Efectele benefice ale fracției totale de glicozidă feniletanoid izolată din Cistanche Deserticola asupra microstructurii osoase la șobolanii ovariectomizați

Lingling Yang, Shuqin Ding, Bo Zhang, Jingjing Liu, Yanhong Dong, Qiwen Tang, Pingping Yang și Xueqin Ma

1 Departamentul de Analiză Farmaceutică, Școala de Farmacie, Universitatea Medicală Ningxia, strada Shenli 1160, Yinchuan 750004, China

2 Școala de Medicină Clinică, Universitatea Medicală Ningxia, strada Shenli 692, Yinchuan 750004, China

3 Laboratorul cheie al modernizării medicinei etnice Hui, Ministerul Educației, Universitatea Medicală Ningxia, strada Shenli 1160, Yinchuan 750004, China

Acesta este un articol cu ​​acces liber distribuit sub Licența de Atribuire Creative Commons, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea fără restricții pe orice mediu, cu condiția ca lucrarea originală să fie citată în mod corespunzător.

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstract

Prezentul studiu a fost conceput pentru a estima activitatea antiosteoporotică a fracției totale de glicozide feniletanoid izolate dinCistanchedeserticola(CDP) pe șobolani induse de ovariectomie (OVX), precum și mecanismele aferente. După 3 luni de administrare orală, scăderea densității minerale osoase, Ca seric și P la șobolanii OVX au fost recuperate și microarhitectura osului trabecular deteriorat a fost parțial îmbunătățită prin intervenția Cistanche deserticola (60, 120 și 240 mg/kg), activitățile. markerii de resorbție osoasă au fost reglați în jos, iar bioactivul indicelui de formare osoasă a fost reglat în sus; între timp, conținutul de MDA a fost scăzut, iar GSH a fost crescut prin tratamentul CDP. Din punct de vedere compozițional, au fost identificați 8 compuși glicozidici feniletanoid înCistanchedeserticola(CDP), cu conținutul total cuantificat ca 50,3 procente prin utilizarea metodei HPLC. Mecanic,Cistanchedeserticola(CDP) a scăzut nivelurile de TRAF6, RANKL și RANK, suprimând astfel activarea indusă de RANKL/RANK/TRAF6-a căilor de semnalizare NF-κB și PI3K/AKT din aval și, în cele din urmă, prevenind activitățile proteinelor cheie osteoclastogene ale NFAT2 și c -Fos. Toate datele de mai sus au implicat că CDP a prezentat efecte benefice asupra microstructurii osoase la șobolanii ovariectomizați, iar aceste efecte pot fi legate de căile de semnalizare NF-kB și PI3K/AKT care au fost declanșate de legarea RANKL, RANK și TRAF6.

Cistanche tubulosaare multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

1. Introducere

Osteoporoza postmenopauză, în care 1 din 3 femei cu vârsta peste 50 de ani va suferi, devine principalul pericol pentru sănătate care afectează peste 200 de milioane de femei din întreaga lume [1]. La menopauză, scăderea bruscă a nivelului de estrogen duce de obicei la o resorbție osoasă depășită cauzată de osteoclastogeneza intensificată; apoi, echilibrul dintre formarea osoasă indusă de osteoblaste și resorbția osoasă indusă de osteoclaste a fost perturbat, iar resorbția osoasă accelerată a provocat în cele din urmă osteoporoză și chiar fractură de șold sau coloană [2]. S-a crezut că diferențierea osteoclastei a fost declanșată atunci când activatorul receptorului factorului nuclear kappa B (RANK) s-a legat de RANKL, ligandul lui RANK. Cu toate acestea, combinația dintre RANK și RANKL nu poate fi activată decât dacă s-a alăturat factorului 6 asociat receptorului factorului de necroză tumorală proteică (TRAF6) [3], urmat de stimularea căilor de semnalizare din aval, inclusiv PI3K/AKT și NF-kB. Și în cele din urmă, expresiile factorului nuclear al celulelor T activate c2 (NFAT2) și c-Fos au fost reglate [4] pentru a modula diferențierea osteoclastelor, precum și resorbția osoasă. Astfel, factorii și regulatorii care au legătură directă sau indirectă cu activarea și diferențierea osteoclastelor au fost considerați ținte cruciale pentru prevenirea pierderii osoase.

Există într-adevăr unele medicamente de terapie de substituție hormonală clinică și sintetică, cum ar fi valeratul de estradiol, care sunt eficiente în tratamentul osteoporozei postmenopauză. Din păcate, unele dintre acestea au sporit riscul de cancere grave, inclusiv cancerul de sân și de endometru [5], ceea ce le-a limitat aplicațiile clinice. Prin urmare, este necesar să se selecteze alte alternative atât cu eficacitate, cât și cu efecte secundare minime. Medicamentele tradiționale chinezești (MTC), precum și compușii și fracțiunile bioactive izolate [6–9], s-au dovedit eficiente în diferite afecțiuni, inclusiv osteoporoza postmenopauză. Printre aceste componente și fracții bioactive, compușii feniletanoid glicozid (PhG) cu potențială eficacitate au fost considerați agenți promițători pentru tratamentul osteoporozei [10-12]. Structurile PhG constau din acid cinamic aglicon, o grupare hidroxil fenil etil care este combinată cu -glucopiranoză, apioză, galactoză, ramnoză sau xiloză printr-o legătură glicozidică. Ele există pe scară largă în speciile medicinale ale genuluiCistanche[13]. CistanchedeserticolaYC Ma este un MTC oficial care este înregistrat în farmacopeea chineză și, pe lângă faptul că este un MTC important [14], C deserticola este, de asemenea, o plantă tonică anti-îmbătrânire cu puține efecte secundare, care a fost dezvoltată în lichior medicinal și lichid nutrițional aprobat de State Food. și Administrația Medicamentelor. Pe baza farmacopeei chineze, C. deserticola a fost folosită în mod tradițional de către nativi pentru a trata problemele cu deficiența de esență a rinichilor, cum ar fi deficiența musculară și slăbiciunea lombară, iar compușii glicozidici feniletanoizi, inclusiv echinacozidul și actozidul, sunt principalii constituenți bioactivi ai acestei plante. Conform teoriei TCM a „rinichiului-guvernează-os”, sistemul osos este guvernat de esența rinichilor [15], iar problemele legate de oase, cum ar fi osteoporoza, ar putea fi recuperate prin ierburi sau compuși care posedă activitatea de hrănire a esenței rinichilor. Prin urmare, am emis ipoteza că fracția totală de glicozidă feniletanoid izolată din C. deserticola, cel puțin parțial, a fost benefică în tratamentul osteoporozei. Prin urmare, experimentul actual a fost conceput pentru a valida ipoteza noastră utilizând un model de șobolan ovariectomizat (OVX); pe lângă markerii de resorbție și formare osoasă care trebuie estimați, indicele de antioxidare, precum și căile de semnalizare PI3K/AKT și NF-κB induse de RANKL/RANK/TRAF6- au fost, de asemenea, folosite pentru a investiga mecanismele principale ale bioactivității antiosteoporotice. .

