Proprietățile anti-melanogeneză și anti-tirozinază ale Pistacia atlantica subsp. mutica extracte pe celule de melanom murin B16F10

Contact: ali.ma@wecistanche.com

Samira Eghbali-Feriz1, Akram Taleghani2, Hadi Al-Najjar3, Seyed Ahmad Emami1, Homa Rahimi4, Javad Asili1, Samira Hasanzadeh1 și Zahra Tayarani-Najaran5,*

Abstract:Pistacia atlantica (P. atlantica) subsp. mutica a fost folosită în medicina tradițională și este renumită pentru proprietățile sale medicinale. Scopul acestui studiu a fost de a evalua efectul metanolului (MeOH), n-hexanului, diclormetanului (CH2Cl2), n-butanolului (BuOH), acetatului de etil (EtOAc), extractelor apoase și uleiului esențial de P. atlantica subsp. mutica asupra sintezei melaninei și stresului oxidativ în linia celulară de melanom B16F10. Viabilitatea celulelor B16F10 după tratamentul cu concentrații crescânde de diferite extracte de plantă (0,2-200 µg/mL) a fost măsurată utilizând resazurină. Compoziția uleiului esențial a fost identificată prin analiza gaz-cromatografie-spectrometrie de masă (GC-MS) și efectul inhibitor asupra sintezei melaninei, ciupercilortirozinazaactivitatea, tirozinaza celulară și stresul oxidativ au fost evaluate prin metode colorimetrice și fluorometrice. Datele au arătat extracte la concentrații 0.2-200 µg/mL, nu au arătat o toxicitate semnificativă asupra celulelor melanomului, dar concentrațiile de 200 µg/mL de ulei esențial au avut efect citotoxic. Pistacia atlantica subsp. mutica ar putea inhiba ciupercatirozinazaactivitate. De asemenea, cantitatea de melanină din celulele B16F10 a scăzut. În plus, capacitatea P. atlantica subsp. extractele de mutica în scăderea cantității de specii reactive de oxigen din celulele melanomului au evidențiat remarcabileantioxidantactivitate. În plus, toate concentrațiile de ulei esențial nu au avut niciun efect semnificativ în acest studiu. Themelanogenezainhibitor şiantioxidantefectele P. atlantica subsp. mutica pe celulele B16F10 poate sugera activitatea potențială de albire a plantei pentru utilizarea în produsele dermatologice de îngrijire a pielii și pentru prevenirea îmbătrânirii pielii în industria cosmetică.Cuvinte cheie:anti-tirozinaza; Melanogeneza; P. atlantica subsp. mutica.

Apasa pebeneficii cistanche pentru antioxidant

INTRODUCERE

Melanina este un pigment al pielii care este sintetizat în melanozomi și este transferat către keratinocite pe parcursul procesului fiziologic numitmelanogeneza. Melanina joacă un rol important în protecția împotriva daunelor UV și determină culoarea pielii, părului și ochilor. Producția în exces de melanină este atribuită melanomului și pigmentării anormale a pielii (1-3). Enzima cheie în biosinteza melaninei este tirozinaza care catalizează două reacții separate, oxidarea 3,4-dihidroxi-fenilalaninei (DOPA) la dopachinonă și hidroxilarea L-tirozinei la DOPA (4).Tirozinazasau polifenol oxidaza este o enzimă cu funcții mixte care conține cupru care se găsește în microorganisme, animale și plante (5). Tirozinaza este cel mai influent factor pentru rumenirea fructelor si legumelor. Supraproducția și acumularea de melanină pot duce la un număr mare de afecțiuni ale pielii, inclusiv melasma, pistrui, melanoză solară și pete de vârstă (6). Prin urmare,tirozinazainhibitorii au atras mult interes în industria alimentară și cosmetică. În multe organisme vii, oxidarea este esențială pentru producerea de energie care să alimenteze procesele biologice.

