Polizaharida Cistanche Deserticola inhibă pierderea osoasă indusă de OVX la șoareci și osteoclastogeneza indusă de RANKL

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

ABSTRACT

Osteoporoza este o boală osoasă gravă care afectează populația în vârstă. Cistanche deserticola (CD), un aliment tonic și medicinal folosit pe scară largă în China, s-a dovedit că oferă un tratament eficient pentru osteoporoză. Polizaharida Cistanche deserticola (CDP), extrasă din CD, posedă diverse proprietăți farmacologice, dar rolul său înosteoclasticeformarea și funcția, precum și osteoporoza, rămân necunoscute. Scopul acestui studiu a fost de a extrage și purifica CDP pentru a explora în continuare mecanismul său potențial de acțiune asupra osteoporozei. Rezultatele au arătat că tratamentul CDP a prevenit osteoporoza indusă de OVX și a ameliorat pierderea osoasă prin reprimarea activității și funcției osteoclastelor. În plus, tratamentul cu CDP a inhibat semnificativ osteoclastogeneza indusă de RANKL, resorbția osoasă și expresia genei specifice osteoclastelor. Din punct de vedere mecanic, CDP a inhibat activarea căilor de semnalizare a NF-κB și MAPK-uri induse de RANKL și, în consecință, a afectat activarea NFATc1 în aval. Descoperirile acestui studiu sugerează că CDP este un medicament potențial sigur pentru tratarea osteoporozei. (10 beneficii pe care le poate oferi Cistanche)

