Extractul de Cistanche Deserticola poate promova răspunsul imun?

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Shuangshuang Feng a,1, Xiumei Yang a, Xiang Weng a,1, Bin Wang b, Ailian Zhang a,*

un laborator cheie de resurse biologice și inginerie genetică din Xinjiang, Colegiul de Științe și Tehnologie a Vieții, Universitatea Xinjiang, Urumqi, 830046, Xinjiang, China

b Laboratorul cheie de virologie moleculară medicală, Școala de științe medicale de bază, Colegiul Medical din Shanghai, Universitatea Fudan, Shanghai, 200032, China

Relevanță etnofarmacologică:Polizaharidele din plante au prezentat un mare potențial de îmbunătățire a sistemului imunitar. Adjuvanții sunt un instrument cheie pentru dezvoltarea de vaccinuri eficiente. În studiul nostru anterior, o polizaharidă solubilă în apă extrasă din sălbăticieCistanchedeserticolaYC Ma a arătat o activitate imunostimulatoare puternică.

Scopul studiului:În acest studiu, profilurile imunitare și eficacitatea extractelor apoase de cultivatCistanchedeserticolaAu fost investigate YC Ma (AECCD) pe șoareci ICR împotriva ovalbuminei (OVA). În experimente in vitro, a fost evaluat posibilul mecanism de activare a DC de către AECCD.

Materiale și metode:AECCD au fost extrase folosind apă fierbinte după care polizaharidele brute au fost precipitate cu etanol. Șoarecii au fost mai întâi imunizați subcutanat cu OVA (10 ug per șoarece) singur sau OVA (10 ug per șoarece), respectiv, conținând diferite doze de AECCD (200, 400 și 800 ug per șoarece) în zilele 1 și 14 și amploarea și cinetica Au fost apoi evaluate anticorpii și răspunsurile mediate de celule.

Rezultate:AECCD a provocat răspunsuri IgG viguroase și pe termen lung cu răspunsuri mixte Th1/Th2 și niveluri reglate în sus de citokine asociate cu Th (CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- și CD8 plus IFN-). Mai mult, AECCD a indus celulele puterniceimunraspunscaracterizată prin proliferarea crescută a splenocitelor, precum și răspunsul celulelor T activate. În special, AECCD a îmbunătățit semnificativ maturarea celulelor dendritice (DC) și a inhibat Tregs. Experimentele in vitro, testele preliminare au indicat că AECCD a indus activarea DC prin promovarea maturării fenotipice, a secțiunii citokinelor și a activității alostimulatoare. Toll-like receptor 4 (TLR4) a fost un receptor esențial pentru DC pentru a lega direct AECCD. Inhibitorii NF-kB au scăzut nivelurile de expresie ale CD40, CD80, CD86 și MHC-II și producția de IFN-, TNF- și IL-6 prin DCS.

Concluzii:În cele din urmă, aceste constatări au sugerat că AECCD ar putea provoca un antigen puternic și durabil specificimunrăspunsuriprin activarea DC, care a fost implicată în reglarea markerilor de maturare și a expresiei citokinelor prin calea NF-κB legată de TLR{0}}. Studiul indică faptul că AECCD este un potențial imunomodulator.

Cuvinte cheie:Adjuvant polizaharidic Cultivat,Cistanchedeserticola, Imunomodulator, celule dendritice receptor 4 asemănător Toll, cale de semnalizare NF-kB

Cistanche deserticolaextract promoveazăimunraspuns

1. Introducere

Multe studii au sugerat că adjuvanții pot spori eficacitatea vaccinurilor împotriva diferitelor boli infecțioase, cum ar fi HIV, COVID-19, gripa și febra aftoasă (Cao și colab., 2020; Giuseppe și colab., 2018). ). Adjuvanții pot induce diferite tipuri și mărimi deimunrăspunsuri, astfel încât un adjuvant selectat corespunzător poate induceimunraspunsnecesare pentru un anumit agent patogen sau antigen (Reed et al., 2013). Extractele naturale de ierburi au fost mult timp utilizate pe scară largă în viața de zi cu zi sau în îngrijirea sănătății. În multe cazuri, medicina tradițională chineză (TCM) și componentele sale active, în special adjuvanții multipli derivați din polizaharide TCM, au îmbunătățit semnificativ eficacitatea vaccinurilor. Polizaharidele TCM (Advax™, polizaharidă Astragalus, polizaharidă Ginseng, polizaharidă Lycium barbarum și polizaharidă Ganoderma lucidum) au avut mai multe avantaje față de alți adjuvanți, cum ar fi siguranță mai bună, biocompatibilitate, îmbunătățire puternică a sistemului imunitar și reactogenitate scăzută (Li și Wang, Schijns2015). et al., 2020). Compușii și formulările pe bază de polizaharide TCM au, prin urmare, potențialul ca candidați adjuvanți.

Cistanche deserticolaYC Ma (Roucongrong în chineză) este un medicament tradițional chinezesc înregistrat în Farmacopeea Chineză și a fost folosit ca aliment tonic de sute de ani în China (Chinese Pharmacopeia Commission, 1992). Studiile farmacologice moderne au arătat multiplele sale aplicații farmacologice și imunomodulatoare (Dong et al., 2007; Fu et al., 2017). În studiul nostru anterior, polizaharidele brute proveneau din sălbaticeCistanchedeserticolaYC Ma a promovat răspunsurile umorale și celulare specifice antigenului și a reglementat maturarea celulelor dendritice (DC) (Zhang și colab., 2018; Zhao și colab., 2019). Cu toate acestea, sălbaticCistanchedeserticolaYC Ma a fost excesiv explorată și listată ca specii pe cale de dispariție.CistanchedeserticolaYC Ma a fost plantat pe scară largă și este utilizat pe scară largă în dezvoltarea și aplicarea resurselor TCM. Cu toate acestea, potențialul adjuvant al cultivateCistanchedeserticolaYC Ma este încă neclar.

DCS sunt regulatori esențiali împotriva bolilor infecțioase. După ce DC-urile sunt activate, moleculele de suprafață și citokinele pro-inflamatorii de pe DC interacționează cu receptorii corespunzători pentru a activa celulele T și a provoca răspunsuri specifice antigenului și producerea de citokine care direcționează adaptarea.imunrăspunsuri(Banchereau și Steinman, 1998). S-a raportat că receptorul toll-like 4 (TLR4) pe DC funcționează ca un receptor important de polizaharide (Park și colab., 2014; Qi și colab., 2016). Într-adevăr, multe polizaharide pot interacționa direct sau indirect cu TLR4 pe DC pentru a activa factorul nuclear din aval-kappa B (NF-κB), care poate induce expresia diferitelor gene proinflamatorii, cum ar fi IFN-, TNF- și IL{{11} }} și răspunsul inflamator pentru eliminarea agenților patogeni (Tian și colab., 2019; Zhou și colab., 2017; Zhu și colab., 2013). Prin urmare, DCS și NF-kB au fost studiate pe larg ca ținte potențiale pentru terapia bolii.