2. Materiale și Metodă

2.1. Materiale vegetale și pregătire.

Un total de 30 kg tulpini deCistanchedeserticolaY.C. Ma au fost colectate din comitatul Yongning în septembrie 2015 cu coordonatele 106.026597 și 38.262816, provincia Ningxia, China. Planta a fost identificată de Dr. Lin Dong (Departamentul de Farmacognozie, Universitatea Medicală Ningxia) și un specimen corespunzător (#201509{{40}}1) a fost păstrat în Departamentul de Analiză Farmaceutică. În primul rând, 30,0 kg de pulbere de C. deserticola au fost extrase utilizând metoda de reflux cu 70% etanol ca solvent; raportul dintre material și solvent a fost stabilit la 1:10 și timpul de reflux a fost de 2 h de 3 ori. Apoi, toate filtratele au fost combinate și condensate la presiune redusă la 60 de grade C. În al doilea rând, pentru separarea preliminară au fost utilizate coloane de rășină macroporoasă AB-8 și diferite rapoarte de etanol în apă (0 la sută, 20 la sută, Pentru eluare s-au folosit 30%, 40%, 50% și 60%, fiecare 60 L). În al treilea rând, cei 40% și 50% eluanți au fost combinați și purificați în continuare prin utilizarea unor coloane repetate de rășină macroporoasă AB-8 cu eluenți de 0%, 20%, 30%, 40% și 50% etanol în apă și fiecare eluent a fost de 12 L. În cele din urmă, fracția de 40 la sută a fost colectată și condensată la presiune redusă pentru a obține 150 g fracție de glicozidă feniletanoidică a sedimentului galben pal de C. deserticola (CDP, randamentul a fost de 0,5 la sută). Pentru experimentele in vivo, 0,5% solvent CMC-Na a fost folosit pentru a dizolva CDP; administrarea orală la animale a fost stabilită ca 1 ml/100 g greutate corporală; pentru analiza Western blot in vitro, CDP a fost dizolvat cu DMSO și apoi diluat cu DMEM pentru a obține concentrațiile finale de 0,1 mg/mL, 0,01 mg/ml și 0,001 mg/mL.

2.2. Produse chimice și solvenți.

Valeratul de estradiol (EV) a fost de la Delpharm Lille SAS, Franța; kituri ELISA de reticulare fosfatază alcalină (ALP), gla-proteină osoasă (BGP), fosfatază acidă rezistentă la tartrat (TRAP) și deoxipiridinolină (DPD) de la Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, China, 201605; truse de reactivi malondialdehidă (MDA, 20181221), super oxid dismutază (SOD, 20121218) și glutation (GSH, 20181221) de la Institutul de Inginerie Biologică Nanjing Jiancheng, Nanjing, China; Kituri ELISA de reticulare pentru parathormonul intact (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonina (2L9ISN7AIU) și receptorul alfa legat de estrogen (ERR, Y3AY8QEWB3) de la Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, China; Kit de reactivi ELISA catepsină K de la BioVision, America, 1l300141; anticorpi primari ai RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-kB p65 (AH04138226), PI3 alfa kinaza (AC260226), PI3 alfa (AC260226) , AKT 1 (AF05173234), -actină (17AV0411) şi anticorpi secundari ai IgG de capră anti iepure conjugată cu peroxidază de hrean de la ZSGB-BIO, China, 136080; trusa de analiză a proteinei BCA totală și trusa comercială pentru detectarea formării de oste oclaste și ser fetal bovin și mediu de Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) de la HyClone, Logan, UT, SUA; membrană de flfluorura de poliviniliden (PVDF) de la Millipore Life Sciences, Billerica, MA, SUA; penicilină și streptomicina de la Gibco, Rockville, MD, SUA. Toți ceilalți agenți chimici utilizați au fost de calitate AR.

2.3. Cuantificare HPLC a Cistanche Deserticola P.

Un instrument HPLC Agilent 1220 a fost folosit pentru a identifica și cuantifica compoziția CDP. Condițiile de cromatografie au fost următoarele: coloană C18 (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); eluția cu gradient a conținut solvenți A (acetonitril) și B (apă care conține 0,5 la sută acid acetic) (0-10 min: 17-20 la sută A; 10-30 min: 20-25 la sută A și 30-40 min: 25-30 la sută A); lungimea de undă de detecție a fost de 333 nm; temperatura ambientala; viteza de curgere a fost de 1,0 ml/min; volumul de injectare a probei a fost de 5 μL. Au fost identificați opt compuși PhG, și anume, cistanozida F, echinacozida, 6′-acetilacteozida, cistanozida C, cistanozida A, acteozida, 2′-acetilacteozida și izoacteozida; prin utilizarea substanțelor de referință corespunzătoare și a unei metode standard externe, conținutul celor 8 PhG de mai sus a fost cuantificat prin analiza HPLC (Figura 1).