Cu toate acestea, peroxidul de hidrogen (H2O2) și alte specii reactive de oxigen (ROS) - provoacă moartea celulelor și deteriorarea țesuturilor în multe fenomene fiziologice și patologice, inclusiv creșterea ROS în urma iradierii UV în timpul procesului de melanogeneză. De asemenea, este bine cunoscut faptul că producția de ROS indusă de UV este implicată în patogeneza mai multor afecțiuni ale pielii, inclusiv îmbătrânirea, ridurile, fotosensibilitatea și malignitatea (7). Astfel, găsirea surselor naturale deantioxidanticu un anti-tirozinazaactivitatea ajută la modificarea leziunilor pielii legate de excesmelanogeneza (4).

Genul Pistacia este un membru al familiei Anacardiaceae care cuprinde aproximativ 9 specii și este distribuit în mare parte în regiunea mediteraneană, Europa și unele părți ale Asiei (8,9). Pistacia atlantica (P. atlantica)Desf. are 3 subspecii și anume: P. atlanticasubsp. kurdica (Zohary) Rech. f., P. atlanticasubsp. mutica (Fischer & CA Meyer) Rech. f. și P. atlantica subsp. cabulica (Stocuri) Rech. f. Cele trei subspecii menționate de P. atlantica, P. khinjuk Stocks și P. vera L. sunt cultivate în Iran (10). Fructele de P. atlanticasubsp. mutica anume Baneh este rotund spre oval cu 0.5-0.7 cm in diametru. Activitatea antioxidantă și anticanceroasă a carcasei P. atlantica a fost legată de conținutul ridicat de fenolic total al plantei. P. atlantica a fost folosit în mod tradițional pentru ameliorarea disconfortului și durerii abdominale superioare, dispepsie și ulcer peptic (11-13). Cu toate acestea, nu există studii privind activitatea inhibitoare a melanogenezei a P. atlantica subsp. mutica. Deci, în acest proiect, alegem celulele melanomului B16F10 pentru studiul proprietăților antioxidante și anti-melanogenice ale P. atlantica subsp. extracte de mutică. Scopul acestui studiu a fost de a investiga efectul inhibitor al extractelor de metanol (MeOH), n-hexan, diclormetan (CH2Cl2), n-butanol (BuOH), acetat de etil (EtOAc), apă (H2O) și ulei esențial de P. atlanticasubsp. mutica fruct pemelanogenezași pentru a evalua potențialulantioxidantcapacitatea plantei asupra celulelor melanomului B16F10.

MATERIALE ȘI METODE

Produse chimice

Ciupercătirozinazadin Agaricus bisporus, acid kojic, resazurină, L-3,4-dihidroxifenilalanină (L-DOPA), diacetat de diclorodihidro-fluoresceină (DCFH-DA), acid egtazic (EGTA), dimetil sulfoxid (DMSO) ), fluorură de fenilmetilsulfonil, glicerofosfat, -mercaptoetanol, soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), ortovanadat de sodiu, soluție salină tamponată tris tween 20 (TBST) achiziționată de la Sigma (SUA). Ser fetal bovin (FBS), penicilină, streptomicina și tripsină-EDTA au fost obținute de la GibcoBRL (Grand Island, SUA). Linia celulară de melanom (B16F10, Cat. No C540) a fost achiziționată de la Institutul Pasteur din Iran (Teheran, IR Iran). Toate celelalte substanțe chimice și solvenți au fost de la Merck (Germania).

Prepararea extractelor

P. atlantica subsp. mutica a fost recoltată în mai 2014 din Munții Bardaskan, provincia Khorasan Razavi, nord-estul Iranului și identificat de doamna M. Souzani. Un exemplar de voucher (Nr:13069) a fost depus în herbarul Școlii de Farmacie, Universitatea de Științe Medicale Mashhad, Mashhad, IR Iran. Fructe necoapte de P. atlantica subsp. mutica (200 g) au fost măcinate cu un blender (Toos chekan Co, IR Iran) și apoi percolate cu MeOH la temperatura camerei timp de 24 de ore conform protocolului raportat anterior (14). După extracție, solventul a fost evaporat folosind un evaporator rotativ și apoi liofilizat. Extractul metanolic (94 g) a fost fracţionat în continuare prin împărţirea solvent-solvent pentru a da cinci fracţii diferite incluzând MeOH, n-hexan, CH2CI2, BuOH, EtOAc şi H20.