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Introducere

Osteoporoza – o boală caracterizată prin scăderea masei osoase, microstructură anormală a țesutului osos, fragilitate osoasă crescută și fractură (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli și Ginaldi, 2006) – afectează în prezent peste 200 de milioane de oameni din întreaga lume și prezintă un impact medical și medical substanțial. povara socioeconomică asupra societății moderne (Strom și colab., 2011). Tratamentul clinic al osteoporozei se concentrează în principal pe înlocuirea hormonală,bifosfonatsau terapia cu denosumab. Aceste metode sunt eficiente, dar prezintă efecte secundare pe termen lung, cum ar fi riscul potențial de cancer de sân și fracturi atipice de femur (Black, Bauer, Schwartz, Cummings și Rosen, 2012; Rachner, Khosla și Hof Bauer, 2011). Prin urmare, există o nevoie urgentă de a explora medicamente care nu numai că pot inhiba osteoporoza, ci și pot avea mai puține efecte secundare nedorite. Cistanche deserticola (CD), un aliment tonic și medicinal utilizat pe scară largă în China, cunoscut sub numele de „ginseng de deșert”, este tulpina suculentă uscată cu frunze de solzi a C. deserticola YC Ma (Gu, Yang și Huang, 2016) și are diverse și activități farmacologice eficiente, cum ar fi reglarea imunității,antioxidare, și proprietăți anti-osteoporoză (Hu și colab., 2020; Li și colab., 2012; Zhang și colab., 2014). Studiile anterioare privind substanțele active ale CD în tratamentul osteoporozei s-au concentrat în principal pe glicozidele feniletanoide (Li, Jiang și Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao și Ma, 2017). Cu toate acestea, CD-ul conține și alte componente eficiente, cum ar fi iridoizi, lignani, polizaharide (Wang, Zhang și Xie, 2012). Aplicația clinică a medicinei tradiționale chineze (MTC) este în principal decoctarea apei. Polizaharidele sunt componente solubile în apă și cel mai probabil să fie principalele componente farmacodinamice ale MTC. Polizaharidele extrase din TCM au fost raportate în mod sălbatic a avea un efect anti-osteoporoză și câteva efecte secundare nedorite, care au fost în general utilizate în clinici (de exemplu, polizaharidele extrase dinEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai și Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang și Yan, 2018) și Morinda officinalis (Yan și colab., 2019)). Prin urmare, am emis ipoteza căpolizaharidă Cistanche deserticola(CDP) extras din CD poate fi un medicament potențial sigur pentru tratamentul osteoporozei. De obicei, resorbția și formarea osoasă mențin un echilibru dinamic în timpul remodelării osoase în coordonare cu mai multe tipuri de celule, inclusiv osteoclaste,osteoblaste, celulele de căptușeală osoasă și osteocite (Kular, Tickner, Chim și Xu, 2012). O întrerupere a acestui echilibru poate duce la o varietate de boli metabolice osoase, cum ar fi osteoporoza (Zhu și colab., 2018) și osteoscleroza (Ihde și colab., 2011). Osteoclastele, ca celule diferențiate la capăt derivate din linia mononucleară/macrofage, sunt singurele celule cu funcție de resorbție osoasă (Teitelbaum, 20{{106}}0). Există două citokine cheie care participă la diferențierea și maturarea osteoclastelor (Koga și colab., 2004): factorul de stimulare a coloniilor de macrofage (M-CSF) și ligandul activator al receptorului factorului nuclear κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF mediază diferențierea celulelor stem hematopoietice în progenitori de osteoclaste și promovează diferențierea osteoclastelor prin reglarea în creștere a expresiei receptorului RANK (Takayanagi, 2007). Legarea lui RANKL şi RANK pe suprafaţa celulei osteoclaste are ca rezultat următoarele: (1) recrutarea de molecule adaptoare de semnalizare, cum ar fi factorul 6 asociat receptorului TNF (TRAF6); (2) activarea țintelor multiple din aval, inclusiv NF-kB și protein kinazele activate de mitogen (MAPK); și (3) reglarea în creștere a nivelurilor de expresie a factorului nuclear al celulelor T activate, citoplasmatic 1 (NFATc1) (Liu și colab., 2019; Yamashita și colab., 2007). Activarea acestor căi de semnalizare reglează direct expresia genelor osteoclaste, inclusiv fosfataza acidă 5 (Acp5) [codând fosfataza acidă rezistentă la tartrat (TRAcP)], metaloproteinaza matriceală 9 (MMP9) și catepsina K (CTSK) (Boyle, Simonet). , & Lacey, 2003). Prin urmare, inhibarea căilor de semnalizare legate de diferențierea osteoclastelor induse de RANKL este o metodă terapeutică potențială pentru osteoporoză. În acest studiu, ne-am propus să determinăm efectele tratamentului CDP asupra modelului de șoarece cu osteoporoză indusă de ovariectomizare (OVX) in vivo și asupra activității osteoclastelor induse de RANKL in vitro, cu accent pe expresia genelor specifice osteoclastelor și pe activare. ale NFATc1 și căile de semnalizare NF-kB și MAPK. Descoperirile noastre pot oferi noi perspective asupra potențialului CDP ca medicament sigur și eficient pentru tratarea osteoporozei. 2. Materiale și metode 2.1. CD-ul cu produse chimice și colectarea probelor (nr. 180801) a fost achiziționat de la Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, China) și identificat de profesorul Haibo Huang de la Școala de Științe Farmaceutice, Universitatea de Medicină Chineză din Guangzhou, Guangzhou, China . Tabletele de valerat de estradiol au fost achiziționate de la Bayer (Leverkusen, Renania de Nord-Westfalia, Germania). Mediu esențial minim modificat alfa (-MEM) și ser fetal bovin (FBS) au fost obținute de la Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Penicilina/streptomicina și trusa de colorare TRAcP au fost achiziționate de la Solarbio (Beijing, China). M-CSF de șoarece recombinant și RANKL de șoarece recombinant au fost procurate de la R&D Systems (Minneapolis, MN, SUA). Plăcile acoperite cu hidroxiapatită au fost achiziționate de la Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, SUA). Anticorpii primari pentru NFATc1 și CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA); IkB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK şi P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, SUA); şi -actină (CWBIO, Beijing, China) a fost, de asemenea, obţinută. Ceilalți reactivi utilizați în acest studiu au fost de calitate analitică, iar apa a fost purificată prin sistemul de purificare a apei Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, SUA). 2.2. Extracția CDP CD-ul a fost măcinat până la o pulbere fină și amestecat cu eter de petrol de trei ori pentru a-l învinge. Reziduul solid a fost colectat prin filtrare şi apoi uscat la temperatura camerei. Polizaharidele au fost extrase din probele pretratate de trei ori cu apă timp de 2 ore, concentrate, precipitate prin adăugarea de etanol anhidru la o concentrație finală de 80% (v/v) și depozitate la 4°C timp de 24 ore. Precipitatele au fost colectate prin centrifugare la 3000 rpm timp de 20 de minute, dizolvate în apă distilată și purificate (îndepărtarea proteinelor libere) folosind metoda Sevag (Zhao et al., 2019). Polizaharidele recuperate au fost dializate, uscate și depozitate până la utilizare ulterioară. În plus, rezultatele compoziției chimice au arătat că conținutul total de zahăr, acid uronic, sulfat și proteine ​​din CDP a fost de 67,63 ± 0,98 la sută, 21,05 ± 0,49 la sută, 1,90 ± 0,24 la sută și 8,81 ± 0,36 la sută. Compoziția de monozaharide și analiza în infraroșu cu transformată Fourier a CDP au fost prezentate în Fig. 1 și 2 suplimentare. 2.3. Model de șoarece cu osteoporoză indusă de OVX Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul de etică a animalelor al Universității de Medicină Chineză din Guangzhou (aprobat SYXK 2019-0202). 30 de șoareci femele C57BL/6 în vârstă de 6-săptămâni au fost furnizați de Centrul pentru animale de experiment al Universității de Medicină Chineză din Guangzhou. După aclimatizare timp de 1 săptămână, unui grup de șoareci i s-a efectuat o operație simulată (grupul Sham), în timp ce șoarecii rămași au fost supuși unei operații de ovariectomie (grupul OVX). După operație, șoarecii au fost lăsați să se recupereze timp de 1-săptămână. Apoi, șoarecii modelați cu succes au fost împărțiți aleatoriu în 5 grupuri, cu 6 șoareci per grup: (1) Grupul simulat: tratat cu apă distilată, (2) Grupul OVX: tratat cu apă distilată, (3) Grupul OVX plus E2 (E2) : tratat cu 0,13 mg/kg comprimate de valerat de estradiol, (4) OVX plus CDP grup cu doză mică (CDP-L): tratat cu 300 mg/kg CDP, (5) OVX plus CDP grup cu doză mare (CDP H): tratat cu 600 mg/kg CDP. Apa distilată, E2 sau CDP a fost administrată prin gavaj o dată pe zi. Toți șoarecii au fost sacrificați după perioada de tratament 12- săptămâni (Fig. 1A). Uterele au fost colectate și cântărite, iar tibiile stângi au fost colectate pentru examinările ulterioare. Au fost colectate probe de sânge integral și centrifugate la 5000 rpm timp de 15 minute la 4 ◦ C. Supernatanții serici au fost aspirați și depozitați la -80 °C până la analize ulterioare. 2.4. Analiza micro-tomografie computerizată (micro-CT) și histomorfometrie osoasă Tibiile stângi au fost fixate cu paraformaldehidă 4% timp de 48 de ore și ulterior plasate în tuburi de centrifugă care conțineau soluție salină normală. Probele fixe au fost scanate cu instrumentul micro-CT Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgia) folosind următoarele setări: tensiune, 80 kV; curent sursă, 100 μA; Al, filtru de 0,5 mm; dimensiunea pixelilor, 9,76 μm; și treapta de rotație, 0,6◦. Câțiva parametri ai osului trabecular, inclusiv densitatea minerală osoasă (DMO), fracțiunea de volum osos (BV/TV), suprafața osoasă per volum total (BS/TV), numărul trabecular (Tb. N) și distanța trabeculară (Tb.Sp). ) au fost măsurate folosind software-ul CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Imaginile tridimensionale au fost generate folosind software-ul CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). În urma analizei micro-CT, tibiile stângi au fost decalcificate în soluție de EDTA 14% și încorporate în parafină pentru secționare. Probele au fost tăiate în secțiuni de 5 um folosind un microtom înainte de experimentele de colorare cu hematoxilină și eozină (H&E) și TRAcP. Secțiunile colorate au fost examinate și documentate folosind microscopul Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japonia). 2.5. Analiza serului Concentrațiile de calciu (Ca) și fosfor (P) au fost determinate conform instrucțiunilor trusei concepute de Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng (Nanjing, China). Nivelurile TRAcP-5b și RANKL din ser au fost analizate folosind kitul ELISA TRAcP{-5b (CUSABIO, Wuhan, China) și, respectiv, kitul ELISA RANKL (Cloud-CloneCorp., Wuhan, China).

