Capitolul 1: Factorul asemănător Krϋppel 15 suprimă proliferarea celulelor glomerulare mezangiale renale prin îmbunătățirea conjugării P53 SUMO1

Pentru mai multe informatii. a lua legaturatina.xiang@wecistanche.com

Abstract

Celula mezangiala (MC)proliferareeste o caracteristică patologică cheie la o serie de oameni obișnuițiboli renale, inclusiv nefrita proliferativă mezangială și nefropatiile diabetice. Cunoașterea răspunsurilor MC la stimulii patologici este crucială pentru înțelegerea acestor procese bolii. Am stabilit anterior că factorul asemănător Krüppel 15 (KLF15), un factor de transcripție cu degete de zinc îmbogățit cu rinichi, a fost necesar pentru inhibarea proliferării MC. În studiul de față, am investigat gena țintă directă și mecanismul de bază prin care KLF15 a reglementat proliferarea mezangială. În primul rând, am analizat modificatorul 1 legat de ubiquitină mic (SUMO1) ca țintă transcripțională directă a KLF15 și am validat această constatare cu testele ChlP-PCR și luciferazei. În plus, am demonstrat că supraexprimarea KLF15 sau SUMO1 a îmbunătățit stabilitatea P53, care a blocat ciclul celular al MC-urilor renale umane (HRMC) și, prin urmare, a abolit proliferarea celulară. În schimb, distrugerea SUMO1 în HRMC, chiar și cele supraexprimate cu KLF15, nu ar putea inhiba ratele de proliferare a HRMC și nu a putut crește SUMOilarea P53. În cele din urmă, rezultatele au arătat că nivelurile de SUMOilat P53 în cortexele renale ale șobolanilor model anti-Thy 1 au fost scăzute în timpul perioadelor de proliferare. Aceste descoperiri dezvăluie mecanismul critic prin care KLF15 vizează SUMO1 pentru a media proliferarea MC.

CUVINTE CHEIE: KLF15, proliferarea celulelor mezangiale, P53, SUMO1

Faceți clic aici pentru a afla beneficiilecistanchesi de unde poti cumpara cistanche tubulosa

1| INTRODUCERE

Celulele mezangiale (MC) reprezintă aproximativ o treime din populația de celule din glomerul. Aceștia joacă un rol important în homeostazie prin menținerea arhitecturii structurale a glomerulului, producerea și menținerea matricei mezangiale, reglarea suprafeței de filtrare și fagocitarea celulelor apoptotice sau a complexelor imune.1 În multe boli glomerulare, cum ar fi nefrita proliferativă mezangială și nefropatiile diabetice. , MC-urile sunt rănite și suferă o schimbare majoră a fenotipului, ducând la proliferarea necontrolată mezangială și depunerea excesivă a matricei mezangiale.2-4 Pe lângă hiperproliferarea și creșterea producției lor de proteine ​​din matricea extracelulară (ECM) și metaloproteinaze ale matricei, MC-urile pot eliberează factori inflamatori, ducând la scleroză glomerulară și fibroză interstițială; agravează și mai mult afectarea renală și provoacă progresia către boală renală ireversibilă în stadiu terminal.5-Cunoașterea răspunsului MC la stimuli patologici este crucială pentru dezvoltarea de tratamente care să reducă leziunile renale cauzate de proliferarea anormală a MC și să întârzie progresia. în boală renală în stadiu terminal.

Factorii de tip Krüppel (KLF) sunt un grup de factori de transcripție care leagă ADN-ul cu degete de zinc. Dovezile tot mai mari indică faptul că această familie este implicată într-o varietate de procese celulare, cum ar fi diferențierea celulelor, remodelarea cardiacă, hematopoieza și determinarea destinului celulelor stem.8-10 Familia KLF este formată din optsprezece membri, printre care KLF15 este larg distribuit înrinichi, pancreas, inima,ficat, și mușchii scheletici. Studiile anterioare au demonstrat că KLF15 este un regulator transcripțional cheie în diverse procese fiziologice, inclusiv gluconeogeneza,răspunsuri imune, și diferențierea adipocitelor.1-14 Studiul nostru anterior a demonstrat că KLF15 este necesar pentru inhibarea proliferării MC.15 Acest studiu și-a propus să clarifice gena țintă directă și mecanismul din aval prin care KLF15 reglează proliferarea mezangială.