Izolarea uleiului esențial

Fructul necoapt de P. atlantica subsp.mutica (150 g) a fost supus hidrodistilării folosind un aparat de tip Clevenger timp de 3 ore. Uleiul incolor a fost obţinut cu un randament de 0,8 procente (v/w). Uleiul esențial obținut a fost uscat pe sulfat de sodiu anhidru și păstrat la 4 grade în întuneric până la testarea ulterioară.

Gaz-cromatografie și gaz-cromatografie-spectrometrie de masă

Analiza cromatografiei gazoase (GC) a fost efectuată utilizând un Varian CP{{0}} echipat cu un detector FID, interfațat cu o coloană de silice topită (CP-Sil 8CB, 5{0 m × 0,25 mm, grosimea peliculei 0,12 µm) în următoarea condiție: temperatura cuptorului 50-250 grade cu o rată de 3 grade /min; temperatura injectorului 260 grade, raport de scindare 1:5, cu gaz purtător, debit N2 2 mL/min; temperatura detectorului 280 de grade.

Analizele gaz-cromatografie-masă (GC-MS) au fost efectuate folosind un aparat Agilent 5975 echipat cu o coloană HP-5 MS (30 m × 0,25 mm id, {{ 14}}.25 µm grosimi de peliculă) interfațat cu un detector de masă cvadruplu și un computer echipat cu biblioteca Wiley 7n.L. Temperatura cuptorului 50-250 grade cu o rată de 3 grade / min, temperatura injectorului 250 de grade, volumul de injecție: 0,1 µL, injecție divizată cu raport de împărțire de 1:50, cu debitul gazului purtător (heliu) 1 ml/ min, sursă de ioni: 70 eV, curent de ionizare: 150 µA și interval de scanare: 35-465. Identificarea componentelor uleiului esențial s-a bazat pe cromatografia gazoasă de retenție obținută cu referire la seria n-alcanilor (C6-C20) pe coloana HP{-5MS, compararea spectrelor de masă și a modelelor de fragmentare raportate. în literatură și potrivirea computerului cu biblioteca Wiley 7n.L (15). Cuantificarea cantității relative a componentelor individuale ale fructelor necoapte a fost efectuată conform metodei procentului de suprafață fără a lua în considerare factorul de calibrare.

Cultură de celule

Linia celulară de melanom, B16F10, menținută la 37 de grade într-o atmosferă umidificată (90 la sută) care conține 5 la sută CO2. Celulele au fost cultivate în RPMI-1640 (Bioidea, Iran) cu 10% (v/v) FBS, 100 UI/mL penicilină și 100 pg/mL streptomicină. Soluția stoc de P. atlantica subsp. mutica a fost preparat la 50 µg/mL în DMSO și păstrat la gradul -40 . Acidul Kojic (2 și 4 mM) a fost utilizat ca martor pozitiv în toate experimentele. Celulele au fost cultivate în 96-plăci de godeuri cu o densitate de 105 celule/mL. Activitatea extractului în fiecare experiment a fost calculată folosind următoarea ecuație:

 procent din activitate=Absorbanța probei/Absorbanța controlului*100

Test de viabilitate celulară

Resazurin este un indicator al sănătății celulare care utilizează puterea de reducere a celulelor vii și se transformă în resorufină. Resazurin este un compus albastru, netoxic, nefluorescent și permeabil la celule, care se transformă în culoare roșie și rezorufină puternic fluorescentă în celulele vii (16). Aproximativ 104 celule de melanom B16F10 au fost însămânțate în fiecare godeu al plăcii de 96-microgodeuri și tratate cu diferite concentrații de extracte și ulei esențial de P. atlantica subsp. mutică (0.2-200 µg/mL). După 4 ore de incubare, absorbanța resazurinei și a rezorufinei a fost măsurată la 570 nm și 600 nm utilizând un cititor de microplăci H4 Hybrid Multi-Mode (BioTek, Winooski, SUA). Fiecare experiment a fost făcut în trei exemplare. Concentrația inhibitorie jumătate maximă (IC50) a fost calculată utilizând software-ul GraphPad din curba concentrație-efect: log concentrație vs răspuns.