În studiu, cu strategia in vivo (șoareci ICR), am evaluat mai întâi efectele imunostimulatoare ale extractelor apoase deCistanchedeserticolaYC Ma (AECCD) cu diferite doze (scăzută, medie și ridicată) pentru a provoca animunraspunsîmpotriva OVA și explică modul in vitro de a activa DC și căile legate de receptori din aval. Cu un model de șoarece, am dezvăluit că AECCD a promovat răspunsul anticorpilor pe termen lung cu titruri crescute de IgG și celule celulare.imunraspuns. Important, AECCD a indus citokine asociate cu Th, în special producția de IFN, care a condus la răspunsul Th1 împotriva infecțiilor. Efectul de inducție a fost strâns corelat cu o maturare sporită a DC și scăderea Tregs. Din punct de vedere mecanic, AECCD a promovat activarea DC prin calea NF-κB legată de TLR4-. În rezumat, studiul a confirmat activitatea adjuvantă puternică a AECCD în promovarea răspunsului adaptiv. Studiul a pus bazele dezvoltării adjuvanților polizaharidici AECCD.

2. Materiale și metode

2.1. Reactivi

Ovalbumină (OVA), 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il){-2, 5-bromură de difeniltetrazoliu (MTT), polimixină B (PMB), concanavalin A (ConA), lipopolizaharidă (LPS), mitomicina C și 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidină (TMB) au fost obținute de la Sigma (SUA). Serul fetal bovin (FBS) a fost achiziționat de la Biological Industries. Kitul de numărare a celulelor-8 (CCK-8) a fost achiziționat de la Biosharp (China). Conjugatele IgG/IgG1/IgG2a-HRP de capră anti-șoarece au fost de la Southern Biotech (SUA). Inject Alum a fost de la Thermo Scientific Pierce (SUA). GM-CSF era de la Peprotech (SUA). Anticorpi marcați fluorescent (anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE, anti-CD62L-PE, anti-MHCII -FITC/Percp-cy5.5, anti-IL-4-PE, anti-IFN– -PE, anti-CD86-APC, anti-CD{40-FITC/PE, anti- CD11c-PE/FITC, anti-CD80-APC), Golgistop, Cytofix/Cytoperm și tampon Perm/Wash au fost toate de la BD Bioscience (SUA). Trusa de colorare a celulelor T de reglementare a fost de la eBiosciences (SUA). TAK-242 era de la MedchemExpress (Shanghai, China). PDTC era de la Beyotime Biotechnology (China). Trusa de analiză a fluxului multi-analiți a fost de la Biolegend (SUA).

2.2. Prepararea AECCD C. deserticola

(Un exemplar de voucher nr. CD10041602) a fost identificat de profesorul Jiang He. AECCD a fost obținut prin extracția cu apă, precipitarea cu etanol și metoda de deproteinizare cu câteva modificări minore (Zhang et al., 2018). Pe scurt, cultivatCistanchedeserticolaa fost mai întâi extras cu apă de mai multe ori și apoi polizaharidele brute au fost precipitate peste noapte prin adăugarea de etanol conform unui raport de volum de 1:4. Apoi polizaharidele brute obținute au fost deproteinizate prin metoda Sevag (Liu et al., 2012). Conținutul total de zahăr a fost detectat a fi de 76,82 la sută prin metoda antron-acid sulfuric (Dubois și colab., 1951).

2.3. Analiza spectroscopică în infraroșu

În scopul analizării grupurilor funcționale organice, AECCD cu KBr a fost presat în pelete pentru măsurarea spectrului infraroșu (IR). Spectrele IR ale probelor au fost determinate în intervalul 4000–400 cm−1.

Cistancheherbapromovaimunraspuns

2.4. Experimente in vivo

2.4.1. Imunizarea animalelor

Șoarecii femele C57BL/6 și șoarecii ICR (6 săptămâni) de la Universitatea Medicală Xinjiang (Urumqi, China) au fost aclimatizați timp de 3 zile. Toate procedurile experimentale au fost efectuate în conformitate cu reglementările Comitetului pentru Etica Experimentelor pe Animale al Laboratorului Cheie de Resurse Biologice și Inginerie Genetică Xinjiang din Universitatea Xinjiang (BRGE-AE001).

Șoarecii au fost imunizați subcutanat cu OVA singur sau OVA cu diferite concentrații de AECCD și stimulați în Ziua 14 în funcție de diferite grupuri, după cum urmează (6 șoareci în fiecare grup): Grupul de control (0,9% NaCl), grupul OVA ( 10 ug OVA), grupul AECCD-H (AECCD 800 ug), grupul OVA/ AECCD-L (10 ug OVA, AECCD 200 ug), grupul OVA/AECCD-M (10 ug OVA, AECCD 400 ug ), grupul OVA/AECCD-H (10 ug OVA, AECCD 800 ug) și grupul OVA/Alum (10 ug OVA, alun 100 ug). Formulările de vaccin în 100 μL de 0,9% NaCl au fost injectate în două locuri diferite (50 μL la fiecare loc) în pielea din spate a fiecărui șoarece. După vaccinare, probele de sânge au fost colectate din plexul retroorbital și serurile au fost achiziționate și stocate la -80 ◦ C pentru analiza ulterioară a detectării IgG. Proliferarea splenocitelor și detectarea citokinei, subseturile de celule T, markerii de suprafață DC și Treg au fost efectuate după același protocol de vaccinare.

2.4.2. Analiza anticorpilor

Titrurile de IgG în ser împotriva OVA au fost determinate prin ELISA în zilele 14, 28, 42 și 56 după vaccinarea primară menționată anterior (Zhang și colab., 2018). IgG1 şi IgG2a au fost măsurate în ziua 21. Absorbanţa la 450 nm/630 nm a fost obţinută utilizând un cititor (Bio-Rad, SUA). Rezultatele răspunsului anticorpilor sunt exprimate ca titruri IgG iar izotipurile IgG1 și IgG2a sunt exprimate ca absorbanțe corespunzătoare.

2.4.3. Testul proliferării splenocitelor

Testul proliferării splenocitelor la șoareci a fost efectuat cu un kit de testare CCK-8 conform instrucțiunilor producătorului. În ziua 21 după prima imunizare, splenocitele au fost izolate din splina șoarecilor imunizați și eritrocitele au fost lizate după măcinare. Splenocitele (1 × 106 celule/godeu) au fost stimulate cu OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL), ConA (10 ug/mL) și LPS (10 ug/mL) pentru două zile și celule goale au fost utilizate ca martor. Activitatea de proliferare a fost exprimată ca indice de stimulare (SI), care a fost calculat raportul de absorbție al unei celule stimulate la o celulă nestimulată sub lungimea de undă de 570/630 nm.

