houston, TX, SUA) [11].

Protocolul de avans de fază. O cohortă separată de șoareci masculi în vârstă au fost găzduiți individual în cuști echipate cu o roată de rulare cu acces ad libitum la mâncare (nr. 2918, Harlan Teklad) și apă. Cuștile au fost depozitate într-o cutie controlată de lumină cu schimb constant de aer (Actimetrics, Wilmette, IL, SUA). Programul de iluminare a fost menținut pe un ciclu lumină-întuneric de 12:12, folosind o sursă de lumină LED verde (~200 lux). După o săptămână de referință, ciclul de întuneric a fost avansat cu 7 ore, iar șoarecii au fost menținuți pe acest nou program de 12:12 ore de lumină-întuneric timp de o săptămână. Acest proces a fost repetat a doua oară pentru a produce un avans de fază de 14-h. Șoarecii au fost eutanasiați la momentul Zeitbeger 2 în grupuri de 2-3, iar țesutul a fost colectat la 7-10 zile după a doua săptămână de avans de fază.

Specificitatea recombinării. Pentru a confirma specificitatea recombinării Bmal1, am finalizat PCR folosind 40 ng de ADN genomic al mușchilor scheletici și primeri pentru alelele recombinate și nerecombinate. (primer fwd: ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG, primer rev: CTGACCAACTTGCTAACAATTA, primer de recombinare: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT). Primerii direct și invers pentru alela Bmal1 floxată produc un produs 431-bp. Al doilea primer primer 50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30 a fost inclus pentru a detecta produsul recombinat, care prezintă o bandă la 572 bp. Produșii de reacție PCR au fost rulați pe un gel de agaroză de 1,7%, iar identificarea unei benzi genomice și a unei benzi specifice recombinării a confirmat că toate animalele tratate cu tamoxifen au fost KO specifice țesutului așa cum s-a descris anterior [7,12].

Imunohistochimie. După anestezie cu izofluran inhalat, rinichii drepti au fost colectați și tăiați imediat transversal în jumătate, apoi depozitați în paraformaldehidă periodat-lizină -2% pentru aproximativ 48 de ore la 4 ◦ C. Fluidul a fost apoi schimbat în PBS pentru a se pregăti pentru procesare. Probele de rinichi de la fiecare animal au fost încorporate în parafină, iar secțiuni de 4-micrometru grosime au fost tăiate și montate pe lame de sticlă. Secțiunile au fost fie colorate cu hematoxilină și eozină, fie colorate cu un substrat cromogen de 3,30 -diaminobenzidină (Vector) pentru a viza BMAL1 (D2L7G Cell Signaling; 1:3000; RRID: AB_2728705, Danvers, MA, STATELE UNITE ALE AMERICII). Secțiunile au fost observate prin microscopie luminoasă (Nikon E600 echipat cu o cameră digitală Nikon DXM1200F, Melville, New York, NY, SUA). Identificatori de grupau fost îndepărtați de pe fiecare lamă și s-a examinat expresia BMAL1 sau s-au notat lamele pentru leziunea tubulară folosind următoarele criterii: procentul de tubuli care au prezentat semne de necroză tubulară, lipsa marginii periei, dilatarea tubulară și formarea de gips proteic.

incubat cu anticorp secundar anti-iepure conjugat cu hrean-peroxidază. După o spălare suplimentară cu TBS-T timp de 30 de minute, detectarea a fost efectuată folosind reactiv SignalFire ECL (Cell Signaling Technology) cu un timp de expunere de 30 s pentru imagistica. Densitometria a fost efectuată folosind Fiji, iar abundența de proteine ​​a fost normalizată la colorarea Ponceau.

Teste imunologice multiple. Regiunile corticale și medulare au fost disecate de la jumătate de rinichi la șoareci masculi în vârstă. Țesutul a fost omogenizat fie în 300 µL (cortex), fie în 250 µL (medular) de tampon (cocktail inhibitor de protează-fosfatază 1% (Thermo Scientific) 1% 1 M acid etilendiaminotetraacetic, 0,1% Tween 20 în fosfat- soluţie salină tamponată). Concentrația de proteine ​​pentru fiecare probă a fost determinată prin BCA (Pierce, Thermo Scientific). Omogenații au fost măsurați în duplicat pentru analiții selectați utilizând truse comerciale de imunotest multiplex (cat#'s MCYTOMAG-70K, MBNMAG-41K și MKI1MAG{-94K; EMD MilliporeSigma) pe un MILLIPLEX® Sistemul Analyzer 3.1 xPONENT (Luminex 200, Austin, TX, SUA) cu analiza datelor prin software-ul MILLIPLEX Analyst. CV-urile medii intratest au fost<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations. 