CD-ul cu produse chimice și colectare de probe (nr. 180801) a fost achiziționat de la Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, China) și identificat de profesorul Haibo Huang de la Școala de Științe Farmaceutice, Universitatea de Medicină Chineză din Guangzhou, Guangzhou, China. Tabletele de valerat de estradiol au fost achiziționate de la Bayer (Leverkusen, Renania de Nord-Westfalia, Germania). Mediu esențial minim modificat alfa (-MEM) și ser fetal bovin (FBS) au fost obținute de la Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Penicilina/streptomicina și trusa de colorare TRAcP au fost achiziționate de la Solarbio (Beijing, China). M-CSF de șoarece recombinant și RANKL de șoarece recombinant au fost procurate de la R&D Systems (Minneapolis, MN, SUA). Plăcile acoperite cu hidroxiapatită au fost achiziționate de la Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, SUA). Anticorpii primari pentru NFATc1 și CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA); IkB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK şi P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, SUA); şi -actină (CWBIO, Beijing, China) a fost, de asemenea, obţinută. Ceilalți reactivi utilizați în acest studiu au fost de calitate analitică, iar apa a fost purificată prin sistemul de purificare a apei Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, SUA). 2.2. Extracția CDP CD-ul a fost măcinat până la o pulbere fină și amestecat cu eter de petrol de trei ori pentru a-l învinge. Reziduul solid a fost colectat prin filtrare şi apoi uscat la temperatura camerei. Polizaharidele au fost extrase din probele pretratate de trei ori cu apă timp de 2 ore, concentrate, precipitate prin adăugarea de etanol anhidru la o concentrație finală de 80 procente (v/v) și depozitate la 4 ◦C timp de 24 h. Precipitatele au fost colectate prin centrifugare la 3000 rpm timp de 20 min, dizolvate în apă distilată și purificate (înlăturarea proteinelor libere) folosind metoda Sevag (Zhao și colab., 2019). Polizaharidele recuperate au fost dializate, uscate și depozitate până la utilizare ulterioară. În plus, rezultatele compoziției chimice au arătat că conținutul total de zahăr, acid uronic, sulfat și proteine ​​din CDP a fost de 67,63 ± 0,98 la sută, 21,05 ± 0,49 la sută, 1,90 ± 0,24 la sută și 8,81 ± 0,36 la sută. Compoziția de monozaharide și analiza în infraroșu cu transformată Fourier a CDP au fost prezentate în Fig. 1 și 2 suplimentare. 2.3. Model de șoarece cu osteoporoză indusă de OVX Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul de etică a animalelor al Universității de Medicină Chineză din Guangzhou (aprobat SYXK 2019-0202). 30 de șoareci femele C57BL/6 în vârstă de 6-săptămâni au fost furnizați de Centrul pentru animale de experiment al Universității de Medicină Chineză din Guangzhou. După aclimatizare timp de 1 săptămână, unui grup de șoareci i s-a efectuat o operație simulată (grupul Sham), în timp ce șoarecii rămași au fost supuși unei operații de ovariectomie (grupul OVX). După operație, șoarecii au fost lăsați să se recupereze timp de 1-săptămână. Apoi, șoarecii modelați cu succes au fost împărțiți aleatoriu în 5 grupuri, cu 6 șoareci per grup: (1) Grupul simulat: tratat cu apă distilată, (2) Grupul OVX: tratat cu apă distilată, (3) Grupul OVX plus E2 (E2) : tratat cu 0,13 mg/kg comprimate de valerat de estradiol, (4) OVX plus CDP grup cu doză mică (CDP-L): tratat cu 300 mg/kg CDP, (5) OVX plus CDP grup cu doză mare (CDP H): tratat cu 600 mg/kg CDP. Apa distilată, E2 sau CDP a fost administrată prin gavaj o dată pe zi. Toți șoarecii au fost sacrificați după perioada de tratament de 12- săptămâni (Fig. 1A). Uterele au fost colectate și cântărite, iar tibiile stângi au fost colectate pentru examinările ulterioare. Au fost colectate probe de sânge integral și centrifugate la 5000 rpm timp de 15 minute la 4 ◦ C. Supernatanții serici au fost aspirați și depozitați la -80 °C până la analize ulterioare. 2.4. Analiza micro-tomografie computerizată (micro-CT) și histomorfometrie osoasă Tibiile stângi au fost fixate cu paraformaldehidă 4% timp de 48 de ore și ulterior plasate în tuburi de centrifugă care conțineau soluție salină normală. Probele fixe au fost scanate cu instrumentul micro-CT Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgia) folosind următoarele setări: tensiune, 80 kV; curent sursă, 100 μA; Al, filtru de 0,5 mm; dimensiunea pixelilor, 9,76 μm; și treapta de rotație, 0,6◦. Câțiva parametri ai osului trabecular, inclusiv densitatea minerală osoasă (DMO), fracțiunea de volum osos (BV/TV), suprafața osoasă per volum total (BS/TV), numărul trabecular (Tb. N) și distanța trabeculară (Tb. Sp. ) au fost măsurate folosind software-ul CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Imaginile tridimensionale au fost generate folosind software-ul CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). În urma analizei micro-CT, tibiile stângi au fost decalcificate în soluție de EDTA 14% și încorporate în parafină pentru secționare. Probele au fost tăiate în secțiuni de 5 um folosind un microtom înainte de experimentele de colorare cu hematoxilină și eozină (H&E) și TRAcP. Secțiunile colorate au fost examinate și documentate folosind microscopul Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japonia). 2.5. Analiza serului Concentrațiile de calciu (Ca) și fosfor (P) au fost determinate conform instrucțiunilor din kit concepute de Nanjing.