2.4.4. Analiza fenotipării limfocitelor T în ganglionii limfatici drenați și splina

Suspensiile de splenocite din ganglionii limfatici și splină la șoarecii imunizați au fost obținute conform metodei menționate mai sus (Zhang et al., 2018). După spălare, probele (1 × 106 celule/godeu) au fost colorate timp de 30 de minute cu anticorpi pentru markeri de suprafață, inclusiv anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE și anti-CD62L-PE. Nivelurile de limfocite T au fost examinate prin citometrie în flux. Rezultatele fenotipurilor de limfocite T sunt exprimate ca procente de celule CD4 plus T (procent), CD8 plus celule T (procent), CD44 plus celule T (procent) și CD62L plus (procent) celule T.

2.4.5. Analiza citometrică în flux a nivelurilor de citokine

În scopul analizei colorării intracelulare cu citokine, limfocitele splenice au fost separate și procesate într-o suspensie unicelulară în ziua 21 după prima imunizare (Zhang et al., 2017). Probele (2 × 106 celule/mL) stimulate cu OVA (10 ug/mL) au fost incubate timp de 4 ore. Golgistop a fost adăugat ulterior timp de 12 ore. Probele au fost apoi spălate, blocate și colorate cu anticorpi anti-CD4-APC sau anti-CD8a-FITC timp de 30 de minute. După fixare și permeabilizare cu Cyto fix/Cytoperm, probele au fost apoi marcate cu anticorpi anti-IL-4-PE sau anti-IFN--PE. Analiza fluxului a fost efectuată pentru a determina nivelul de citokină.

2.4.6. Estimarea activării DC și a celulelor Treg într-o splină

Pentru a investiga dacă DC și Treg joacă un rol în îmbunătățireaimunraspunsîmpotriva OVA, în ziua 3 după prima vaccinare, limfocitele splenice de la șoareci imunizați au fost recoltate pentru evaluarea maturării DC (Zhang și colab., 2017). Celulele au fost blocate și incubate cu anti-CD11c-PE/FITC, anti-CD40-PE, anti-CD86-APC, anti-CD80-APC și anti-MHCII- FITC timp de 30 min. Celulele au fost analizate prin citometrie în flux. În ziua 21 după prima imunizare, Tregs au fost testați cu trusa de colorare a celulelor T reglatoare de șoarece. Splenocitele au fost colorate cu anti-CD4-FITC pentru markerii de suprafață celulară, urmată de colorare intracelulară cu anti-CD{25-APC și anti-Foxp3-PE conform instrucțiunilor producătorului. Nivelul celulelor CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus a fost determinat prin citometrie în flux.

Cistanche plantă extractul promovează oimunraspuns

2.5. Experimente in vitro

2.5.1. Generarea de DC, viabilitatea celulară și nivelurile de endotoxine

DC derivate din măduva osoasă a șoarecilor C57BL/6 au fost obținute conform metodei descrise anterior (Inaba și colab., 1992). Pe scurt, celulele au fost cultivate cu mediu complet RPMI-1640 (20 ng/mL GM-CSF și 5 ng/mL IL-4). După șase zile, toate celulele suspendate au fost colectate ca DC imature pentru testele ulterioare. Procentul de CD11c plus DC în celulele neaderente a fost determinat a fi de 94% prin citometrie în flux.

Viabilitatea celulară a DC și a splenocitelor de la șoareci la AECCD a fost detectată cu kitul CCK{{0}} conform instrucțiunilor producătorului. Celulele din DCS și splenocite au fost obținute și apoi stimulate cu diferite concentrații de AECCD (0, 10, 100, 400, 800 și 1600 ug/mL). Viabilitatea celulară a fost exprimată ca raportul dintre absorbanța grupului tratat și absorbanța grupului de control) × 100 la sută.

În scopul excluderii efectului endotoxinei în AECCD, după ce AECCD (100, 200 și 400 ug/mL) și LPS (100 ng/mL) au fost pretratate cu PMB (100 ug/mL) timp de 60 de minute, DC (5 × 105 celule/mL) au fost incubate cu AECCD pretratat (100, 200 și 400 ug/mL) și LPS timp de 12 ore. După tratamentul de mai sus, au fost evaluate nivelurile de CD40, CD86, CD80 și MHCII.

2.5.2. Analiza fenotipului DC

Nivelurile de molecule costimulatoare au fost determinate pentru a evalua maturarea prin experimente in vitro. În ziua a șasea, DC au fost tratate cu AECCD (20, 100, 200 și 400 ug/mL) sau LPS (100 ng/mL) timp de 12 ore. Apoi, DC-urile au fost colorate cu molecule de suprafață și analizate prin citometrie în flux.

2.5.3. Producția de citokine de către DC in vitro

Supernatantul culturii celulare a fost colectat pentru a măsura nivelul de citokine utilizând un kit ELISA sau un kit de analiză a fluxului multi-analitic cu metoda CBA. Toate etapele experimentale au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului.

2.5.4. Reacția limfocitelor mixte alogene (MLR)

Splenocitele de la șoareci BALB/c au fost obținute aseptic în mediu RPMI- 1640 (Zhang și colab., 2018). DC-urile C57BL/6 mature (maturate în prezența diferitelor concentrații de AECCD sau LPS) au fost pretratate cu 50 ug/mL Mitomicin C timp de 60 de minute la 37 ◦ C. După spălare, DC au fost amestecate cu splenocite în raport de 1:5 sau 1:10 timp de 2 zile. Proliferarea celulară a fost determinată prin test MTT.

2.5.5. Experimente de neutralizare a inhibitorilor

Pentru a investiga calea NF-κB legată de TLR4-, DC-urile colectate au fost încărcate pe o placă de 24-godeuri și apoi pre-tratate cu TAK-242 (5 μM) sau PDTC (5 μM) , respectiv. După incubare de 1-h, celulele au fost stimulate cu diferite concentrații de AECCD (100, 200 și 400 ug/mL) sau LPS (100 ng/mL) timp de 24 de ore. Apoi, nivelurile de expresie ale moleculelor de suprafață și citokinelor din supernatanții culturii au fost determinate conform metodelor descrise mai sus.

3. Rezultate

3.1. Spectroscopie FTIR

Principalele vârfuri de absorbție ale AECCD din Fig. 1 au fost vârfuri de absorbție caracteristice ale structurilor glicozidice corespunzătoare vibrației de întindere O–H la 3342,95 cm− 1. Banda de la 2933,54 cm− 1 a avut absorbția slabă caracteristică vibrațiilor de întindere C–H. Vârful la 1657,39 cm− 1 a fost atribuit vibrației de încovoiere O–H. Absorbția la 1411.00 cm− 1 a fost atribuită vibrațiilor de întindere O–H sau C–H și C–O. Vârfurile de la 1018,38 cm−1 au indicat, de asemenea, vibrații ale benzilor glicozidice CO și C–O–C.