Analiza activității tirozinazei la ciuperci

Activitatea ciuperciitirozinazaîn oxidarea L-DOPA a fost măsurată spectrofotometric așa cum s-a descris anterior (17), cu unele modificări. Pe scurt, 160 ui de 5 mM L-DOPA (în tampon fosfat de sodiu 100 mM pH 6,8) și 20 ui din același tampon cu și fără P. atlanticasubsp. extractele de mutica și uleiul esențial (10-1000 µg/mL) au fost amestecate cu 20 µL de tirozinază de ciuperci (200 unități/mL) și apoi incubate la 37 de grade timp de 30 de minute. Absorbanța a fost măsurată la 475 nm cu cititorul de microplăci Synergy H4 Hybrid Multi-Mode (BioTek, Winooski, SUA).

Determinarea conținutului de melanină în celulele melanomului

Celulele de melanom, B16F10, au fost însămânțate la o densitate de 105 celule per godeu în plăci de cultură 96-godeuri și incubate timp de 24 de ore. Au fost apoi incubate cu diferite concentrații (0,2-200 µg/mL) de P. atlantica subsp. extracte de mutica și ulei esențial timp de 24 de ore. Conținutul de melanină a fost măsurat așa cum s-a descris anterior (18). După tratament, celulele au fost colectate folosind tripsină. S-au spalat cu PBS. Peletele celulare au fost solubilizate în 50 uL soluție de hidroxid de sodiu (2 M) timp de 60 de minute la 60 de grade. Conținutul de melanină a fost măsurat prin măsurarea absorbanței la 405 nm cu cititorul de microplăci Synergy H4 Hybrid Multi-Mode (BioTek, Winooski, SUA).

Testul activității tirozinazei celulare

Oxidarea DOPA la DOPA crom a fost analizată prin spectrofotometrie ca indicator altirozinazaactivitate (18). 106 celule de melanom B16F10 au fost placate în fiecare godeu al plăcii cu 96-godeuri peste noapte. După tratarea celulei cu diferite concentrații (0,2-200 µg/mL) de P. atlantica subsp. extracte de mutica și ulei esențial timp de 24 de ore. Celulele au fost detașate folosind tripsină; spălat cu PBS și lizat cu 50 uL tampon fosfat de sodiu (pH 6,8, 100 mM) care conține 1% triton X-100 și 0,1 mM fluorură de fenilmetilsulfonil. Lizatele au fost centrifugate la 10,000 rpm timp de 20 de minute la 4 grade. 100 µL din fiecare lizat (fiecare conținând 100 mg proteină) s-au amestecat cu 30 µL de 5 mM DOPA într-o placă cu 96 de godeuri și s-au incubat la 37 de grade timp de 2 ore, absorbanța a fost măsurată la 475 nm cu cititorul de microplăci Synergy H4 Hybrid Multi-Mode (BioTek, Winooski, SUA).

Determinarea nivelului speciilor reactive de oxigen celular

Nivelul speciilor reactive de oxigen a fost măsurat așa cum a fost descris anterior, cu modificări minore (19). Celulele melanomului, B16F10, (2 × 104) au fost însămânțate în 96-plăci de godeuri peste noapte și apoi au fost tratate cu diferite concentrații (0,2-200 µg/mL) de P. atlantica subsp . extracte de mutica și ulei esențial timp de 24 de ore. Apoi celulele au fost incubate cu 50 uL H2O2 (24 mM) la 37 de grade timp de 30 min. Apoi s-au adăugat la celule 50 uL de DCFH-DA și intensitatea fluorescenței DCF a fost măsurată la emisie de 504 nm și excitare de 524 nm folosind un cititor de microplăci Synergy H4 (BioTek, SUA).