Institutul de Bioinginerie Jiancheng (Nanjing, China). Nivelurile TRAcP{{0}}b și RANKL din ser au fost analizate utilizând kitul ELISA TRAcP{{-5b (CUSABIO, Wuhan, China) și kitul ELISA RANKL (Cloud-CloneCorp., Wuhan, China) , respectiv. 2.6. Test de osteoclastogeneză in vitro BMM-urile au fost izolate din tibia și femurul de 6-șoareci femele C57BL/6 în vârstă de o săptămână. Celulele izolate au fost cultivate în mediu -MEM care conține 25 ng/mL M-CSF, 10 procente FBS și 1 procente penicilină/streptomicină. La atingerea confluenței, BMM-urile (1 × 104 celule/godeu) au fost însămânțate în plăci de 96-godeuri și tratate cu CDP în prezența a 5{0 ng/mL RANKL. Mediul și CDP au fost înlocuite la fiecare 2 zile. După 7 zile, celulele au fost fixate cu paraformaldehidă 4% și colorate pentru prezența urmei. Numărul de osteoclaste, definit ca celule pozitive TRAcP cu trei sau mai multe nuclee, a fost numărat și documentat folosind un microscop cu lumină. 2.7. Test de proliferare celulară BMM-urile (1 × 104 celule/godeu) au fost însămânțate într-o placă de 96-godeuri și incubate peste noapte. După aceasta, celulele au fost tratate cu diferite concentrații de CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 și 40 pg/mL) timp de 48 de ore. Confluența celulelor a fost detectată și analizată utilizând IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, SUA), un sistem dinamic de imagistică cu celule vii, pe termen lung, în timp real. 2.8. Testul de resorbție a hidroxiapatitei BMM-urile (1 × 104 celule/godeu) au fost însămânțate într-o placă acoperită cu hidroxiapatită, tratate cu CDP la concentrațiile indicate (0, 5 și 10 µg/mL) și cultivate în -MEM complet care conține 25 ng/ mL M-CSF și 50 ng/mL RANKL. După 7 zile, celulele au fost spălate cu o soluție de înălbitor 10% pentru a îndepărta componentele celulare. Imaginile zonelor de resorbție a hidroxiapatitei au fost capturate folosind IncuCyte ZOOM® și analizate folosind software-ul ImageJ (NIH, Bethesda, MD, SUA) (Abramoff, Magelhaes și Ram, 2003). 2.9. Izolarea ARN și analiza PCR cantitativă cu transcripție inversă în timp real (RT-qPCR) BMM-urile (1 × 105 celule/godeu) au fost însămânțate într-o placă de 6-godeuri și stimulate cu RANKL și M-CSF în prezența CDP la diferite concentrații (0, 5 și 10 µg/mL) timp de 5 zile. ARN-ul total a fost izolat din celulele sau țesutul osos al șoarecilor folosind reactiv TRIzol (Sigma Aldrich). ADN-ul complementar a fost sintetizat din 2 ug ARN total folosind un kit de revers transcriptază (TransGen Biotech, Beijing, China). Reacțiile RT-qPCR au fost preparate folosind PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) și detectate prin sistemul ABI 7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SUA). Parametrii de ciclism pentru PCR au fost stabiliți după cum urmează: 95 °C timp de 5 minute, urmate de 40 de cicluri de 95 °C timp de 15 s și 60 °C timp de 30 s. Primerii specifici utilizați sunt prezentați în Tabelul 1, iar cantitatea fiecărei gene țintă a fost normalizată la GAPDH (control intern).