Fig. 1. Spectrele FTIR ale AECCD.

3.2. Răspunsul anticorpilor seric specific OVA

Serurile de la șoarecii imunizați au fost testate pentru a verifica prezența anticorpilor generați (IgG, IgG1 și IgG2a) împotriva OVA. După cum este afișat în Fig. 2A, titrurile de IgG la șoarecii imunizați cu OVA/AECCD-M au generat IgG totale mai mari (titruri: 220,000, 25{{30}}, 000 și 250,000) în raport cu cele ale grupului OVA (titruri: 100,000, 100,000 și 120,000) și a fost aproape de grupul de alaun (titruri: 250,000, 250,000 și 270,000) în zilele 28, 42 și 56 după vaccinarea primară. OVA/AECCD-M/H a îmbunătățit semnificativ nivelurile de IgG1 în comparație cu grupul OVA (P < 0,05),="" iar="" diferența="" dintre="" grupul="" ova/aeccd-m/h="" și="" grupul="" alum="" nu="" a="" fost="" semnificativă="" (p=""> 0,05). OVA/AECCD-M/H, de asemenea, a îmbunătățit semnificativ nivelurile de IgG2a în comparație cu grupul OVA și grupul Alum (Fig. 2B și C) (P < 0,05).="" nivelurile="" îmbunătățite="" de="" igg2a="" ar="" putea="" preveni="" o="" boală="" care="" necesită="">imunraspuns.

Fig. 2. Titruri de anticorpi specifice OVA și izotipuri IgG în ser. Probele de ser au fost colectate după imunizări primare și de rapel pentru anticorpi cu ELISA. (A) Titrurile de IgG ale serului reunit au fost evaluate în zilele 14, 28, 42 și 56 după prima imunizare. (B-C) IgG1 și IgG2a au fost măsurate în ziua 21 după prima imunizare. Datele sunt prezentate ca medie ± SD (n=6). *P < 0,05="" comparativ="" cu="">

3.3. Răspunsurile imune celulare

Proliferarea limfocitelor splinei a fost investigată prin test MTT sub restimulare cu OVA sau OVA{{0}}. Analiza proliferării a arătat că ambele OVA/AECCD-M au crescut semnificativ proliferarea splenocitelor după expunerea la OVA, OVA323-339, Con A sau LPS în raport cu grupul OVA. OVA și OVA323-339 au îmbunătățit semnificativ răspunsul de proliferare mai mare decât cel din grupul Alum (Fig. 3) (P <>

Fig. 3. Proliferarea splenocitelor la tratamentul AECCD in vivo. Splenocitele au fost restimulate cu OVA, OVA323-339, ConA sau LPS și măsurate prin metoda MTT în ziua 21 după prima imunizare. Proliferarea celulară a fost prezentată ca indice de stimulare (SI): (A-B) Indicele de stimulare a OVA și OVA323-339. (C–D) Indicele de stimulare al ConA și LPS. Datele sunt prezentate ca medie ± SD (n=5). *P<0.05, **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001="" compared="" to="" ova;="" #p="" <="" 0.05="" and="" ##p="" <="" 0.01="" compared="" to="" ova/="">

3.4. Activarea subgrupurilor de celule T în ganglionii limfatici de drenaj și splină

Ganglionii limfatici și splina de la șoareci imunizați au fost recoltați pentru a detecta subseturile de celule T în ziua 21 după vaccinarea primară. Procentul de subseturi de celule T (CD4 plus, CD8 plus, CD44 plus celule T) din ganglionii limfatici din grupul OVA/AECCD-M a fost semnificativ mai mare decât cel al grupului OVA și al grupului Alum (Fig. 4A-D) (P) < 0.05).="" procentele="" de="" subseturi="" de="" celule="" t="" (cd4="" plus,="" cd8="" plus,="" cd44="" plus="" și="" cd62l="" plus="" celule="" t)="" într-o="" splină="" au="" fost="" semnificativ="" mai="" mari="" decât="" cele="" ale="" grupului="" ova="" (fig.="" 4e-j)="" (p=""><0,05). aceste="" constatări="" au="" indicat="" că="" aeccd="" a="" promovat="" mediată="">imunraspuns.

Fig. 4. Nivelurile de subseturi de celule T în ganglionii limfatici drenați și splină in vivo. În ziua 21 după prima vaccinare, celulele din ganglionii limfatici și din splină au fost utilizate pentru a detecta subseturile de celule T prin citometrie în flux. (A-D) Procente de celule T CD4 plus, CD8 plus și CD44 plus în ganglionii limfatici. (E-J) Procente de celule T CD4 plus, CD8 plus, CD44 plus și CD62L plus într-o splină. Datele sunt prezentate ca medie ± SD (n=5). *P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01="" și="" ***p="">< 0,001="" în="" comparație="" cu="" ova;="" #p=""><0,05 și="" ##p=""><0,01 în="" comparație="" cu="">

3.5. Citokine secretate de splenocitele restimulate in vivo

Citokinele Th1/Th2 din splina șoarecilor imunizați au fost determinate prin colorare intracelulară în ziua 21 după prima vaccinare. Nivelurile de CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- și CD8 plus IFN- în grupul OVA/AECCD-M au fost semnificativ mai mari decât în ​​grupul OVA și grupul Alum (P < 0="" .05,="" fig.="" 5).="" diferențele="" au="" indicat="" că="" aeccd="" ar="" putea="" stimula="" răspunsurile="" th1/="" th2,="" în="" special="" mediate="" de="" celule="">imunraspuns.

Fig. 5. Analiza citokinelor specifice antigenului în celulele T in vivo. Splenocitele de la șoareci imunizați au fost examinate în ziua 21 după prima imunizare prin colorare intracelulară cu citokine. (A) Procente de CD4 plus IL-4. (B–C) Procente de CD4 plus IFN- și CD8 plus IFN-. Datele sunt prezentate ca medie ± SD (n=5). *P < {{10}}.05="" și="" **p="">< 0,01="" în="" comparație="" cu="" ova;="" #p="">< 0,05="" comparativ="" cu="">

3.6. Maturarea DC și Tregs in vivo

Activarea DC poate iniția imunitatea adaptivă. Efectele AECCD asupra maturării DC la șoarecii imunizați au fost evaluate în ziua 3 după prima imunizare. OVA/AECCD-M a indus cele mai înalte niveluri de CD40, CD80, CD86 și MHCII pe DC în raport cu grupul OVA și diferența dintre OVA/AECCD-M grupul și grupul de alaun a fost semnificativ (Fig. 6A-D) (P <0,05). frecvența="" cd4="" plus="" cd25="" plus="" foxp3="" plus="" tregs="" în="" grupul="" ova/aeccd-m="" a="" fost="" dramatic="" mai="" mică="" decât="" cea="" din="" grupul="" ova="" (fig.="" 6e)="" (p="">< 0,05).="" aceste="" date="" au="" sugerat="" că="" aeccd="" ar="" putea="" activa="" dc="" și="" scădea="" frecvența="">