2.4. Protocolul experimental pe animale.

Un total de 60 femele de șobolan Sprague-Dawley adulți în vârstă de 3 luni au fost selectați de la centrul de testare pe animale al Universității Medicale Ningxia, cu greutatea corporală inițială medie de aproximativ 234 ± 25 g. Șobolanii au fost găzduiți într-un mediu standard fără patogeni specifici pentru a se aclimatiza timp de 1 săptămână. Apoi, toți șobolanii au fost anesteziați (hidrat de cloral, 100 mg/kg, ip) numai sau ovariectomizați simulat (SHAM), sau două ovare au fost îndepărtate și apoi împărțite aleatoriu în 5 subgrupe: tratate oral cu vehicul (0,5% CMC- Na) a fost stabilit ca grup model (OVX), valerat de estradiol (1 mg/kg/zi) ca grup pozitiv (EV) și 60, 120 și 240 mg/kg/zi de CDP ca scăzut (CDPL), grupuri de dozare moderată (CDPM) și, respectiv, înaltă (CDPH). Toți șobolanii au fost administrați pe cale orală zilnic și au durat timp de 3 luni cu doza ajustată la fiecare 2 săptămâni, ceea ce depinde de modificarea greutății întregului corp. În ultima zi a experimentului pe animale, s-a obținut 24-oră de urină utilizând cuști metabolice; serul a fost colectat din artera femurală a șobolanilor anesteziați; femurale drepte, tibia și toate organele au fost disecate și stocate la -80 grad C pentru analize ulterioare. Experimentele pe animale pe care le-am efectuat au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor al Universității Medicale Ningxia.

2.5. Determinarea densității minerale osoase și analiza micro-CT.

În primul rând, a fost utilizată o mașină de absorbție cu raze X cu energie duală (Lunar, SUA) pentru a estima densitatea minerală osoasă totală a femurului drept al fiecărui șobolan; în al doilea rând, același femur a fost folosit pentru a estima imaginea 3D a microarhitecturii osoase trabeculare prin utilizarea unui aparat de scanare micro-CT (GE, America). Rezoluția izotropă a fost setată la 14 μm pentru a obține o imagine 3D ideală; regiunea de interes (ROI) a fost aleasă prin stabilirea acelorași coordonate în placa de creștere a femurului fiecărei probe; și parametrii morfometrici osoși, inclusiv separarea trabeculară (Tb. Sp), numărul trabecular (Tb. N), grosimea trabeculară (Tb. Th), conținutul de minerale osoase (BMC), densitatea minerală a țesutului (TMD) și conținutul de minerale a țesutului (TMC). ) au fost obținute prin analizarea ROI.

2.6. Analiza biochimică a serului și urinei.

Activitățile serice ale catepsinei K, TRAP, SOD și GSH, precum și conținutul de PTH seric, calcitonină, ERR, MDA, BGP și DPD urinei, au fost determinate prin folosirea truselor de reactivi corespunzătoare conform instrucțiunilor producătorului și nivelul de fosfatază alcalină (ALP) și conținutul de calciu (Ca) și fosfor (P) seric și urinar au fost estimate utilizând o mașină automată (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, SUA).

2.7. Analiza Western Blot.

Osteoclastele au fost induse prin utilizarea celulelor RAW 264.7 adăugate cu factor de stimulare a coloniilor de macrofage (MCSF) și RANKL. Pe scurt, 1 × 107 celule RAW 264,7 au fost cultivate într-o placă de 6-godeuri în prezența a 3{0 ng/mL de MCSF și 25 ng/mL de RANKL. După 6 zile de inducție, celulele osteoclaste mature au fost identificate prin utilizarea metodei colorate cu TRAP cu trusa corespunzătoare, apoi tratate cu CDP (0.1, 0.01 și 0.001 mg/mL). , respectiv) timp de 24 h; apoi, celulele au fost lizate cu un tampon de liză care conţine 0,5 mmol fluorură de fenilmetilsulfonil, protează şi inhibitori de fosfatază. Lizatul a fost apoi separat folosind 10% SDS-PAGE și transferat pe o membrană PVDF, care a fost sondată cu AKT1, NF-kB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos și -actină (1: 400) după blocare cu 5% lapte degresat timp de 2 ore. Aceleași membrane au fost îndepărtate și testate din nou cu cei 9 anticorpi corespunzători de mai sus, respectiv, apoi au fost detectate de software-ul Image Lab la sfârșit. Experimentele au fost repetate de trei ori.

2.8. Analize statistice.

Toate datele obținute din experimentele in vivo și in vitro, descrise ca medie ± SD, au fost analizate prin utilizarea ANOVA unidirecțională urmată de testul Dunnett (software SPSS 22.0, SPSS, SUA); p < 0="" 05="" a="" fost="" semnificativ="">

Rezultate

3.1. Compoziția chimică a Cistanche Deserticola P.

Prin utilizarea metodei HPLC, optglicozid feniletanoidcompușii au fost găsiți în această fracție, așa cum arată figura 1. Prin utilizarea referințelor standard și a unei metode standard externe, compușii și conținutul lor au fost identificați și cuantificați după cum urmează: (1) actozidă F (3,6 la sută), (2) echinacozidă (8,8 la sută), (3) cistanozidă A (5.{ {9}} procente), (4) actozidă (13,3 la sută), (5) izoacteozidă (3,3 la sută), (6) actozidă C (3,6 la sută), (7) 2′-acetilacteozidă (9,9 la sută) și (8) ) 6′-acetilaceozidă (3,2 la sută). Conținutul total al acestor opt componente a fost cuantificat ca 50,7 la sută.