2|MATERIALE ȘI METODE

2.1 |Model de nefrită anti-Thy1

Șobolanii masculi Wistar (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) cu o greutate între 200 și 220 g au fost alocați aleatoriu grupurilor de control și anti-Thy1. Toți șobolanii au fost găzduiți într-o unitate de îngrijire a animalelor sub un ciclu de lumină/întuneric de 12/12 ore, cu acces liber la hrană și apă. Evaluările și intervențiile legate de bunăstare au fost efectuate pe tot parcursul experimentului. În total, 28 de șobolani au fost injectați cu un anticorp monoclonal anti-Thy1 de șoarece, așa cum s-a descris anterior,16 și șapte au fost injectați cu ser fiziologic (martori). Glomerulii au fost purificați din țesutul cortexului renal folosind o metodă de cernere. Serurile au fost colectate pentru măsurarea nivelurilor de azot ureic și creatininei serice. Șobolanii model anti-Thy1 au fost uciși în zilele O, 3, 5, 7 și 10, iar glomerulii lor au fost recoltați. Toate procedurile experimentale și de bunăstare a animalelor au fost efectuate în strictă conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (Consiliul Național de Cercetare al SUA, 1996).

2.2|Cultură și tratament de MC renală umană (HRMC).

HRMC renale primare au fost achiziționate de la ScienCell (San Diego, CA). HRMC de la al treilea până la al șaselea pasaj au fost menținute în MC Medium (MsCM; ScienCell) conform instrucțiunilor producătorului. Pentru experimente, celulele au fost crescute până la confluență, creșterea oprită în ser redus (0,5% FBS) timp de 24 de ore și împărțite în diferite grupuri experimentale.

Pentru tratamentul cu diferite concentrații de glucoză, celulele au fost incubate în MsCM care conține fie 5 mmol/L glucoză (glucoză normală), fie 30 mmol/L glucoză (glucoză ridicată, HG) timp de 48 de ore la 37 grade C. Celulele incubate în condiții experimentale identice. condițiile cu 5 mmol/L glucoză și 25 mmol/L manitol în loc de 30 mmol/L glucoză au fost utilizate ca controale osmotice. Pentru tratamentul cu PDGF-BB, celulele au fost incubate în MsCM care conține 20ng/ml PDGF-BB (R&D Systems, Minneapolis, MN) timp de 48 de ore la 37 grade C.

2.3|Imunohistochimie (IHC)

Țesutul renal încorporat în parafină a fost secționat la o grosime de 4 μm, iar secțiunile au fost colorate pentru IHC. Feliile au fost incubate cu 3% H, O, pentru a bloca peroxidaza endogenă după deparafinizare. După extragerea și blocarea antigenului, feliile au fost incubate cu anticorpi anti-KLF15 (ab81604, Abcam), modificatorul 1 anti-mică ubiquitină (SUMO1, ab32058, Abcam) și anti-PCNA (ab92552, Abcam) la 4 grade C Feliile au fost apoi incubate cu un anticorp secundar marcat cu peroxidază de hrean la 37 de grade timp de 30 de minute, iar reacția imunohistochimică a fost observată conform instrucțiunilor producătorului cu 3,3’-diaminobenzidină (DAB, ORIGINE, CN) ca agent cromogen. . Ulterior, diapozitivele au fost contracolorate cu hematoxilin-eozină și fotografiate cu un microscop cu lumină (Olympus). Colorația imunohistochimică a fost evaluată cu software-ul Image J în funcție de valoarea medie a densității optice (AOD).