Fig. 6. Efectele AECCD asupra maturării DC și Tregs in vivo. Splenocitele de la șoareci ICR au fost utilizate pentru a detecta molecule costimulatoare pe DC și Treg în ziua 3 sau 21 după prima imunizare. (A–D) Procente de CD40, CD86, CD80 și MHCII pe CD11c plus DC. (E) Procente de CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Tregs. Datele sunt prezentate ca medie ± SD (n {{10}}). *P < 0,05="" și="" **p=""><0,01 comparativ="" cu="" ova;="" #p=""><0,05 și="" ##p=""><0,01 în="" comparație="" cu="">

3.7. Teste de citotoxicitate și contaminare cu endotoxine

După tratamentul cu diferite concentrații de AECCD timp de 2 zile, celulele din DCS și splenocitele de șoareci au fost utilizate pentru a determina potențiala citotoxicitate cu trusa CCK-8. Nu a existat un răspuns semnificativ de proliferare inhibată în viabilitatea celulară a DC și a splenocitelor în comparație cu cea a grupurilor de control (Fig. 7A-B) (P > 0.05). Aceste rezultate au arătat că AECCD la o concentrație de 10-1600 ug/mL nu a arătat nicio citotoxicitate semnificativă pentru DC și splenocite în comparație cu controlul (P > 0,05). Astfel, concentrația de AECCD în experimentele ulterioare a fost stabilită să fie sub 1600 ug/mL.

Pentru a exclude interferența contaminării cu endotoxine în efectele AECCD asupra activării DC, a fost folosit PMB, un antibiotic larg recunoscut datorită efectului său de neutralizare a LPS, pentru a exclude contaminarea cu endotoxine (Morrison și Jacobs, 1976). După cum este descris în Fig. 7C–F, nivelurile de expresie CD40, CD80, CD{86 sau MHC-II în DC tratate cu AECCD în prezența PMB nu au arătat nicio schimbare semnificativă ( P > 0,05). Cu toate acestea, a fost observată o scădere dramatică a nivelurilor de expresie CD40, CD80 CD86 și MHC-II la DC tratate cu LPS în prezența PMB (P < 0,001).="" aceste="" rezultate="" au="" demonstrat="" că="" aeccd="" nu="" a="" fost="" contaminat="" cu="">

Fig. 7. Citotoxicitatea și efectele PMB asupra maturării DC induse la AECCD. (A-B) DCS și splenocitele de șoareci au fost cultivate în prezența AECCD timp de 2 zile pentru a determina viabilitatea celulei cu metoda MTT. (C–F) DC au fost incubate timp de 12 ore cu AECCD sau LPS pretratate în prezența/absența PMB timp de 6 0 min. Au fost determinate procentele de CD40, CD80, CD86 și MHCII pe CD11c plus DC. Datele sunt prezentate ca medii ± SD (n =3). **P <0,01 și="" ***p=""><0,001 comparativ="" cu="" grupul="" cu="">

3.8. Maturarea fenotipică și activarea funcțională a DC in vitro

Pe baza experimentelor de imunizare de mai sus, maturarea fenotipică a DC a fost explorată în continuare după tratamentul cu AECCD in vitro. În ziua 6, DC imature au fost stimulate cu o concentrație dată de AECCD sau LPS pentru a analiza moleculele de suprafață. AECCD a indus maturarea celulară caracterizată printr-o creștere semnificativă a procentelor de CD40, CD80 CD{86 și MHC II într-o manieră dependentă de doză (P <0,001, fig.="" 8a-d).="" o="" maturare="" fenotipică="" similară="" a="" dc="" a="" fost="" de="" asemenea="" observată="" după="" stimularea="" cu="" 100="" ng/ml="" lps.="" datele="" analizei="" au="" arătat="" că="" aeccd="" a="" îmbunătățit="" maturarea="">

Din rezultatele de mai sus, AECCD a îmbunătățit maturarea fenotipică a DC. Pentru a observa efectul AECCD asupra funcției DC in vitro, capacitatea DC tratate cu AECCD de a stimula proliferarea celulelor T alogene într-un MLR la un raport DC-splenocite de 1:5 sau 1:10 a fost investigat. DC tratate cu diferite concentrații de AECCD au indus o proliferare semnificativă a celulelor T în comparație cu DC-urile netratate (Fig. 8E-F) (P <0.001). maturarea="" dc="" ar="" putea="" induce="" producerea="" de="" citokine.="" apoi,="" supernatanții="" dc="" tratați="" cu="" aeccd="" sau="" lps="" au="" fost="" detectați="" prin="" trusa="" elisa.="" nivelurile="" de="" il-12="" și="" tnf-="" din="" supernatanții="" dc="" au="" crescut="" dramatic="" într-o="" manieră="" dependentă="" de="" doză="" (p=""><0,001, fig.="">

Fig. 8. Maturarea fenotipică și activarea funcțională a DC după tratamentul AECCD in vitro. (A-D) În ziua 6, DC au fost tratate cu o concentrație dată de AECCD sau LPS timp de 12 ore. Celulele au fost colorate cu anticorpi și determinate prin citometrie în flux. Intensitatea medie de fluorescență (MFI) a CD40, CD8{0, CD{86 și MHCII pe CD11c plus DC. (E-F) DC C57BL/6 tratate cu diferite concentrații de AECCD sau LPS au fost amestecate cu splenocite de la șoareci BALB/c într-un raport de 1:5 sau 1:10 într-un MLR timp de 2 zile. Proliferarea celulară a fost determinată prin test MTT. (G–H) Supernatanții de cultură ai DC au fost testați pentru IL-12 și TNF-a prin trusa ELISA. Datele sunt prezentate ca medii ± SD (n =3). *P <0,05, **p=""><0,01 și="" ***p=""><0,001 comparativ="" cu="" dc="" netratate;="" #p="">< 0,05="" comparativ="" cu="">

3.9. TLR4, un receptor pentru AECCD pe DC

DCS poate iniția semnalizarea celulară de către receptorii membranari. Laa determinarolul TLR4 în participarea la maturarea DC tratate cu AECCD, după pre-tratamentul cu inhibitorul TLR4 TAK-242, DC-urile au fost stimulate cu o concentrație dată de AECCD, iar apoi starea de activare a DC a fost examinată prin citometru în flux . Nivelurile de expresie ale citokinelor din supernatanții de cultură au fost analizate printr-un kit de analiză a fluxului multi-analiți. Supreglarea CD40, CD8{0, CD{86 și MHC-II indusă de AECCD a fost inhibată semnificativ prin blocarea căilor TLR4 (P <0,01, fig.="" 9a-d).="" mai="" mult="" decât="" atât,="" în="" comparație="" cu="" controlul="" netratat,="" blocarea="" tlr4="" cu="" tak-242="" a="" avut="" un="" efect="" de="" inhibare="" mai="" semnificativ="" asupra="" producției="" de="" ifn-,="" tnf-="" și="" il{-6="" (p="">< 0,01,="" fig.="" 9e-g)="">