3.2. Efectele Cistanche Deserticola P asupra densității minerale osoase și microarhitecturii Trabecula.

Densitatea minerală osoasă totală a șobolanilor din diferite subgrupe este prezentată în Figura 2. O tendință de scădere a conținutului densității minerale osoase a fost observată la șobolanii din grupul model OVX, care a scăzut cu aproape 12.0 la sută după 12 săptămâni de operație în comparație cu șobolanii din grupul SHAM (p < 0="" 001).="" toți="" șobolanii="" tratați="" cu="" cdp="" au="" prezentat="" o="" densitate="" minerală="" osoasă="" semnificativ="" crescută="" cu="" 11,2%,="" 12,0="" procente="" și,="" respectiv,="" 10,7%="" (p=""><0 01),="" în="" comparație="" cu="" șobolanii="" modelului="" ovx="" grup.="" în="" plus,="" în="" concordanță="" cu="" datele="" despre="" densitatea="" minerală="" osoasă="" totală,="" reconstrucția="" micro-ct,="" precum="" și="" determinarea="" histomorfometrică="" a="" femurului="" au="" arătat="" că="" șobolanii="" din="" grupul="" ovx="" au="" prezentat="" o="" deteriorare="" evidentă="" a="" arhitecturii="" trabeculare,="" evidențiată="" de="" numărul="" și="" suprafața="" trabeculei="" în="" mod="" semnificativ="" reduse,="" de="" asemenea.="" ca="" tb="" crescut="" semnificativ.="" sp="" în="" comparație="" cu="" șobolanii="" din="" grupul="" sham.="" tratamentul="" cu="" cdp="" a="" prevenit="" deteriorarea="" indusă="" de="" ovx="" în="" arhitectura="" trabeculară;="" după="" cum="" arată="" figura="" 3,="" bmc,="" tmc="" și="" tb.="" valorile="" n="" au="" crescut="" semnificativ="" și="" aria="" tb.="" sp="" a="" scăzut="" considerabil,="" în="" timp="" ce="" valorile="" tmd="" și="" tb.="" păreau="" că="" nu="" au="" fost="" afectați="" semnificativ="" de="" operațiunea="" ovx="" și="" de="" intervenția="" noastră="">

3.3. Efectele Cistanche Deserticola P asupra parametrilor biochimici urini și serici.

După cum arată figura 4, au fost detectate tendințe semnificative de scădere a nivelului urinar de P și a conținutului seric de calcitonină la șobolanii din grupul model OVX, care a fost cu aproape 30% și 60% mai puțin decât șobolanii SHAM (p < 0="" 001="" ),="" respectiv,="" în="" timp="" ce="" nu="" s-au="" observat="" tendințe="" evidente="" de="" creștere="" sau="" scădere="" a="" nivelurilor="" urinare="" de="" ca="" și="" ca="" seric,="" precum="" și="" p="" seric="" și="" pth="" seric="" între="" grupurile="" ovx="" și="" sham.="" tratamentul="" cu="" cdp="" a="" prevenit="" în="" mod="" semnificativ="" pierderea="" serului="" p="" și="" ca="" la="" șobolanii="" ovx,="" evidențiată="" de="" nivelurile="" serice="" de="" p="" și="" ca="" în="" mod="" semnificativ="" suprareglate="" (p=""><0 05)="" în="" comparație="" cu="" șobolanii="" din="" grupul="" model="" ovx.="" în="" plus,="" s-au="" observat="" tendințe="" crescute,="" dar="" nesemnificative="" din="" punct="" de="" vedere="" statistic,="" ale="" calcitoninei="" atât="" în="" ​​grupurile="" cu="" doze="" mici,="" cât="" și="" în="" cele="" mari="" de="" cdp,="" în="" comparație="" cu="" grupul="" model="">

3.4. Efectele Cistanche Deserticola P asupra formării osoase și markerilor de resorbție osoasă.

Efectele benefice ale CDP asupra indicelui de formare osoasa, precum si influentele inhibitiei asupra markerilor de resorbtie osoasa, au fost descrise in Figura 5. In ceea ce priveste markerii de formare osoasa, nivelurile BGP serice aproape nu au fost influentate de interventia chirurgicala ovariectomizata evidentiata de non- modificări semnificative observate în toate grupurile tratate, în timp ce îmbunătățiri semnificative statistic ale ALP serice au fost obținute atât la doze mici (60 mg/kg) cât și la doze moderate (120 mg/kg) ale grupurilor de intervenție CDP atunci când comparativ cu șobolanii din grupul SHAM (p < 0="" 01).="" în="" ceea="" ce="" privește="" indicele="" de="" resorbție="" osoasă,="" nivelurile="" serice="" de="" catepsină="" k="" și="" dpd,="" precum="" și="" trap="" la="" șobolanii="" din="" grupul="" model="" ovx,="" au="" fost="" semnificativ="" îmbunătățite="" cu="" aproximativ="" 75,0="" la="" sută,="" 41,4="" la="" sută="" și,="" respectiv,="" 21,0="" la="" sută,="" în="" comparație="" cu="" șobolanii="" sham.="" și="" atunci="" când="" au="" fost="" tratate="" cu="" cdp,="" în="" special="" cu="" doza="" scăzută="" de="" 60="" mg/kg,="" proprietățile="" catepsinei="" k="" și="" dpd,="" precum="" și="" trap="" în="" grupul="" de="" modele="" ovx="" au="" fost="" în="" mod="" semnificativ="" inhibate="" de="" 67,3%,="" 41,4%="" și,="" respectiv,="" 25,9%,="" ca="" comparativ="" cu="" șobolanii="" din="" grupul="" model="">

3.5. Efectele Cistanche Deserticola P asupra vaginului și uterului, precum și asupra greutăților întregului corp.

Au fost observate diferențe nesemnificative în greutatea inițială a întregului corp la șobolani înainte de tratament în șase grupuri (Figura 6). Cu toate acestea, operația de ovariectomizare a dus la o creștere semnificativă a greutății corporale finale a șobolanilor din grupul model OVX, care este de aproape 36,0 la sută, în timp ce greutatea umedă a uterului și a vaginului a fost redusă drastic cu aproape 9{{4 }}.0 procente și, respectiv, 60,0 la sută, în comparație cu șobolanii SHAM (p < 0="" 001).="" deși="" conținutul="" err="" nu="" a="" prezentat="" nicio="" diferență="" semnificativă="" între="" grupurile="" ovx="" și="" sham,="" toate="" grupurile="" de="" tratament,="" inclusiv="" cdp="" și="" ev,="" au="" crescut="" semnificativ="" nivelul="" err.="" în="" plus,="" atunci="" când="" au="" fost="" tratați="" cu="" ev,="" cele="" de="" mai="" sus="" au="" câștigat="" greutatea="" întregului="" corp,="" precum="" și="" pierderea="" greutății="" vaginului="" și="" uterului="" la="" șobolanii="" ovx,="" au="" fost="" parțial="" inversate="" (p=""><0 001),="" dar="" nu="" au="" fost="" afectate="" de="" intervenția="">