2.10. Analiza Western blot BMM-urile (5 × 105 celule/godeu) au fost însămânțate într-o placă de 6-godeuri. Pentru experimente de scurtă durată, celulele au fost preincubate cu diferite concentrații de CDP (0, 5 și 10 µg/mL) timp de 1 oră și apoi tratate cu 5{{ 58}} ng/mL RANKL timp de 30 min. Pentru o lungă perioadă de timp, celulele au fost stimulate cu 50 ng/mL RANKL în zilele 3, 5 și 7 în prezența CDP (0, 5 și 10 pg/mL). Proteinele totale au fost extrase folosind tamponul de liză RIPA (CWBIO). Proteinele au fost separate cu 10% SDS-PAGE și transferate pe membrane PVDF. Membranele au fost blocate cu lapte degresat 5% la temperatura camerei timp de 2 ore, incubate cu anticorpi primari peste noapte la 4 °C și apoi cu anticorpii secundari corespunzători timp de 1,5 ore. Membranele au fost dezvoltate folosind reactivi ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, SUA), iar imaginile au fost realizate folosind Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, China). 2.11. Detectarea translocării NFATc1 utilizând testul de imunofluorescență. BMM-urile au fost însămânțate pe 12-godeuri, stimulate cu RANKL și M-CSF și tratate cu 10 ug/mL CDP timp de 5 zile. Celulele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă timp de 15 minute, spălate de trei ori cu PBS și permeabilizate cu 0,1% Triton X-100 timp de 10 minute. Celulele au fost amestecate cu ser de capră 10% (CWBIO) și incubate timp de 2 ore. Ulterior, celulele au fost incubate cu anticorpul primar peste noapte la 4 ◦ C și apoi cu anticorp secundar de capră anti-șoarece Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, SUA) la întuneric timp de 1 oră. Lamelele au fost spălate cu PBS, montate în reactiv Prolong Gold Antifade cu 4′, 6-diamidino-2-fenil in-dol (DAPI) (Solar) și inspectate folosind Zeiss LSM 800 cu microscop confocal Airyscan ( Carl Zeiss, Oberkochen, Germania). 2.12. Analiza statistică Toate datele experimentale au fost analizate utilizând software-ul statistic SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, SUA). Datele pentru studiile pe animale și celule sunt exprimate ca medii ± SEM și, respectiv, medii ± SD. Rezultatele folosesc analiza unidirecțională a varianței sau testul t Student. Valorile p < 0,05="" au="" fost="" considerate="" semnificative="" statistic.="" 3.="" rezultate="" 3.1.="" cdp="" previne="" pierderea="" osoasă="" indusă="" de="" ovx="" in="" vivo="" am="" folosit="" un="" model="" de="" șoarece="" cu="" osteoporoză="" indusă="" de="" ovx="" pentru="" a="" investiga="" efectele="" tratamentului="" cdp="" asupra="" osteoporozei="" in="" vivo.="" în="" comparație="" cu="" grupul="" sham,="" greutatea="" corporală="" a="" șoarecilor="" ovx="" a="" crescut="" semnificativ,="" în="" timp="" ce="" indicele="" uterin="" a="" scăzut,="" ceea="" ce="" indică="" faptul="" că="" modelul="" de="" osteoporoză="" a="" fost="" construit="" cu="" succes="" (fig.="" 1b="" și="" d).="" analiza="" micro-ct="" a="" tibiei="" în="" grupul="" ovx="" a="" arătat="" o="" pierdere="" osoasă="" extinsă.="" în="" comparație="" cu="" grupul="" ovx,="" numărul="" de="" trabecule="" osoase="" a="" crescut="" în="" grupul="" cdp-l,="" în="" timp="" ce="" creșterea="" în="" grupurile="" cdp-h="" și="" e2="" a="" fost="" mai="" semnificativă,="" iar="" trabeculele="" din="" ultimele="" două="" grupuri="" au="" devenit="" mai="" grosiere="" și="" decalajul="" a="" devenit="" mai="" mic="" (="" fig.="" 1c).="" analiza="" cantitativă="" a="" confirmat="" că="" mai="" mulți="" parametri="" histomorfometrici="" osoși,="" inclusiv="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" și="" tb.="" n="" a="" avut="" valori="" semnificativ="" crescute,="" în="" timp="" ce="" tb.="" sp="" a="" prezentat="" valori="" scăzute="" în="" grupul="" cdp-h="" (fig.="" 1e="" și="" f).="" examenul="" său="" patologic="" folosind="" colorația="" h&e="" a="" arătat="" că="" numărul="" de="" trabecule="" osoase="" în="" grupurile="" cdp-h="" și="" e2="" a="" fost="" semnificativ="" mai="" mare="" decât="" cel="" din="" grupul="" ovx,="" în="" timp="" ce="" nu="" a="" existat="" o="" îmbunătățire="" semnificativă="" în="" grupul="" cdp-l="" (fig.="" 1g).="" în="" plus,="" colorarea="" tracp="" a="" arătat="" că="" numărul="" de="" osteoclaste="" a="" crescut="" semnificativ="" în="" grupul="" ovx,="" dar="" a="" scăzut="" în="" grupurile="" cdp-h="" și="" e2="" (fig.="" 1h).="" grupurile="" cdp-l,="" cdp-h="" și="" e2="" au="" arătat="" că="" au="" inhibat="" creșterea="" indusă="" de="" ovx="" a="" conținutului="" de="" p,="" dar="" au="" crescut="" conținutul="" de="" ca="" în="" serul="" sanguin.="" markerii="" de="" absorbție="" osoasă,="" rankl="" și="" tracp-5b="" au="" arătat="" o="" tendință="" de="" scădere="" a="">