Analiza Western blot

Celulele de melanom, B16F10, au fost cultivate în baloane de 75 cm3 cu și fără extract de metanol (0.{5-100 µg/mL) timp de 24 de ore. Celulele au fost apoi lizate într-un tampon (50 mM tris-HCI, pH 7,4, 2 mM EGTA, 1 mM fluorură de fenilmetilsulfonil, 10 mM glicerofosfat, 10 mM - mercaptoetanol, 1 mM ortovandat de sodiu, acid deoxicolic 1 mM. sare de sodiu). O cantitate egală de proteine ​​(50 pg) au fost încărcate pe electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu (SDS)-poliacrilamidă 12 procente și transferate pe membrane de difluorură de poliviniliden. Membranele au fost blocate timp de 2 ore în 10% lapte degresat în tampon TBST (20 mM tris-HCI pH 7,4, 100 mM NaCI și 0,1% tween 20) la temperatura camerei. După spălarea cu tampon TBST, membrana a fost apoi incubată peste noapte cu un anticorp primar: 1:300 (anti-iepure anti-tirozinazaanticorpi (Santa Cruz Biotechnology, CA)). După clătire de 3 ori cu tampon TBST, membranele au fost apoi incubate timp de 2 ore cu IgG anti-iepure (1:2000) ca anticorp secundar (semnalizare celulară). Clătirea de 3 ori cu tampon TBST a fost repetată și benzile de proteine ​​au fost detectate utilizând sistemul de detectare prin western blot prin chemiluminiscent îmbunătățit (ECL) (BioRaD, SUA) (20). Anticorpul anti- -actină a fost utilizat ca control al încărcării.

analize statistice

Rezultatele relative ale experimentelor au fost prezentate ca medie ± SD a celor trei măsurători independente. Analiza varianței și calculul IC50 au fost efectuate cu GraphPad Prism 6.0 folosind un test ANOVA unidirecțional și mediile au fost comparate prin testele Dunnett. P < 0,05="" reprezintă="" o="" diferență="" semnificativă="" statistic="" între="" celulele="" tratate="" cu="" extract="" și="" martor.="" un="" test="" anova="" în="" două="" sensuri="" și="" un="" post-test="" de="" comparare="" bonferroni="" au="" fost="" utilizate="" pentru="" a="" compara="" efectul="" diferitelor="" extracte="" în="" fiecare="">

REZULTATE

Compoziția uleiurilor esențiale

Gaz-cromatografia a fost utilizată pentru cuantificare și Gc-Mass pentru identificarea compușilor. Rezultatele analizei GC și GC-MS sunt prezentate în tabelul de identificare cantitativă și calitativă a compușilor. În cazul P. atlanticasubsp. mutica, 68 de constituenți au fost identificați în uleiul esențial și au reprezentat 99,8 la sută din compoziția totală a uleiului (Tabelul 1). Compușii grupați ai uleiului esențial au fost determinați ca hidrocarburi monoterpenice 86,5%, monoterpene oxigenate 3,7%, hidrocarburi sesquiterpenice 8,7%, sesquiterpene oxigenate 0,1% și diversele 0 .8 la sută . Componentele majore ale uleiului esențial au fost -E-ocimenă 29,7 la sută, mircenă 17,1 la sută, -Z-ocimene 17,0 la sută, -pinenă 10,2 la sută și E-cariofilenă 7,1 la sută.

Efectul extractelor asupra supraviețuirii celulare

Viabilitatea celulelor a fost monitorizată cu resazurină. Celulele de melanom, B16F10, au fost însămânțate într-o placă de 96-godeuri. După 24 de ore, celulele au fost tratate cu diferite concentrații (0.{2-200 µg/mL) de P. atlantica subsp. mutica, rezultatele au arătat că extractele nu au avut un efect citotoxic semnificativ asupra celulelor B16F10 la concentrațiile utilizate în acest studiu (Fig. 1). Doxorubicina ca martor pozitiv a indus semnificativ moartea celulară (P <>