3.6. Efectele Cistanche DeserticolaP asupra nivelurilor serice de MDA, SOD și GSH.

Nu a existat nicio diferență semnificativă statistic în proprietățile SOD și GSH seric între grupurile model SHAM și OVX; după cum descrie Figura 7, o tendință de creștere a GSH poate fi observată între cele două grupuri de mai sus. În plus, nivelul de MDA seric a fost puternic reglat cu aproape 50 la sută la șobolanii din grupul model OVX în comparație cu șobolanii SHAM. Activitatea SOD nu a fost influențată de tratamentul CDP, în timp ce proprietatea GSH a fost îmbunătățită semnificativ prin intervenția CDP, iar CDP a scăzut semnificativ nivelul MDA cu 33,9% și 42,4% la doze de 60 și, respectiv, 240 mg/kg ( p < 0="">

3.7. Efectele Cistanche deserticola P asupra nivelurilor de exprimare a proteinelor.

Datele noastre, prezentate în Figura 8, au sugerat că tratamentul cu CDP a scăzut semnificativ nivelurile de proteine ​​ale TRAF6, RANK și RANKL în comparație cu controlul. Căile semnalului din aval, inclusiv NF-kB, au fost suprimate, iar PI3K/AKT a fost stimulată prin intervenția CDP, evidențiată de expresia reglării în jos a NF-kB-p65, în timp ce PI3K-p85 și AKT1 au fost reglate în sus. În consecință, expresia NFAT2 a fost semnificativ scăzută, iar c-Fos a crescut după tratamentul cu CDP la o concentrație de 0.001-0,1 mg/mL. Un mecanism sugerat este descris în Figura 9, în care CDP a redus nivelurile de RANKL și RANK, ducând la reducerea cantităților de legare a acestui ligand cu receptorul său, iar conexiunea RANKL cu RANK a fost redusă și mai mult prin reglarea în jos a TRAF6, urmată de suprimarea căilor din aval, inclusiv calea NF-κB, în timp ce calea semnalului PI3K/AKT a fost stimulată, ceea ce duce în cele din urmă la scăderea expresiei NFAT2 și la creșterea nivelului c-Fos.

4. Discutie

Glicozidele feniletanoide sunt componente solubile în apă care există în mod natural, care există pe scară largă în regnul plantelor medicinale [11]. Până acum, compușii glicozidelor feniletanoide au atras din ce în ce mai mulți cercetători datorită rolului lor evident în tratarea diferitelor afecțiuni și anomalii umane [13]. Un număr de fracții și compuși bioactivi antiosteoporotici, inclusiv polifenol și glicozide feniletanoide, au fost identificate și izolate din zeci de plante medicinale naturale [5, 10, 12, 16, 17). C. deserticola este bine cunoscut ca „ginseng al deșertului”, ceea ce a implicat profilul de siguranță al acestui TCM comestibil [18, 19]. Ca plantă tonifică generală și hrană naturală pentru sănătate care a fost folosită de mult timp în țările asiatice, C. deserticola a prezentat o funcție benefică pentru creșterea puterii rinichilor. S-a constatat că TCM, folosită în mod tradițional pentru a revigora și păstra esența rinichilor, a fost de obicei folosită pentru a trata osteoporoza, atât in vitro, cât și in vivo, datele publicate au dovedit activitatea antiosteoporotică a C. deserticola [20–23] și constituenții glicozidici feniletanoid, inclusiv echinacozidul și acteozidul sunt principalele componente bioactive care există în această plantă medicinală comestibilă; toate acestea au sugerat că nu numai echinacozidul și acteozidul în sine, ci și alte componente glicozide feniletanoide conținute în C. deserticola au fost considerate responsabile pentru proprietatea antiosteoporotică a acestei plante. În studiul nostru de față, o rășină macroporoasă de siguranță favorabilă a fost utilizată pentru a izola și îmbogăți fracția de glicozidă feniletanoid din C. deserticola și, prin utilizarea metodei HPLC, opt componente principale de glicozidă feniletanoid, și anume, actozidă F, echinacozidă, cistanozidă A, acteozidă, izoacteozidă, acteozidă C, 2′-acetilaceozidă și 6′-acetillacteozidă au fost găsite în fracția glicozidă feniletanoidică izolată, iar conținuturile au fost 3,6 la sută, 8,8 la sută, 5,0 la sută, 13,3 la sută, 3,3 la sută, 3,9 la sută, 3,9 la sută. și, respectiv, 3,2 la sută. Echinacozidul, unul dintre compușii cu activitate principală înregistrați în C. deserticola [14], sa dovedit că posedă activitate antiosteoporotică; cu toate acestea, doza de 270 mg/kg a fost atât de mare încât a limitat aplicarea sa clinică ulterioară [24]. În experimentele actuale, fracția totală de glicozidă feniletanoid cu o doză mai mică de 60-240 mg/kg greutate corporală/zi a fost utilizată pe șobolani OVX, iar conținutul constituenților identificați a fost de aproape 50% pur în această fracție prin utilizarea metoda HPLC.