Izolarea mitocondriilor renale și respirometria. Țesutul cortical renal proaspăt a fost disecat de la șoareci după avansul de fază. Mitocondriile au fost izolate folosind kitul de izolare a mitocondriilor pentru țesut (#ab110169; Abcam, Waltham, MA, SUA) urmând instrucțiunile producătorului. Concentrația de proteine ​​a preparatului mitocondrial a fost determinată folosind un kit de testare a proteinelor BCA (Pierce, Thermo Scientific). Respirația mitocondrială a izolatului a fost determinată în duplicat într-o cameră xilografică calibrată anterior menținută la 37 ◦C (Oroboros O2K; Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) care conține tampon de respirație (MiR05; 0.5 mM EGTA, 3 mM MgCl2·6H2O, 60 mM acid lacto bionic, 2{0 mM taurină, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-zaharoză și 1 g/L BSA practic fără acizi grași, pH 7,1) [13]. Concentrația de oxigen a tamponului de respirație a fost menținută între saturația aerului (~200 µM) și 50 µM. Rata consumului de oxigen (OCR; ρmol O2/s/mg proteină mitocondrială) a fost măsurată folosind următorul protocol de titrare substrat-decuplare-inhibitor-titrare (SUIT) (concentrația de reactivi notate în paranteză este finală în camere): (1) SCURTĂ (L) ) respirația a fost evaluată după stimularea ciclului TCA cu substraturi legate de NADH piruvat (5 mM), malat (2 mM) și glutamat (10 mM) pentru a susține fluxul de electroni prin complexul I (CI) al sistemului de transport de electroni (ETS; E). ); (2) fosforilarea oxidativă (OXPHOS; P) a fost stimulată cu adenozin difosfat (ADP; 2,5 mM) și înregistrată ca PCI; (3) adăugarea de succinat (10 mM) a susținut fluxul de electroni convergenți prin complecșii I și II ale ETS (PCI+II); (4) calitatea preparatului mitocondrial a fost evaluată prin testarea integrității membranei exterioare mitocondriale prin adăugarea de citocrom c (10 pM); (5) decuplatorul carbonil cianura 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP; 0,5 µL-trepte dintr-o soluție stoc 0,1 mM) a fost titrat treptat până când a fost atinsă respirația decuplată maximă și a fost înregistrată ca capacitate maximă ETS (ECI+). II); (6) adăugarea de rotenonă (0,5 uM) a inhibat complexul I al ETS, iar OCR rămasă a fost înregistrată ca capacitate maximă ETS susținută de substratul complex II (ECII); (7) adăugarea de antimicină A (2,5 µM) a inhibat complexul III al ETS și, prin urmare, tot transportul de electroni la complexul IV, iar OCR rămasă a fost înregistrată ca consum de oxigen rezidual, non-mitocondrial (ROX) și scăzut din toate OCR-urile precedente ; (8) consumul de oxigen a fost apoi stimulat din nou cu adăugarea de diclorhidrat de N,N,N0,N0 -tetrametil-p-fenilendiamină (TMPD; 0,5 mM; în prezența ascorbatului (2 mM) pentru a evita autooxidarea necontrolată de TMPD) ca substrat artificial pentru reducerea citocromului c; (9) rata de oxidare chimică de fond în prezența TMPD/ascorbat a fost evaluată prin adăugarea complexului IV inhibitor azidă de sodiu (100 mM) și a fost scăzută din fluxul precedent, rezultând capacitatea maximă a activității citocromului c oxidazei (ECIV). Datele despre consumul de oxigen au fost obținute și analizate utilizând DatLab vs. 7.4 (Oroboros Instruments). Rapoartele de control al fluxului (FCR) au fost calculate ca consum de oxigen la orice stare respiratorie dată în raport cu capacitatea maximă ETS (ECI+II).

Citometrie în flux. Țesutul pulmonar a fost digerat și analiza citometrică în flux a fost efectuată așa cum a fost descris anterior [14].

Analize statistice. Datele grafice sunt prezentate ca medie ± SEM. ANOVA bidirecțională, cu măsuri repetate atunci când este posibil, a fost utilizată pentru a analiza diferențele dintre patru grupuri. Testul de comparații multiple de la Sidak a fost utilizat pentru a compara grupurile de șoareci cu grupurile de tratament. Testul t al lui Student a fost folosit pentru a compara cele două grupuri. Analiza a fost efectuată folosind software-ul GraphPad Prism versiunea 9.2 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA).

Semnificația statistică a fost definită ca p < 0.05.

Serviciul de sprijin al Wecistanche:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950