Fig. 9. Activarea semnalizării TLR4 în DC tratate cu AECCD. După ce DC imature au fost tratate cu AECCD în absența sau prezența TAK-242 timp de 12 ore, maturarea fenotipică a fost examinată cu un citometru în flux și nivelurile de citokine din supernatanți au fost prin metoda CBA. (A–D) Procente de CD40, CD80, CD86 și MHCII pe CD11c plus DC. (E–G) Niveluri de IFN-, TNF- și IL-6. Datele sunt prezentate ca medii ± SD (n=3). **P < 0,01="" și=""><0.001 compared="" to="" the="" group="" with="">

3.10. Activarea DC de către AECCD prin calea NF-κB legată de TLR4-

Pentru a investiga dacă expresiile moleculelor de suprafață și citokinelor DC tratate cu AECCD au fost reglate de NF-κB după ce DC imature pretratate cu inhibitor NF-κB PDTC au fost stimulate cu AECCD timp de 12 ore, nivelurile de expresie ale moleculelor costimulatoare și citokinelor au fost măsurate prin citometru de flux. Nivelurile de CD40, CD80 CD{86 și MHC-II induse de AECCD au fost semnificativ scăzute în comparație cu controlul netratat prin blocarea căilor NF-kB cu inhibitori corespunzători (P < 0,001,="" fig.="" 10a–d).="" simultan,="" expresia="" ifn-,="" tnf-="" și="" il-6="" a="" fost,="" de="" asemenea,="" semnificativ="" inhibată="" de="" pdtc="" (p=""><0,05, fig.="">

Fig. 10. Implicarea NF-kB în activarea DC indusă de AECCD. DC au fost tratate cu AECCD în absența sau prezența PDTC timp de 24 de ore. (A–D) Procentele de CD40, CD80, CD{86 și MHCII pe CD11c plus DC au fost determinate prin citometrie în flux. (E-G) Nivelurile de IFN-, TNF- și IL-6 din supernatant au fost determinate prin metoda CBA. Datele sunt prezentate ca medii ± SD (n=3).*P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" și="" ***p="">< 0,001="" în="" comparație="" cu="" grupul="" cu="">

4. Discutie

În prezent, diferite polizaharide din TCM au fost investigate ca adjuvanți pentru vaccinurile umane și animale (Sun și colab., 2018; Rey-Ladino și colab., 2011). În acest studiu, efectele imuno-modulatoare ale AECCD și mecanismul primar de activare al DC au fost investigate in vivo și in vitro printr-o serie de experimente pentru a evalua adaptarea.imunraspunsîmpotriva OVA și starea de activare a DCS. Experimentele in vivo au indicat că AECCD a promovat în mod remarcabil producerea de izotipuri IgG și IgG specifice OVA, a sporit proliferarea splenocitelor și a indus activarea celulelor T și a citokinelor (IL-4/IFN-). În plus, AECCD a îmbunătățit maturarea DC și a prezentat o scădere a Tregs. Aceste constatări au sugerat că funcția AECCD ca adjuvant eficient a fost realizată prin promovarea maturării DC și inhibarea Tregs. Experimentele in vitro au indicat că AECCD a promovat maturarea fenotipică a DC, secțiunea citokinelor și activitatea alostimulatoare prin calea NF-κB legată de TLR4-. Aceste rezultate experimentale au indicat că AECCD avea un potențial semnificativ ca stimulator de îmbunătățire a sistemului imunitar.

Fiecare adjuvant are caracteristici imune unice împotriva diferitelor antigene, ceea ce indică faptul că adjuvanții au potențial de aplicare în diferite boli. În primul rând, proprietățile adjuvante ale administrării concomitente de AECCD cu OVA au fost testate prin determinarea efectelor acestora asupraimunraspunsla soareci. Multe studii au arătat că activitățile imunostimulatoare au fost direct proporționale cu doza într-un anumit interval (Li și colab., 2020; Reed și colab., 2020; Zhang și colab., 2017). În mod similar, în studiu, analiza anticorpilor și a izotipului a arătat că AECCD într-un anumit interval de doză a îmbunătățit răspunsurile IgG, IgG1 și IgG2a specifice OVA și că doza medie de AECCD a fost doza optimă. În experimentele ulterioare, am investigat în principal efectul stimulator al AECCD la o doză medie optimă. Doza medie de AECCD a crescut semnificativ răspunsul de proliferare a splenocitelor la șoarecii imunizați, indicând faptul că AECCD a promovat celulele celulare.imunrăspunsuriîmpotriva OVA. Aceste rezultate au sugerat că AECCD a îmbunătățit atât umoral, cât și celularimunrăspunsuri, care au fost asociate cu potențialul adjuvant.
Activitatea substanțială a celulelor T determinată poate conduce la eradicarea bolii. În timpul unuiimunraspuns, celulele T activate pot ajunge la țesuturile limfoide secundare, inclusiv splina și ganglionii limfatici (Steinman, 2012). Doza medie de AECCD a îmbunătățit eficient eficacitatea vaccinului, deoarece ar putea crește semnificativ răspunsurile celulelor T CD4, CD8, CD44 și CD62L în ganglionii limfatici de drenaj și splina. Celulele T CD8 activate au mediat eradicarea patogenului prin secretarea de IFN-. Celulele T CD4 proliferate au fost diferențiate în celule Th1 și celule Th1. Celulele Th1 au secretat citokină Th1 pentru a stimula proliferarea limfocitelor, iar celulele Th2 au secretat citokina Th2 pentru a spori producția de anticorpi (Seder și colab., 2008). În studiu, nivelurile de CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- și CD8 plus IFN- au fost crescute de AECCD la o doză medie. AECCD a indus un răspuns echilibrat Th1/Th2 și a direcționatimunraspunsprin alterarea reţelei de citokine.

Un adjuvant ar trebui să inducă o imunitate specifică și să controleze rezultatulimunraspunsprin reglementarea statutului DC în numeroase puncte (Carrera Silva et al., 2013). Expresia moleculelor de suprafață pe DC este un indicator crucial pentru evaluarea maturării DC și este corelată de obicei cu diferențierea limfocitelor T (Steinman, 2012). În acest studiu, AECCD a îmbunătățit expresia moleculelor costimulatoare și a facilitat maturarea DC atunci când a fost utilizat ca adjuvant împotriva OVA. Acesta poate fi unul dintre modalitățile prin care AECCD a promovat umoral și celularimunrăspunsuri. Între timp, AECCD a scăzut, de asemenea, frecvența CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Tregs, ceea ce a oferit o imunitate echilibrată după vaccinare. Rezultatele noastre au susținut descoperirile recente conform cărora diferite polizaharide din TCM au fost regulatorii maturării DC (Bo et al., 2019; Li et al., 2015; Zhu et al., 2016).