Era bine cunoscut faptul că OVX poate provoca osteoporoză și se credea că un șobolan OVX este un model clasic și potrivit pentru a simula osteoporoza umană postmenopauză. În același timp, s-a observat o scădere semnificativă a densității minerale osoase, a microarhitecturii osoase trabeculare, a greutăților umede uterine și vaginului și a nivelului de estrogen, precum și o îmbunătățire evidentă a resorbției osoase și a greutății corporale, după intervenția chirurgicală de ovariectomie, dintre care au fost în parte din cauza pierderii de estrogen [25]. Datele noastre, până acum, au demonstrat în mod clar că OVX a indus într-adevăr osteoporoza postmenopauză și este întotdeauna însoțită de scăderea bruscă a calității oaselor, a microarhitecturii osoase și a greutății umede a uterului și vaginului. Deoarece EV este un agent de substituție hormonală generală care a fost utilizat în practica clinică, a fost folosit ca un control pozitiv în experimentul nostru in vivo și greutatea corporală câștigată și atrofia uterului, precum și deteriorarea densității minerale osoase și microarhitectura osului trabecular. , au fost de așteptat inversate de suplimentarea cu EV. Spre deosebire de controlul pozitiv, scăderea greutății vaginului și uterului, precum și greutatea corporală totală câștigată a șobolanilor din grupul model OVX, nu au fost afectate de tratamentul CDP, ceea ce a implicat că CDP ar putea îmbunătăți formarea osoasă fără a induce efecte secundare. asupra corpului și a țesuturilor organice uterine. Deși nivelurile de ERR au fost reglate în mod semnificativ prin tratamentul CDP, a fost la fel ca un efect de fitoestrogen că nu au fost observate efecte secundare asupra țesuturilor organice uterine și vaginale. În plus, tratamentul CDP a întărit semnificativ calitatea osului la șobolanii OVX, care au fost deteriorați de intervenția chirurgicală de ovariectomie.

În plus, nivelurile de P și Ca în urinar și serul șobolanilor OVX au fost, de asemenea, utilizate pentru a reflecta efectul antiosteoporotic, iar concentrațiile de Ca și P anorganic au fost de obicei dependente de nivelurile de calcitonină și PTH [26]. În studiul de față, deși nu s-au obținut tendințe semnificative de scădere sau creștere a nivelului de excreție urinară de Ca, P seric, Ca seric și PTH la șobolanii din grupul model OVX, nivelurile urinare semnificative de P și calcitonină (p < {="" {1}})="" au="" fost="" observate.="" în="" concordanță="" cu="" datele="" publicate="" conform="" cărora="" deficiența="" de="" estrogen="" cauzată="" de="" operația="" de="" ovariectomie="" a="" condus="" întotdeauna="" la="" o="" scădere="" a="" nivelului="" de="" calcitonină="" în="" sânge,="" această="" scădere="" a="" calcitoninei="" serice="" a="" condus="" în="" cele="" din="" urmă="" la="" un="" nivel="" crescut="" de="" pth,="" unde="" ca="" a="" fost="" considerat="" ca="" regulatorul="" major="" al="" secreției="" de="" pth.="" deoarece="" concentrația="" de="" pth="" nu="" a="" arătat="" nicio="" diferență="" semnificativă="" între="" grupurile="" ovx="" și="" sham="" în="" studiul="" de="" față,="" nivelul="" de="" ca="" atât="" în="" ​​ser,="" cât="" și="" în="" urină,="" de="" asemenea,="" nu="" a="" prezentat="" modificări="" evidente="" între="" cele="" două="" grupuri="" de="" mai="" sus.="" cu="" toate="" acestea,="" a="" fost="" obținută="" o="" tendință="" de="" scădere="" semnificativă="" a="" nivelului="" de="" calcitonine="" între="" grupurile="" ovx="" și="" sham="" și,="" în="" consecință,="" conținutul="" de="" p="" în="" urina="" ovx="" a="" fost="" puternic="" scăzut.="" am="" crezut="" că="" datele="" de="" mai="" sus="" pot="" explica="" fenomenul="" contradictoriu="" de="" ce="" excreția="" urinară="" a="" nivelului="" de="" ca="" la="" șobolanii="" ovx="" nu="" a="" arătat="" nicio="" schimbare="" evidentă="" în="" comparație="" cu="" șobolanii="" sham,="" iar="" acest="" fenomen="" poate="" fi,="" de="" asemenea,="" legat="" de="" rata="" crescută="" de="" turnover="" osos="" [27]="" .="" după="" tratamentul="" cu="" cdp,="" nivelurile="" de="" p="" și="" ca="" din="" ser="" au="" fost="" în="" mod="" semnificativ="" suprareglate,="" iar="" conținutul="" de="" p="" din="" urină="" a="" fost="" reglat="" în="" jos="" la="" șobolanii="" ovx,="" ceea="" ce="" a="" reflectat="" că="" cdp="" nu="" numai="" că="" ar="" putea="" preveni="" excreția="" de="" elemente="" minerale="" osoase,="" ci="" și="" să="" sporească="" conținutul="" de="" ser="" al="" acestora.="" elemente,="" suprimând="" astfel="" indirect="" pierderea="">

În plus, markerii de formare osoasă și resorbție, precum și enzimele antioxidante, inclusiv SOD și GSH, au fost, de asemenea, folosiți pentru a explica mecanismele antiosteoporotice de bază ale CDP. Similar cu datele publicate, nivelul ALP la șobolanii din grupul model OVX a prezentat o tendință de creștere nesemnificativă statistic, ceea ce indică o rată accelerată a turnover-ului osos în osteoporoza postmenopauză [10]. Cu toate acestea, după tratamentul cu CDP (60, 120 și 240 mg/kg/zi), proprietatea ALP a fost semnificativ îmbunătățită. Era bine cunoscut faptul că OVX a provocat o scădere bruscă a nivelurilor de estrogen, ceea ce duce de obicei la o resorbție osoasă depășită și stres oxidativ [28], evidențiată de nivelurile de TRAP, catepsină K și DPD, precum și de MDA în mod semnificativ supraregulate la șobolanii din Grupul de modele OVX. Cu toate acestea, aceste deteriorări au fost parțial îmbunătățite prin intervenția CDP. În plus, tratamentul cu OVX la șobolan cu CDP (60 și 240 mg/kg) a demonstrat o creștere semnificativă a activității GSH (p < 0="" 05).="" rezultatele="" de="" mai="" sus="" au="" implicat="" că="" cdp="" a="" prezentat="" un="" efect="" terapeutic="" asupra="" osteoporozei="" induse="" de="" ovx="" și="" aceste="" efecte="" au="" fost="" atât="" prin="" îmbunătățirea="" formării="" osoase,="" cât="" și="" prin="" suprimarea="" resorbției="" osoase,="" precum="" și="" prin="" îmbunătățirea="" sistemului="" antioxidant="">