2.4 |Imunoprecipitarea cromatinei (ChlP) cu secvențiere paralelă (ChIP-Seq)

ChIP a fost realizat utilizând un kit IP Simple ChlP Plus Enzymatic Chromatin (Magnetic Beads; Cell Signaling Technology) conform protocolului producătorului. Pe scurt, HRMC-urile au fost supraexprimate fie cu KLF15, fie amestecate la o densitate celulară de 2,0×1{0³celule/mL și reticulate cu 1,7% formaldehidă în PBS timp de 5 minute la temperatura camerei (RT). ). Celulele reticulate au fost lizate pentru a obține fracția nucleară, care a fost supusă cu ultrasunete în tampon ChIP 1 x. Lizatele au fost clarificate prin centrifugare la 9300xg timp de 10 minute la 4 grade. Probele de cromatina au fost incubate fie cu un anticorp anti-KLF15 (ab81604, Abcam) fie cu un anticorp anti-lgG (control de fundal) peste noapte la 4 grade. Complexele legate de anticorpi au fost capturate prin incubare cu margele magnetice de proteină G. Bibliotecile ChlP-Seq pentru secvențiere au fost preparate folosind un TruSeq ChlP Sample Prep Kit (Illumina). Bibliotecile au fost supuse unei secvențieri paralele cu un secvențior HiSeq2500 (Illumina) utilizând protocolul de lungime de secvențiere cu un singur capăt de 50 bp. Datele brute de secvențiere de generație următoare (NGS) au fost convertite în fișiere FASTQ folosind software-ul CASAVA (versiunea 1.8.2), iar fiecare set de date a fost aliniat la genomul de referință uman (UCSC hg19) folosind Burrows-Wheeler Aligner (versiunea 0.7.12). ).17 Apelarea de vârf ChIP-Seq a fost efectuată utilizând programul MACS2 (versiunea 2.0.1) cu parametrii impliciti, dar o valoare aq de 0,05, cu datele de intrare pentru scădere.18 Compararea vârfului cu controlul amestecat (celulele parentale) și probele de supraexpresie au fost efectuate cu Diffbind, un pachet R, folosind algoritmul DeSeq2, iar o rată de descoperire falsă de 0,1 a fost considerată pentru a indica semnificație.1 Superenhancers au fost identificați din setul de vârfuri detectate în HRMC tratate cu DMSO cu super-enhancer. software ROSE.2 grade Picurile ChIP-Seq au fost adnotate cu pachetul R ChlPpeakAnno, iar promotorii au fost definiți ca regiuni îmbogățite cu KLF15-în 1 kb de la locul de începere a transcripției.21 Gena cu site-ul de începere a transcripției cel mai apropiat de c intrarea fiecărui super-amplificator a fost definită ca gena țintă a acelui super-amplificator.

2.5|PCR în timp real cantitativ cu chip (ChlP-PCR)

Procedura ChlP-PCR a fost similară cu procedura descrisă mai sus. ADN-ul ChIP din celulele tratate cu anticorpi anti-KLF15 a fost utilizat pentru a detecta asocierea dintre KLF15 și SUMO1. ADN-ul din celulele tratate cu anticorpi anti-lgG a servit drept control. ADN-ul purificat a fost utilizat pentru analiza regiunii promotorului proximal SUMO1 prin PCR în timp real pe un ABI PRISM 7600 utilizând SYBR GreenER qPCR Supermix. Primerii SUMO1 au fost după cum urmează: înainte: 5'-AGCAGCGGTCTTTAGCATCA-3';revers:5'-TCGGTTAACCAGCACCCTTG-3'. Amplificarea relativă a secvenței promotorului a genei a fost calculată utilizând {{18 }}Metoda AcT și normalizarea a fost efectuată împotriva unei diluții de 1:100 a ADN-ului de intrare.