Activarea adaptivuluiimunrăspunsuride către adjuvanții polizaharidici este mediată în primul rând prin recunoașterea lor de către receptorii specifici ai DC (Akira, 2004). DC activate prin căile legate de TLR4-poate secreta diverși imunomodulatori ca mediatori critici împotriva infecțiilor (Akira, 2007). Prin urmare, în experimentele ulterioare, am explorat preliminar mecanismul molecular al efectului stimulator al AECCD asupra DC in vitro. Pentru a observa citotoxicitatea AECCD, a fost mai întâi determinată viabilitatea celulară a DC și a splenocitelor de la șoareci. AECCD la 10–1600 ug/mL nu a prezentat nicio citotoxicitate pentru DC și splenocite. Pentru a exclude contaminarea cu LPS, am pretratat AECCD cu PMB. Nivelurile de expresie ale CD40, CD80 CD86 și MHC-II în DC tratate cu AECCD nu au fost scăzute, dar PMB a inhibat eficient expresia moleculelor costimulatoare în DC tratate cu LPS. Acest lucru a demonstrat că AECCD nu a fost contaminat cu endotoxine. În continuare, starea de activare a DC a fost explorată în continuare. Similar cu DC tratate cu LPS, într-o manieră dependentă de doză, DC tratate cu AECCD au crescut nivelurile de CD40, CD80 CD86 și MHC II, precum și producția de citokină proinflamatoare, care a fost un parametrul maturizării funcționale a DC. Într-un MLR, capacitatea de proliferare a celulelor T alogene a fost evaluată în DC tratate cu AECCD. AECCD ar putea activa și activa celulele T alogene. DC au fost mai întâi tratate în prealabil cu mitomicină C și apoi spălate temeinic pentru a îndepărta acest reactiv, astfel încât efectele AECCD asupra DC nu erau susceptibile de a fi atribuite activității mitogene. Datele experimentale au arătat că maturarea fenotipică și activarea funcțională a DC ar putea fi atribuite stimulării de la AECCD.

Un număr de polizaharide TCM ar putea stimula maturarea DC prin intermediul TLR4. NF-kB, ca membru al căii în aval asociate TLR4-, joacă un rol important în reglarea maturării fenotipice și funcționale a DC și în inducerea expresiei diferitelor gene implicate înimunrăspunsuri(Qi și colab., 2016; Re și Strominger, 2001; Wei și colab., 2016; Zhu și colab., 2013). Prin experimente in vitro, am descoperit că AECCD a promovat maturarea DC și că TAK-242 (inhibitorul TLR4) și PDTC (inhibitorul NF-kB) au scăzut nivelurile de expresie ale CD40, CD80, CD86 și MHC. -II și nivelurile de secreție de IFN-, TNF- și IL-6 pe DC tratate cu AECCD. Aceste constatări au indicat că TLR4 și NF-kB au fost implicate în activarea DC indusă de AECCD și în secreția de citokine. Aceste rezultate au fost în concordanță cu studiile raportate anterior, deoarece AECCD ca adjuvant a îmbunătățit țintirea antigenului asupra DC.

În rezumat, rezultatele noastre au arătat că AECCD a indus răspunsuri durabile și Th1/Th2, în special mediate de celule Timunraspunsîmpotriva OVA. AECCD a activat DC prin calea NF-κB mediată de TLR4-, sporind astfel producția de imunomodulatori și proliferarea celulelor T alogene. AECCD poate fi utilizat ca adjuvant eficient în dezvoltarea vaccinului. Cu toate acestea, va fi efectuată o analiză precisă a componentelor pentru a determina care componentă din DC activate AECCD. Cu accent pe mecanismele cu privire la modul în care AECCD sporește imunogenitatea, inclusiv optimizarea formulărilor adjuvante și a căii de administrare a vaccinului, vom explora în continuare componentele imunomodulatoare și proprietățile adjuvante specifice ale AECCD în scopul de a proiecta adjuvanți vaccinali eficienți împotriva bolilor infecțioase.

Cistanche beneficii deserticolapromovează oimunraspuns

Contribuții ale autorului

Achiziția, analiza și interpretarea datelor: Shuangshuang Feng, Xiumei Yang, Xiang Weng. Scrierea proiectului original: Shuangshuang Feng, Xiang Weng.

Achizitie de finantare:Ailian Zhang.

Ancheta:Ailian Zhang.

Metodologie:Ailian Zhang, Bin Wang.

Supraveghere:Ailian Zhang.

Declarație de interese concurente

Autorii nu au niciun conflict de interese legate de acest studiu.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională de Științe Naturale din China [numerele de grant 31960164 și 31660259] Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare, pregătire sau manuscris.

Autorii le mulțumesc prof. Xingguo Zheng și Jiang He (Urumqi, China) pentru că au furnizat cu amabilitate materiale și identificare.

Referințe

Akira, S., 2004. Toll receptor families: structure and function. Semin. Imunol. 16, 1–2.

Akira, KS, 2007. Semnalizarea la NF-kB de către receptorii de tip toll. Trends Mol. Med. 18, 156–163.

Banchereau, J., Steinman, RM, 1998. Celulele dendritice și controlul imunității. Natura 392, 245–252.
Bo, R., Liu, Z., Zhang, J., Gu, P., Ou, N., Sun, Y., Hu, Y., Liu, J., Wang, D., 2019. mecanismul Lycium barbarum polizaharide lipozomi pe activarea celulelor dendritice murine. Glucide. Polim. 205, 540–549.
Cao, P., Wu, S., Wu, T., Deng, Y., Zhang, Q., Wang, K., Zhang, Y., 2020. Rolul important al polizaharidelor dintr-o medicină tradițională chineză - Curățarea plămânilor și Decoctul detoxifiant împotriva pandemiei de COVID-19. Glucide. Polim. 240,m116346
Carrera Silva, EA, Chan, PY, Joannas, L., Errasti, AE, Gagliani, N., Bosurgi, L., Jabbour, M., Perry, A., Smith-Chakmakova, F., Mucida, D., Cheroutre, H., BurstynCohen, T., Leighton, JA, Lemke, G., Ghosh, S., Rothlin, CV, 2013. Derivate de celule T
proteina S angajează semnalizarea receptorului TAM în celulele dendritice pentru a controla magnitudineaimunraspuns. Imunitatea 39, 160–170.
Comisia pentru Farmacopeea Chineză, 1992. Ministerul chinez al Sănătății Medicamentul standard al medicamentelor din China, volumul unu. Presa Comisiei pentru Farmacopeea Chineză, Beijing, p. 1.