Efectul extractelor asupra activității tirozinazei de ciuperci

A fost evaluat efectul P. atlantica asupra inhibării tirozinazei ciupercilor în oxidarea L-DOPA. Rezultatele au indicat că ciupercatirozinazaactivitatea a fost inhibată de toate extractele diferite, dar concentrația de 1000 µg/mL de extract de n-hexan nu a avut un efect semnificativ în acest test. Acidul Kojic (2 și 4 mM) a fost utilizat ca martor pozitiv (P < 0,05)="" (fig.="">

Efectul extractelor și uleiurilor esențiale asupra sintezei melaninei

Pentru a studia efectul diferitelor extracte și ulei esențial de P. atlantica subsp. mutica la sinteza melaninei, a fost evaluat conținutul de melanină al celulelor de melanom B16F10 tratate cu extract. Acidul Kojic (2 și 4 mM) a fost utilizat ca martor pozitiv.

Rezultatele au arătat că extractele de MeOH, CH2Cl2 și EtOAc (0.{2-200 µg/mL), n-hexan ({2-200 µg/mL) și extract de H2O (2{{9} }} și 200 µg/mL) au avut efect inhibitor asupra sintezei melaninei (P < 0,05)="" (fig.="" 3).="" cu="" toate="" acestea,="" toate="" concentrațiile="" de="" ulei="" esențial="" și="" extract="" de="" buoh="" nu="" au="" avut="" un="" efect="" inhibitor="" semnificativ="" asupra="" sintezei="" melaninei.="" rezultatele="" uleiului="" esențial="" nu="" sunt="" prezentate="" în="">

Efectul extractelor asupra activității tirozinazei celulare

Pentru a evalua mecanismul efectului inhibitor al P. atlantica subsp. extract de mutica pemelanogenezaîn special, am evaluat intracelulartirozinazaactivitate în celulele melanomului B16F10. Rezultatele au indicat că extractele de MeOH, EtOAc și BuOH (0.{2-200 µg/mL), n-hexan (0,2 µg/mL) și CH2Cl2 (20 și 200 µg/mL) extracte de P. atlantica subsp. mutica ar putea inhiba semnificativ activitatea tirozinazei celulare (P < 0,05)="" (fig.="" 4),="" dar="" extractul="" de="" apă="" nu="" a="" avut="" efect="" inhibitor="" asupra="" activității="" tirozinazei="">

Efectul extractelor asupra nivelului speciilor reactive de oxigen celular

Nivelul ROS intracelular ca indicativ alantioxidantcapacitatea P. atlantica subsp.mutica a fost măsurată în celulele tratate cu 24 mM H2O2 singur sau cu diferite extracte în celulele melanomului B16F10. Rezultatele au indicat că toate extractele concentrațiilor de P. atlanticasubsp. mutica, cu excepția extractului de 0.2 µg/mL de CH2Cl2, ar putea suprima semnificativ stresul oxidativ indus de H2O2 (P < 0,05)="" (fig.="">

Efectul extractelor asupra nivelului proteinei tirozinazei celulare

Efectul intracelular al P. atlanticasubsp. mutica asupra proteinelor înrudite melanogene precum tirozinaza ca indicator almelanogenezaa fost evaluată prin western blot. După cum se arată în Fig. 6,tirozinazanivelurile de proteine ​​au fost semnificativ scăzute de P. atlantica subsp. tratament cu extract de mutica la concentrația de {{0}},5 și 10 µg/mL (P < 0,05).="" -actina="" a="" fost="" folosită="" ca="" control="">

Efectele uleiului esențial asupra diferiților parametri

Uleiul esențial la 0.2-200 µg/mL nu a evidențiat niciun efect semnificativ asupra tuturor parametrilor menționați mai sus, cu excepția concentrației de 200 µg/mL, care a prezentat efect citotoxic asupra celulelor melanomului. Prin urmare, rezultatele uleiului esențial nu sunt incluse în secțiunea de rezultate, deoarece nu au fost observate efecte inhibitoare.