Activarea RANK de către ligandul său RANKL a stimulat expresiile NFAT2 și c-Fos prin semnalizarea PI3K/AKT și NF-kB [29]. NF-kB s-a dovedit esențial pentru osteoclastogeneză, deoarece perturbarea NF-kB ar putea duce la o diferențiere osteoclastă afectată cu un fenotip osteoporotic, iar NF-kB a reglat c-Fos și a redus expresiile NFAT2 în timpul osteoclagenezei induse de RANKL/RANK/TRAF. Pentru a estima influența benefică a CDP asupra osteoclastogenezei mediate de NFAT2 și c-Fos, au fost analizate nivelurile de expresie ale RANKL și RANK. De așteptat, CDP a inhibat semnificativ NFAT2 și a stimulat nivelurile de c-Fos prin reglarea în jos a expresiilor RANKL și RANK. Între timp, RANK însuși nu avea proprietatea intrinsecă a kinazei, cu excepția cazului în care a fost alăturat de TRAF6 pentru a declanșa semnalizarea în aval [3]. CDP a redus, de asemenea, expresia TRAF6, ceea ce a condus la reducerea semnificativă a cantităților de legare ale RANKL și RANK. Un mecanism antiosteoporotic ipotetizat al CDP pe șobolanii OVX a acoperit căile de semnalizare de mai sus, iar regulatorii au fost descriși în Figura 9. Concis, CDP a scăzut nivelurile TRAF6, RANKL și RANK, suprimând astfel căile de semnalizare din aval, inclusiv PI3K/AKT și NF-kB care sunt declanșate de RANKL/RANK și, în cele din urmă, au redus expresiile și activitățile proteinelor cheie osteoclastogene NFAT2 și c-Fos. Prin urmare, mai multe indicii de date au implicat efectul benefic al CDP asupra metabolismului osos al șobolanilor OVX, în principal prin căile PI3K/AKT și NF-κB mediate de RANKL/RANK/TRAF6-.

5. Concluzie

În rezumat, glicozidele feniletanoide totale, izolate din C. deserticola, au prezentat efecte benefice semnificative asupra osteoporozei postmenopauză a șobolanilor OVX, iar potențialul terapeutic în suprimarea pierderii osoase a fost în principal prin stimularea formării osoase și inhibarea resorbției osoase, precum și îmbunătățirea antioxidantului osos. sistem; mecanismele pot fi legate de activarea NF-κB indusă de RANKL/RANK/TRAF6- și de inactivarea PI3K/AKT, precum și de stimularea c-Fos și suprimarea NFAT2 și, în final, diferențierea osteoclastelor a fost inhibată.

Abrevieri

AKT: Protein kinaza B

ALP: Fosfataza alcalina

BGP: proteină GLA osoasă

BMC: Conținut mineral din oase

CDP: fracțiunea glicozidă feniletanoidă a C. deserticola

CK: Cathepsin K

CT: calcitonina

DPD: Deoxipiridinolină

ERR: receptor alfa legat de estrogen

EV: Valerat de estradiol

GSH: Glutation l-PTH: parathormon intact

MCSF: factor de stimulare a coloniilor de macrofage

MDA: Malondialdehidă

NFAT2: factorul nuclear al celulelor T activate c2

NF-kB: factor nuclear-kappa B

OPG: Osteoprotegerina

OVX: Ovariectomizat

PhGs: glicozide feniletanoide

PI3K: Fosfoinozitid 3-kinaza

RANG: Activator receptor al factorului nuclear kappa B

RANKL: Activator receptor al factorului nuclear-kappa

B ligand ROI: Regiunea de interes

SOD: Superoxid dismutază

Tb. N: Număr trabecular

Tb.Sp: Separare trabeculară

Tb.Th: Grosimea trabeculară

MTC: Medicina tradițională chineză

TMC: Conținut de minerale tisulare

TMD: Densitatea minerală a țesuturilor

TNF: factor de necroză tumorală

TRAF6: factorul 6 asociat receptorului factorului de necroză tumorală

CAPCANĂ: Fosfatază acidă rezistentă la tartrat.

Disponibilitatea datelor

Datele utilizate pentru a susține concluziile acestui studiu sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere.

Conflicte de interes

Autorii nu au avut niciun conflict de interese.

Contribuțiile autorilor

XM a proiectat și a supravegheat experimentele; SD și LY au efectuat majoritatea experimentelor și au redactat manuscrisul; BZ și JL au efectuat analiza Western blot și au participat la experimente pe animale; YD a analizat datele; QT și PY au revizuit manuscrisul. Toți autorii au revizuit manuscrisul. Lingling Yang și Shuqin Ding au contribuit în mod egal la manuscris.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de granturi de la Fundația pentru Tehnologia Știință a Învățământului Superior din Ningxia (NGY2017090), Fundația Națională de Științe Naturale din China (nr. 81560684), Programul cheie de cercetare și dezvoltare din Ningxia (2018BHF2001), Cercetarea cheie Ningxia și Programul de invenții de cooperare științifică și tehnologică din Est și Vest (nr. 2017BY084 și 2017BY079) și Fundația West Light a Academiei Chineze de Științe-Young Scientists of West 2017.

Referințe

[1] LJ Melton III, EA Chrischilles, C. Cooper, AW Lane și BL Riggs, „Perspectivă. Câte femei au osteoporoză?”, Journal of Bone and Mineral Research, voi. 7, nr. 9, p. 1005–1010, 1992.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham și SL Kates, „The 1-year mortality of patients treated in a sold fracture program for elders,” Geriatric Orthopaedic Surgery & Rehabilitation, voi. 1, nr. 1, p. 6–14, 2010.