grupul fără o diferență statistică, în timp ce au fost semnificativ scăzute în grupul CDP-H (Fig. 1I). În plus, am examinat efectul CDP asupra expresiei genelor marker de osteoclaste în țesuturile osoase prin RT-qPCR. Nivelurile de ARNm de NFATc1, Acp5, Mmp9 și CTSK în grupul OVX au fost semnificativ mai mari decât cele din grupul Sham. Grupurile CDP-H au arătat o scădere a nivelului de ARNm al NFATc1, Acp5 și CTSK de 1,74-, 1,70- și 2,00-ori, în comparație cu grupul OVX. (Fig. 1J). 3.2. CDP suprimă osteoclastogeneza indusă de RANKL in vitro. Am monitorizat proliferarea celulară a BMM-urilor tratate cu CDP utilizând un analizor dinamic de imagistică cu celule vii, în timp real, pe termen lung. Comparativ cu grupul de control, confluența celulelor în grupurile tratate cu CDP nu s-a schimbat la o doză.<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1,25 ug/mL CDP a arătat o dimensiune și un număr semnificativ reduse (Fig. 2B și C). Aceste rezultate au arătat că CDP a inhibat eficient osteoclastogeneza indusă de RANKL, fără a afecta viabilitatea celulei. 3.3. CDP inhibă activitatea de resorbție osteoclastică indusă de RANKL și expresia genei specifice osteoclastelor. Am determinat în continuare efectele tratamentului CDP asupra activității de resorbție osoasă a osteoclastelor folosind plăci acoperite cu hidroxiapatită. Resorbția osoasă este principala funcție și standard pentru măsurarea activității și capacității osteoclastelor (Novack & Faccio, 2011). Rezultatele au arătat că CDP poate reduce semnificativ zona de resorbție osoasă a osteoclastelor într-o manieră dependentă de doză, indicând faptul că CDP a inhibat activitatea de resorbție osoasă indusă de RANKL (Fig. 3A și B). În special, zona osteoclastică de resorbție osoasă a scăzut la aproximativ 6,3% după tratamentul cu 10 ug/mL CDP. Pentru a înțelege mai bine obstacolul CDP asupra osteoclastogenezei, am măsurat nivelurile de transcripție ale genelor legate de osteoclaste. Fără tratament cu CDP, inducerea cu RANKL a promovat expresia genelor NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 și Mmp9. Dimpotrivă, aplicarea concomitentă a CDP și RANKL a redus semnificativ aceste cinci gene (Fig. 3C și D).

3.4. CDP inhibă activarea NFATc1 indusă de RANKL. Colorarea TRAcP a arătat că tratamentul cu CDP a redus semnificativ creșterea așteptată a numărului de osteoclaste mature după stimularea RANKL timp de 3-7 zile (Fig. 4A și B). În plus, am investigat dacă tratamentul cu CDP poate afecta eficient diferențierea osteoclastelor prin inhibarea expresiei NFATc1. Rezultatele au arătat că NFATc1 a fost foarte exprimat după stimularea RANKL timp de 5 zile, care a fost inhibată semnificativ după tratamentul CDP (Fig. 4C și D). În plus, tratamentul cu CDP a suprimat nivelurile de expresie ale CTSK, o proteină necesară pentru formarea și funcționarea normală a osteoclastelor (Bossard și colab., 1996) (Fig. 4E și F). Am selectat o reprezentare punctuală a stimulării RANKL timp de 5 zile pentru a investiga în continuare efectul tratamentului CDP cu 10 ug/mL asupra translocării NFATc1. După cum era de așteptat, tratamentul cu CDP a inhibat semnificativ translocarea nucleară NFATc1 indusă de RANKL (Fig. 4G și H).