2.6|Etichetarea celulelor și etichetarea izotopilor stabili de către aminoacizi în cultura celulară (SILAC)

Celulele la o confluență de 15 procente au fost însămânțate în mediul complet adecvat (pentru HRMC: MsCM). Procedurile de etichetare și SILAC au fost descrise în cercetările anterioare.22 Pe scurt, după ce au fost etichetate cu lizină ușoară (marcată cu 13C) sau grea (marcată cu 15N) și cu lizină ușoară (marcată cu 1c) sau grea (marcată cu 15N). arginină, celulele au fost transfectate cu o plasmidă de supraexpresie KLF15 sau o plasmidă de control. După tratament, celulele au fost tripsinizate și numărate pentru a obține un pelet de celule de 2 x 10'celule/condiție, iar celulele au fost supuse analizei SILAC utilizând spectrometrie de masă. Peletele de celule grele și ușoare au fost lizate în tampon de radioimunoprecipitare dozat cu inhibitori de protează și fosfatază folosind explozii scurte de sonicare de 15-secunde. Lizatele au fost centrifugate la 14,000 rpm timp de 20 minute. După centrifugare, supernatanții au fost colectați și concentrația de proteine ​​a fost măsurată folosind un analizor de aminoacizi Hitachi L-8900. Din probe au fost preparate alicote de 200 ug de proteină, combinate și precipitate folosind o metodă de precipitare cu metanol-cloroform. Peletele de proteine ​​au fost resuspendate în tampon de bicarbonat de amoniu 8 mol/L uree/0,4 mol/L, reduse cu 45 mmol/L DTT timp de 30 minute la 37 grade C, alchilate cu 100 mmol/L iodoacetamidă timp de 30 de minute la întuneric la RT și digerat cu protează Lys-C (1:20 g/g) peste noapte (~16 ore) la 37 de grade. Digerarea Lys-C a fost diluată în continuare și digerată cu tripsină (1:20 g/g) timp de 8 ore la 37 de grade. Digeratul a fost desarat cu o coloană MacroSpin (The Nest Group, Inc) și uscat într-un concentrator SpeedVac. Peptidele desarate au fost apoi îmbogățite cu fosfopeptide folosind rășină de dioxid de titan încorporată în vârfuri de 10 μL (Glygen Corp). Fluxurile au fost rezervate, iar peptidele îmbogățite au fost eluate folosind un raport 1:33 de hidroxid de amoniu față de apă. Fracțiile de curgere și de eluție uscate cu SpeedVac au fost resuspendate în tampon A (0,1 procente de acid formicat în apă) și supuse analizei cromatografiei lichide-spectrometrie de masă în tandem (LC/MS).

2.7| Testul cu dublă luciferază reporter

Promotorul SUMO1(NM_001005781) uman de tip sălbatic cu 1604bp (-1474nt- plus 129nt) inclusiv site-ul potențial de legare (-205nt{--199nt) a fost obținut utilizând PCR amplificați și subclonat într-un vector pGL3-de bază (Cat. # E1751 Promega) cu situsuri de enzime de restricție SacI și Bgl ll, denumit pGL3-WT-SU. De asemenea, situsul de legare-CACCCA-în cadrul promotorului SUMO1 a fost mutat în -CGTTTG-, numit pGL3-MT-SU. Plasmida (pReceiver-M94) a conținut ADNc uman KLF15 de lungime întreagă a fost obținut de la GeneCopoeia. Plasmida de supraexpresie KLF15 și pGL3-WT-SU sau pGL3-MT-SU au fost transfectate în celule HEK293T cu reactiv Lipofectamine 2000. Probele au fost apoi cotransfectate cu o plasmidă pRL-TK (Cat #E2241, Promega) care exprimă Renilla luciferaza. După 24 de ore de transfecție, celulele au fost lizate. Nivelurile de activitate a luciferazei Firefly și Renilla au fost examinate utilizând un sistem de testare cu dublu-luciferază reporter (Biotek).

2.8 |Pregătirea ARN, sinteza cADN și analiza RT-qPCR

ARN-ul total a fost extras folosind TRlzol (Invitrogen) și purificat folosind un kit RNeasy Mini (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului. ADNc a fost generat utilizând un kit de sinteză a ADNc de primă catenă ProtoScript (New England Biolabs. PCR cantitativ a fost efectuat utilizând Power SYBR Green Master Mix (Life Technologies). Secvențele de oligonucleotide utilizate pentru RT-qPCR sunt prezentate în Tabelul 1.