[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew și EL Yong, „TRAF6 mediates suppression of osteoclastogenesis and prevention of ovariectomy-induced bone loss by a novel prenylflavonoid,” Journal of Bone and Mineral Research, voi. 32, nr. 4, pp. 846–860, 2017.

[4] JH Kim și N. Kim, „Regularea NFATc1 în diferențierea osteoclastelor”, Journal of Bone Metabolism, voi. 21, nr. 4, p. 233–241, 2014.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu și colab., „Activitatea antiosteoporotică și constituenții Podocarpium podocarpus”, Phytomedicine, voi. 22, nr. 1, p. 94–102, 2015.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon, și colab., „Acidul protocatechuic atenuează pierderea osoasă trabeculară la șoarecii ovariectomizați”, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, voi. 2018, ID articol 7280342, 11 pagini, 2018.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby, și colab., „Rutina izolată din Chrozophora tinctoria îmbunătățește marcatorii de proliferare și osificare a celulelor osoase”, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, voi. 2018, ID articol 5106469, 10 pagini, 2018.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon și T. Tong-un, „Extractul de frunze de Morindacitrifolia L. protejează împotriva ischemiei cerebrale și osteoporozei într-un model experimental in vivo. de menopauză”, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, voi. 2018, ID articol 1039364, 13 pagini, 2018.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura și W. Thukham-mee, „Efectul antiosteoporotic al unui extract combinat de Morus alba și Polygonum odoratum”, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, voi. 2014, ID articol 579305, 9 pagini, 2014.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao și X. Ma, „Syringin previne pierderea osoasă la șoarecii ovariectomizați prin inhibarea mediată de TRAF6 a NF-kB și stimularea PI3K/AKT ," Phytomedicine, voi. 42, p. 43–50, 2018.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin și SJ Wang, „Echinacoside, un constituent activ al Herba Cistanche, suprimă activitatea epileptiformă în neuronii piramidali CA3 din hipocamp”, The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, voi. 22, nr. 3, p. 249–255, 2018.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao și X. Ma, „Efectul terapeutic al cistanozidei A asupra metabolismului osos al șoarecilor ovariectomizați”, Molecules, voi. 22, nr. 2, p. 197, 2017.

[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan și MI Georgiev, „Verbascoside–a review of its occurrence, (bio)sinteza și semnificația farmacologică”, Biotechnology Advances, voi. 32, nr. 6, p. 1065–1076, 2014.

[14] Comitetul editorial al Farmacopeei Chineze, Farmacopeea Republicii Populare Chineze, China Medical Science and Technology Press, Beijing, China, ediția a 10-a, 2015.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li și colab., „Efectele unui preparat din plante tradiționale chinezești asupra osteoblastelor și osteoclastelor”, Maturitas, voi. 61, nr. 4, p. 334–339, 2008.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong și Q. Zhao, „Cynomorium songaricum previne resorbția osoasă la șobolanii ovariectomizați prin suprimarea mediată de RANKL/RANK/TRAF6 a PI3K/AKT și Căile NF-kB”, Life Sciences, voi. 209, p. 140–148, 2018.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang și colab., „Kaempferitrin prevents oss loss in ovariectomized rats”, Phytomedicine, voi. 22, nr. 13, p. 1159–1162, 2015.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang și YW Cheng, „Safety assessment of the Cistanche tubulosa health food product Memoregain®: genotoxicity and 28-day repeated doze toxicity test,” Food and Chemical Toxicology , vol. 118, p. 581– 588, 2018.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng și F. Chen, „Un studiu sistematic al activității antioxidante a 30 de plante medicinale chinezești folosind testul puterii antioxidante reducătoare ferice”, Food Chemistry, voi. 97, nr. 4, p. 705–711, 2006.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu, și colab., „Cistanche deserticola polizaharidă atenuează osteoclastogeneza și resorbția osoasă prin inhibarea semnalizării RANKL și a producției de specii reactive de oxigen”, Journal of Cellular Physiology, voi. 233, nr. 12, p. 9674–9684, 2018.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang și W. Liang, „Extract apos de Cistanches Herba care afectează BGP și TRAP seric și ARNm Smad1 de măduvă osoasă, ARNm Smad5, ARNm TGF- 1 și TIEG1 Nivelurile de expresie a ARNm în boala osteoporoză”, Molecular Biology Reports, voi. 40, nr. 2, p. 757–763, 2013.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su și colab., „Extractul de Cistanche deserticola crește formarea osoasă în osteoblaste”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, voi. 64, nr. 6, p. 897–907, 2012.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong și Z. Huang, „Efectul extractului apos de Cistanches Herba asupra pierderii osoase la șobolanul ovariectomizat”, Jurnalul Internațional de Științe Moleculare, voi. 12, nr. 8, p. 5060–5069, 2011.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang și colab., „Activitatea antiosteoporotică a echinacozidei la șobolani ovariectomizați”, Phytomedicine, voi. 20, nr. 6, p. 549–557, 2013.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian și LL Xu, „Activitatea antiosteoporotică a icariinei la șobolani ovariectomizați”, Phytomedicine, voi. 16, nr. 4, p. 320–326, 2009.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed și M. Marzouk, „Possible mecanism antiosteoporotic al extractului de Cicer arietinum la șobolani ovariectomizați”, Jurnalul Internațional de Patologie Clinică și Experimentală, voi. 8, nr. 4, p. 3477– 3490, 2015.

[27] R. Swaminathan, „Markeri biochimici ai turnover-ului osos”, Clinica Chimica Acta, voi. 313, nr. 1-2, pp. 95–105, 2001.

[28] S. Muthusamy, I. Ramachandran, B. Muthusamy, et al., „Ovariectomia induce stresul oxidativ și afectează sistemul antioxidant osos la șobolanii adulți”, Clinica Chimica Acta, voi. 360, nr. 1-2, pp. 81–86, 2005.

[29] WJ Boyle, WS Simonet și DL Lacey, „Diferențierea și activarea osteoclastelor”, Nature, voi. 423, nr. 6937, p. 337– 342, 2003.