Fig. 4. CDP suprimă activarea NFATc1 indusă de RANKL. (A) BMM-urile au fost însămânțate într-o placă de 6-godeuri și stimulate cu RANKL și M-CSF în prezența CDP (0, 5 și 10 µg/mL) pentru zilele indicate. Imagini reprezentative care arată celule multinucleate TRAcP pozitive. Mărire, ×100. Bare de scară {{10}} μm. (B) Cuantificarea celulelor multinucleate TRAcP pozitive (nuclee mai mari sau egale cu 3). (CF) Analiza Western blot a expresiilor proteinei NFATc1 și CTSK, în BMM, stimulate cu M CSF și RANKL timp de 3-7 zile în prezența CDP. (G) BMM-urile au fost tratate cu 10 ug/mL CDP și stimulate de M-CSF și RANKL timp de 5 zile, apoi imunocolorate cu NFATc1 (verde) și DAPI (albastru) și observate folosind un microscop confocal. Mărire, ×200. Bare de scară=20 μm. (H) Intensitatea fluorescenței a fost analizată utilizând Image-Pro Plus. Valorile sunt exprimate ca medii ± SD (n=3). *p < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" față="" de="" grupul="" de="" control;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" față="" de="" grupul="" rankl.="" 3.5.="" cdp="" inhibă="" activarea="" indusă="" de="" rankl="" a="" căilor="" de="" semnalizare="" nf-kb="" și="" mapks="" pentru="" a="" elucida="" mecanismele="" implicate="" în="" inhibarea="" indusă="" de="" cdp="" a="" diferențierii="" osteoclastelor,="" am="" examinat="" impactul="" tratamentului="" cdp="" asupra="" căilor="" nf-kb="" și="" mapks.="" rezultatele="" au="" arătat="" că="" tratamentul="" cu="" cdp="" a="" avut="" efecte="" supresoare="" asupra="" degradării="" iκb="" și="" fosforilării="" p65="" într-o="" manieră="" dependentă="" de="" doză="" (fig.="" 5a="" și="" b).="" fosforilarea="" a="" trei="" membri="" ai="" familiei="" mapk-uri,="" în="" special="" kinaza="" reglată="" de="" semnal="" extracelular="" (erk),="" kinaza="" n-terminală="" c-jun="" (jnk)="" și="" p38="" au="" fost="">