DISCUŢIE

Produsele cosmetice pe bază de natură sunt promovate pe scară largă de către agențiile comerciale pentru siguranța și activitatea lor multifuncțională. Găsirea de noi agenți anti-melanogeni cuantioxidantactivitatea din surse naturale este unul dintre interesele în formularea produselor utilizate pentru tulburările de hiperpigmentare. În produsele medicinale și cosmetice utilizate ca agenți de albire a pielii, inhibarea formării melaninei, eliminarea radicalilor liberi și inhibareatirozinazaactivitate care este importantă pentru tratarea afecțiunilor cutanate asociate (21).

În acest studiu activitatea antioxidantă a diferitelor extracte de P. atlantica subsp. mutica a fost evaluată și au fost analizate efectele acestora asupra activității tirozinazei și sintezei melaninei. Extractele MeOH și EtOAc ale P. atlantica subsp. mutica a aratat semnificativaantioxidantactivitate la 2, 20 µg/mL și 20, 200 µg/mL care poate fi atribuită polifenolilor și flavonoidelor întâlnite pe scară largă în plantă. Rezultatele au arătat că toate extractele, în special extractele de MeOH, EtOAc și H2O, ar putea inhiba semnificativ ciuperca.tirozinazaactivitate. De asemenea, extractele de MeOH, EtOAc și BuOH au fost capabile să scadă activitatea celulară a tiroizului, ceea ce a fost în conformitate cu reducerea producției de melanină în celule. În acest studiu, toate concentrațiile de ulei esențial nu au avut un efect inhibitor semnificativ împotriva tiroiziunii celulare, sintezei melaninei șiantioxidantactivitate. Datorită activității mai mari a extractului de MeOH în diferite experimente în comparație cu alte extracte, am ales extractul menționat pentru analiza Western blot. În concluzie, efectul anti-melanogenic al acestui extract a fost confirmat în toate testele în celulele B16F10, fiind comparabil cu acidul kojic martor pozitiv (Tabelul 2).

Extractele MeOH, CH2Cl2 și EtOAc au scăzut celulartirozinazaactivitatea, conținutul de melanină și ROS. Fracțiile de natură semipolară pot extrage substanțe fitochimice care sunt responsabile pentru activitatea antimelanogenă, cum ar fi polifenolii și flavonoidele. Fracția n-hexan și uleiul esențial au fost mai puțin active, ceea ce indică faptul că fitochimicele plantelor cu natură nepolară și volatilă nu au un efect semnificativ asupramelanogenezaproces (22,23).

Polifenolii și flavonoizii acționează ca inhibitori ai producției de ROS și ar putea fi responsabili pentru proprietățile anti-melanogenice ale extractelor de plante (24-27). Compușii majori din extractul de P. atlantica subsp. mutica sunt quercetina, luteolina, izoquercetina, rutina, luteolina 7-lactat și compuși fenolici cum ar fi acidul p-cumaric, acidul cafeic și acidul galic care sunt responsabili pentruantioxidantactivitate (28). S-a raportat că rutina inhibă activitatea tirozinazei și este un agent anti-pigment puternic datorită prezenței grupărilor hidroxil (29). Interesant, quercetina, luteolina și izoquercetina au, de asemenea, multe grupări hidroxil în structura lor, făcându-le potrivite pentru interacțiunea cu tirozinaza, rezultând activitatea anti-tirozinază (21,30). Recent s-a demonstrat că efectele flavonoidelor precum luteolina și quercetina sunt mediate în principal prin modularea factorului transcripțional almelanogeneza-factorul de transcripție asociat (MITF) și/sau enzimele de melanogenezătirozinaza, DCT sau proteina 1 înrudită cu tirozinaza (TYRP-1) (31). Acidul P-cumaric și acidul cafeic au inhibat activitatea tirozinazei ciupercilor și au fost de 10- și de 3-ori mai puternice decât acidul kojic (32).

Acidul galic prezintă activitate inhibitoare a tirozinazei și reduce dopachinona înapoi la L-DOPA prin ciclul redox, similar acidului ascorbic (33). În mod similar, în studiul de față P. atlantica subsp. mutica a scăzut nivelul proteinei tirozinazei în celule, ceea ce este strâns corelat cu prezența quercetinei, luteolinei, izoquercetinei, rutinei și a altor polifenoli în plantă.