2.9 |Testul de proliferare celulară

ADNc SUMO1 uman de lungime întreagă (NM_003352.8) obținut de la OriGene Technologies (Beijing, China) a fost inserat în plasmida pCMV6-Entry (CAT#: RC2{00633). Proliferarea celulară a fost analizată cu un kit de imagistică Click-iT⑧ Plus EdU Alexa Fluor⑧555 (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, celulele au fost incubate într-o placă de cultură 6-godeuri și transfectate cu o plasmidă de control KLF15 (Scramble, grupul VECTOR), o plasmidă de supraexpresie KLF15 (aceeași mai sus, grupul KLF15), un vector de expresie pentru SUMO1 (grupul VECTOR), o plasmidă de supraexpresie SUMO1 (grupul SUMO1), ARNsi de control negativ (grupul SI CON), ARNsi SUMO1 (grupul SI SUMO1), o plasmidă de supraexpresie KLF15 cu ARNsi SUMO1 (grupul KLF15 plus SI SUMO1) sau o plasmidă de supraexpresie KLF15 cu siARN de control negativ (grupul KLF15 plus SICON) timp de 24 de ore. Apoi, mediul a fost înlocuit cu un mediu suplimentat cu 20 ng/mL PDGF-BB timp de 48 de ore și a fost adăugată o concentrație EdU optimizată de 10 μmol/L cu aproximativ 12 ore înainte de stimularea PDGF-BB. După tratament, celulele au fost fixate cu 4% formaldehidă, permeabilizate cu 0,5% Triton X-100, spălate cu 3% BSA în PBS, incubate cu cocktail de reacție Click-iT⑧ timp de 30 de minute la RT și incubate cu Tampon cu acțiune DAPIre timp de 10 minute la temperatura camerei în timp ce este protejat de lumină. Celulele au fost observate prin microscopie cu fluorescență (Olympus, Tokyo, Japonia). Nucleii celulelor în proliferare au fost apoi colorați cu roșu.

2.10|Analiza Western blot și imunoprecipitare (IP)

Celulele au fost lizate utilizând tampon RIPA (Thermo Scientific), iar proteina totală din supernatanți a fost cuantificată folosind un kit de analiză a proteinei BCA (Thermo Scientific). Analiza Western blot și IP au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. 23.24 Anticorpul anti-KLF15 (AV32587, Merk), anticorpul anti-SUMO1 (S8070, Merk) și anti- -actină (A5316, Sigma) au fost utilizați pentru analiza Western blot. Anticorpul anti-P53 (P5813, Merk) a fost utilizat pentru analiza IP.

2.11 |Analiză bioinformatică

Candidații de la ChIP-Seq sau SILAC au arătat o îmbogățire de cel puțin două ori față de controale. Analiza ontologiei genelor (GO) a fost efectuată cu baza de date pentru adnotare, vizualizare și descoperire integrată (DAVID; versiunea 6.7). Valorile P au fost ajustate pentru testarea ipotezelor multiple folosind metoda Benjamini-Hochberg. Categoriile semnificativ îmbogățite în subontologia funcției și căile KEGG cu o valoare P ajustată<.05 were="" chosen.="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa)="" of="" 52="" intersecting="" genes="" or="" proteins="" between="" chlp-seq="" and="" silac="" was="" performed="" on="" the="" qiagen="" ipa="" platform(https://digitalinsights.qiagen.com/),="" and="" the="" motifs="" in="" the="" target="" genes="" were="" analyzed="" using="" meme="" suite="" 5.3.0.="">

2.12|Analiză statistică

Toate experimentele au fost efectuate în trei exemplare, iar rezultatele sunt exprimate ca medii ± SE. Toate datele au fost analizate utilizând software-ul SPSS (ver.20.0; SPSS Inc) și comparate folosind testul t Student sau ANOVA unidirecțional. O valoare P<.05 was="" considered="" to="" reflect="" statistical="">