Discuţie

Osteoporoza este o boală osoasă frecventă și degenerativă. În prezent, există multe medicamente de sinteză chimică utilizate în tratamentele clinice pentru osteoporoză, cum ar fi estrogenul și bifosfonatul. Cu toate acestea, utilizarea pe termen lung a acestor medicamente va slăbi treptat eficacitatea clinică și chiar va provoca multe efecte secundare grave, inclusiv risc crescut de cancer ovarian, mamar și endometrial și osteonecroză a maxilarului (Beral, 2003). ; Khan și colab., 2009; Lacey și colab., 2002). În timp ce în acest studiu, am selectat CDP, o componentă eficientă extrasă din CD, ca agent terapeutic și am demonstrat că CDP a avut un efect protector împotriva pierderii osoase la șoarecii OVX și a inhibat formarea și funcția osteoclastelor induse de RANKL. Între timp, conform teoriei medicinei tradiționale chineze „osul care guvernează rinichii”, pierderea osoasă este atribuită deficiențelor renale. Ca aliment medical de tonifiere a rinichilor, s-a dovedit că CD-ul oferă un tratament eficient pentru osteoporoză (Fan și colab., 2019; Jiang, Wang, Li și Zhang, 2016). Astfel, CDP extras din această plantă naturală este o opțiune de medicament mai bună și mai sigură. În prezent, modelul de șoarece OVX este un model clasic de pierdere osoasă post-menopauză la femei, investigând cauzele pierderii osoase și efectuând intervenții (Wehrle et al., 2015). În consecință, am efectuat ooforectomie bilaterală pe șoareci femele C57BL/6J pentru a construi un model de osteoporoză. În studiile anterioare, dozele de CDP administrate animalelor au fost de 50-200 mg/kg (doză mică) și 1800 mg/kg (doză mare) (Guo și colab., 2016; Zhang și colab., 2018). Aici, doza mare de CDP la șoareci a fost de 600 mg/kg, care sa bazat pe doza clinică mare de 30 g CD în decoct; astfel, este similar cu practica clinică actuală. În acest studiu, tratamentul cu CDP a inhibat semnificativ creșterea în greutate corporală indusă de OVX, care este un fenomen comun observat la șoarecii OVX (Davis et al., 2019). Utilizând scanarea micro-CT și reconstrucția 3D, am constatat că OVX a condus la o reducere vizibilă a DMO, BV/TV, BS/TV și Tb.N și o creștere a Tb.Sp, în timp ce tratamentul CDP a inversat toate aceste modificări. . În special, în comparație cu medicamentul pozitiv, CDP ar putea îmbunătăți semnificativ DMO la șoareci OVX, care este un marker important al calității oaselor și utilizat pentru a reflecta gradul de osteoporoză (Fuggle et al., 2019), indicând faptul că CDP are un avantaj peste medicamentul pozitiv în îmbunătățirea DMO. În plus, rezultatele histologice au indicat că tratamentul cu CDP ar putea reduce cantitatea crescută de osteoclaste TRAcP-pozitive induse de OVX. Aceste rezultate sugerează că administrarea CDP a atenuat eficient pierderea osoasă în osteoporoza indusă de OVX, posibil prin inhibarea formării osteoclastelor. În conformitate cu rezultatele de mai sus, am constatat că CDP a inhibat formarea și funcția osteoclastică indusă de RANKL în funcție de doză, în timp ce CDP a avut un efect redus asupra proliferării celulelor precursoare de osteoclaste induse de M-CSF în experimentele noastre in vitro. Legarea RANKL și RANK poate duce la recrutarea TRAF6 și la activarea ulterioară a mai multor căi de semnalizare în aval, cum ar fi NF-kB și MAPK-uri (Boyle și colab., 2003; Huang și colab., 2006). Calea de semnalizare NF-κB joacă un rol important în reglarea diferențierii osteoclastelor, iar tăcere a genelor care codifică proteinele cheie din această cale poate duce la o dezvoltare anormală a osului (Leibbrandt & Penninger, 2008). Este bine stabilit că NF-kB este prezent în citoplasma celulelor nestimulate într-un complex cu IkB, dar intră rapid în nucleu după stimularea RANKL (Boyle et al., 2003). IkB eliberat este apoi degradat rapid, în timp ce NF-kB activează transcripția specifică a genei, promovând, în consecință, diferențierea, maturarea și apoptoza osteoclastelor (Abdelmagid și colab., 2015). În acest studiu, rezultatele au arătat că tratamentul cu CDP a suprimat activarea indusă de RANKL a căii de semnalizare NF-kB, așa cum sa demonstrat prin inhibarea degradării IkB și fosforilarea p65 într-o manieră dependentă de doză, ceea ce poate implica efectul său anti-osteoclastogen. . În plus, calea de semnalizare a MAPK, inclusiv ERK, JNK și p38, sunt strâns implicate în osteoclastogeneza indusă de RANKL (Li și colab., 2002). În plus, inhibitorii dominanti ai p38 și JNK pot preveni osteoclastogeneza indusă de RANKL (Chang și colab., 2008; Kim și colab., 2019), în timp ce ERK joacă un rol semnificativ în supraviețuirea osteoclastelor (Miyazaki și colab., 2000). Este bine stabilit că RANKL activează calea de semnalizare a MAPK-urilor prin creșterea fosforilării ERK, JNK și p38 (Mizukami și colab., 2002). În studiul nostru, am demonstrat că CDP a suprimat fosforilarea indusă de RANKL a proteinelor cheie în calea de semnalizare MAPK. Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că inhibarea activării căilor de semnalizare NF-kB și MAPKs contribuie la efectul inhibitor al CDP împotriva osteoclastogenezei. Activarea căilor de semnalizare NF-κB și MAPK promovează exprimarea mai multor factori cheie de transcripție, cum ar fi oncogenei celulare fos, proteina activatoare 1 și NFATc1 (Huang și colab., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, un membru important al familiei NFAT, este implicat în diferențierea osteoclastelor terminale ca un regulator transcripțional principal (Asagiri și colab., 2005). S-a raportat că celulele stem embrionare cu deficit de NFATc1- nu se pot diferenția în osteoclaste sub stimularea RANKL, iar expresia ectopică a NFATc1 face ca celulele precursoare să sufere diferențiere ocolind semnalizarea RANKL, ceea ce sugerează că NFATc1 are un rol critic în diferențierea osteoclastelor (Takayanagi și colab., 2002). Rezultatele studiului nostru au arătat efectul supresor al CDP asupra expresiei NFATc1 și a proteinei CTSK următoare. Interesant, am observat că nivelul de exprimare a proteinei NFATc1 a crescut mai întâi și apoi a scăzut, atingând cel mai înalt nivel în a 5-a zi după stimularea RANKL. Acest lucru a fost în concordanță cu rezultatele lui Baek și colab. (2014), care au observat că M-CSF a indus degradarea NFATc1 în timpul osteoclastogenezei în stadiu avansat prin ubiquitinarea indusă de Cbl a NFATc1 într-o manieră dependentă de kinaza Src. Rezultatele testului de imunofluorescență au susținut în mod constant efectul inhibitor al CDP asupra activării transcripționale NFATc1. În plus, genele specifice osteoclastelor, inclusiv CTSK, Acp5, Mmp9 și Atp6v0d2, sunt toate reglementate direct de NFATc1 (Y. Kim și colab., 2005), au fost suprimate de CDP. Aceste constatări ilustrează faptul că NFATc1 este o țintă a efectului inhibitor al CDP asupra căilor de semnalizare NF-kB și MAPK.

Concluzie

În rezumat, am extras și purificat polizaharida activă din CD și am demonstrat că CDP a prezentat un efect protector asupra osteoporozei induse de OVX și a ameliorat pierderea osoasă prin reprimarea activității și funcției osteoclastelor. În plus, CDP poate inhiba diferențierea și funcționarea osteoclastelor induse de RANKL prin interferarea cu căile de semnalizare NF-kB și MAPK și, în consecință, afectând activarea NFATc1 în aval. În concluzie, descoperirile noastre oferă fundația pentru extinderea și aplicarea CDP în tratamentul osteoporozei.

Acest articol provine din listele de conținut disponibile pe pagina de pornire a revistei ScienceDirect Journal of Functional Foods: www.elsevier.com/locate/jff