Dong, Q., Yao, J., Fang, J., Ding, K., 2007. Caracterizarea structurală și activitatea imunologică a două polizaharide extractibile cu apă rece dinCistanchedeserticolaYC Ma. Glucide. Res. 342 (10), 1343–1349.
Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, JK, Rebers, PA, Smith, F., 1951. O metodă colorimetrică pentru determinarea zaharurilor. Natura 168, 167.
Fu, Z., Fan, X., Wang, X., Gao, X., 2018.cistanciHerba: o privire de ansamblu asupra proprietăților sale chimice, farmacocinetice și farmacocinetice. J. Etnofarmacol. 219, 233–247.
Giuseppe, DG, Rino, R., Didierlaurent, AM, 2018. Corelate of adjuvanticity: a review on adjuvants in licensed vaccines. Semin. Imunol. 39, 14–21.
Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., Ikehara, S., Muramatsu, S., Steinman, RM, 1992. Generarea unui număr mare de celule dendritice de la șoarece culturi de măduvă osoasă suplimentate cu factor de stimulare a coloniilor de granulocite/macrofage. J. Exp. Med. 176, 1693–1702.
Li, P., Wang, F., 2015. Polizaharide: candidați ai adjuvanților promițători de vaccin. Drug Discov Ther 9, 88–93.
Li, X., Zhao, R., Li, H., De, Z., Wu, H., 2012. Deproteinizarea polizaharidelor din stigma maydis prin metoda Sevag. Adv. Mater. Res. 340, 416–420.
Li, J., Li, J., Zhang, F., 2015. Efectele imunoregulatoare ale medicinei chineze pe bază de plante asupra maturării și funcției celulelor dendritice. J. Etnofarmacol. 171, 184–195.
Li, T., Zhang, L., Jin, C., Xiong, Y., Cheng, YY, Chen, K., 2020. Extractul de flori de rodie reglează bidirecțional proliferarea, diferențierea și apoptoza 3T3- Celulele L1 prin reglarea expresiei PPAR mediată de calea de semnalizare PI3K-AKT. Biomed. Pharmacother. 131, 110769.
Morrison, DC, Jacobs, DM, 1976. Legarea polimixinei B la porțiunea lipidă A a lipopolizaharidelor bacteriene. Imunochimie 13, 813–818.
Park, MJ, Ryu, HS, Kim, JS, Lee, HK, Kang, JS, Yun, J., Kim, SY, Lee, MK, Hong, JT, Kim, Y., 2014. Polizaharida Platycodon grandiflorum induce celulele dendritice maturare prin semnalizare TLR4. Food Chim. Toxicol. 72, 212–220.
Qi, C., Guo, Y., Zhou, W., Zhang, Y., 2016. Polizaharide imunostimulatoare legate de receptor 4-toll-like: structura primară, relații de activitate și posibile modele de interacțiune. Glucide. Polim. 149, 186–206.
Re, F., Strominger, JL, 2001. Receptorul Toll-like 2 (TLR2) și TLR4 activează diferențial celulele dendritice umane. J. Biol. Chim. 276, 37692–37699.
Reed, SG, Orr, MT, Fox, CB, 2013. Rolurile cheie ale adjuvanților în vaccinurile moderne. Nat. Med. 19, 1597–1608.
Reed, SG, Tomai, M., Gale, MJ, 2020. Noi orizonturi în adjuvanți pentru dezvoltarea vaccinului. Curr. Opinează. Imunol. 65, 97–101.
Rey-Ladino, J., Ross, AG, Cripps, AW, Mcmanus, DP, Quinn, R., 2011. Produse naturale și căutarea de noi adjuvanți de vaccin. Vaccin 29, 6464–6471.
Schijns, V., Fernandez ´ Ejada, A., Barjaktarovi, A., Bouzalas, I., Lavelle, EC, 2020. Modulation ofimunrăspunsurifolosind adjuvanți pentru a facilita vaccinarea terapeutică. Imunol. Apoc. 296, 169–190.
Seder, RA, Darrah, PA, Roederer, M., 2008. Calitatea celulelor T în memorie și protecție: implicații pentru proiectarea vaccinului. Nat. Rev. Immunol. 8, 247–258.
Steinman, RM, 2012. Decizii despre celulele dendritice: trecut, prezent și viitor. Annu. Rev. Immunol. 30, 1–22.
Sun, B., Yu, S., Zhao, D., Guo, S., W, X., Zhao, K., 2018. Polizaharide ca adjuvanți de vaccin. Vaccin 36, 5226–5234.
Tian, ​​H., Liu, Z., Pu, Y., Bao, Y., 2019. Efecte imunomodulatoare exercitate de polizaharidele Poria Coco prin semnalizarea TLR4/TRAF6/NF-kB in vitro și in vivo. Biomed. Pharmacother. 112, 108709.
Wei, W., Xiao, HT, Bao, WR, Ma, DL, Leung, CH, 2016. TLR-4 poate media căile de semnalizare ale expresiei citokinei induse de polizaharidele Astragalus RAP a celulelor RAW264.7. J. Etnofarmacol. 179, 243–252.
Zhang, A., Yang, Y., Wang, Y., Zhao, G., Yang, X., Wang, D., Wang, B., 2017. Extractele apoase adjuvantactive din Artemisia rupestris L. îmbunătățescimunrăspunsuriprin calea de semnalizare TLR4. Vaccin 35, 1037–1045
Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B., Wu, DC, 2018. Activitatea imunostimulatoare a polizaharidelor extractibile în apă dinCistanchedeserticolaca adjuvant vegetal in vitro si in vivo. PloS One 13, e0191356.
Zhao, B., Lian, J., Wang, D., Li, Q., Zhang, A., 2019. Evaluarea extractelor apoase deCistanchedeserticolaeste un adjuvant polizaharidic pentru vaccinul antigripal sezonier la șoarecii adulți tineri. Imunol. Lett. 213, 1–8.
Zhou, L., Liu, Z., Wang, Z., Yu, S., Long, T., Zhou, X., Bao, Y., 2017. Polizaharidele de astragalus exercită efecte imunomodulatoare prin TLR4-mediate Căile de semnalizare dependente de MyD88-in vitro și in vivo. Sci Rep-UK 7, 44822.
Zhu, J., Zhang, Y., Shen, Y., Zhou, H., Yu, X., 2013. Polizaharidele de Lycium barbarum induc receptorul Toll-like 2- și 4-mediat fenotipic și funcțional maturarea celulelor dendritice murine prin activarea NF-kB. Mol. Med. Rep. 8, 1216–1220.
Zhu, N., Lv, X., Wang, Y., Li, J., Liu, Y., Lu, W., Yang, L., Zhao, J., Wang, F., Zhang, LW, 2016 Comparația efectelor imunoreglatoare ale polizaharidelor din trei plante medicinale naturale și a absorbției celulare în celulele dendritice. Int. J. Biol. Macromol. 93, 940–951.