Există multe rapoarte despre plante care au o activitate anti-melanogenă și antioxidantă care scade stresul oxidativ, care poate avea un potențial ridicat pentru tratarea afecțiunilor pielii. De exemplu, diferitele extracte din părți aeriene de P. atlantica au redus stresul oxidativ, care poate fi atribuit polifenolilor, flavonoidelor și antocianinei găsite pe scară largă în plantă (34). Într-un alt studiu, extractul MeOH din P. vera a scăzut secreția de melanină, care a fost atribuită unoraantioxidantcompușii din această plantă. Acest studiu a indicat că acidul kojic, ca martor pozitiv, a arătat o valoare IC50 de 0,05 mg/mL și concentrații mai mari de P. vera pot fi utilizate ca agent eficient pentru tratamentul afecțiunilor pielii, cum ar fi cancerul melanom (35). ). Gourine și colab. a arătat că părțile aeriene ale P. atlantica au proprietăți antioxidante puternice (36). De asemenea, fracțiile MeOH și CH2Cl2 ale Nepeta satureioides au indicat efecte potențiale împotriva producției de melanină în celulele melanomului B16F10 și pot contribui la formulările cosmetice ale produselor de îngrijire a pielii (37). Derivații acidului kojic au avut activitate inhibitoare asupratirozinaza. Se pare că prezența grupării hidroxil libere și a substitutului metil în acest compus a confirmat activitatea inhibitoare. În acest studiu, acidul kojic (martor pozitiv) a indicat o valoare IC50de 0,28 mM (38). Glicozidele fenilpropanoide și flavonoidele izolate din Teucrium polium L. var. gnaphalodes au prezentat activități antioxidante și inhibitorii tirozinazei. Autorii au arătat că jaranolul a arătat cea mai mare activitate inhibitoare a tirozinazei (IC50 0.041 mM), iar poliumozida a fost cel mai bun antioxidant dintre compușii testați. Acidul kojic a prezentat o valoare IC50 de 0,02 mM (39).

Scăderea nivelului proteic altirozinazade P. atlantica subsp. mutica siantioxidantproprietățile și ROS reduse au confirmat utilizarea acestui agent ca agent anti-melanogeneză. Acest studiu a determinat pentru prima dată efectul inhibitor al P. atlanticasubsp. mutica onmelanogenezaîn celulele melanomului B16F10. Pentru a preveni acumularea și supraproducția de melanină în piele, inhibareatirozinazaare un rol important. Prin urmare, în ceea ce privește efectul antioxidant raportat al P. atlantica subsp.mutica, compușii flavonoizi și fenolici sunt componente importante ale plantei responsabile de activitățile anti-melanogeneză și antitirozinazei ale P. atlantica subsp. mutica. Atât activitatea antioxidantă, cât și cea anti-melanogenă a P. atlantica subsp. mutica poate oferi un agent adecvat pentru formulările de albire a pielii și ar putea fi inclus în produsele cosmetice pentru formulările de îngrijire a pielii.

CONCLUZIE

În concluzie, acest studiu a arătat pentru prima dată că extractele MeOH și EtOAc din P. atlantica subsp. mutica are taretirozinazaactivitate inhibitoare care este în concordanță cu reducerea melaninei. Mai mult, P. atlanticasubsp. mutica a demonstrat, de asemenea, activitate de captare mare șiantioxidantproprietăți, care ar putea fi atribuite în principal nivelurilor sale ridicate de flavonoide și polifenoli totali. Rezultatele au sugerat că capacitatea P. atlanticasubsp. mutica pentru a reduce producția de melanină se poate corela cu epuizarea ROS celular și cu acțiunea sa inhibitoare asupra căii de semnalizare care regleazătirozinazaactivitate. Deoarece extractul semipolar a avut semnificativ anti-tirozinaza și anti-melanogenicefecte, prin urmare, concluzionăm că compușii responsabili pentru aceste efecte sunt acumulați în extract, nu în uleiurile esențiale.