Polizaharidele Cistanche Deserticola atenuează declinul cognitiv și îmbunătățesc memoria la șoarecii model în vârstă

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ABSTRACT

Dovezi recente sugerează că modificări ale axei microbiota intestinală-creier pot conduce la tulburări cognitive odată cu îmbătrânirea. În studiul de față, am observat că administrarea prelungită de D-galactoză la șoareci a indus declinul cognitiv, disbioza microbiană intestinală, inflamația periferică și stresul oxidativ. În acest model de declin cognitiv legat de vârstă, polizaharidele Cistanche deserticola (CDPS) au îmbunătățit funcția cognitivă la șoarecii tratați cu D galactoză prin restabilirea homeostaziei microbiene intestinale, reducând astfel stresul oxidativ și inflamația periferică. Efectele benefice ale CDPS la acești șoareci model de îmbătrânire au fost abolite prin ablația microbiotei intestinale cu antibiotice sau imunosupresia cu ciclofosfamidă. Profilul metabolomic seric a arătat că nivelurile de creatinină, valină, L-metionină, o-toluidină, N-etilanilină, acid uric și prolină au fost modificate la șoarecii model în vârstă, dar au fost restaurate de CDPS. Aceste descoperiri au demonstrat că CDPS îmbunătățește funcția cognitivă într-un model de îmbătrânire indusă de D-galactoză la șoareci prin restabilirea homeostaziei axei creierului microbiotei intestinale, ceea ce a atenuat un dezechilibru de aminoacizi, inflamația periferică și stresul oxidativ. CDPS arată astfel potențial terapeutic pentru pacienții cu tulburări de memorie și de învățare, în special cei legate de disbioza microbiană intestinală.

Cistancheiarbă

INTRODUCERE

Administrarea prelungită de D-galactoză (D-gal) și săruri de beriliu induce îmbătrânirea în modelele animale experimentale și în culturile de celule primare in vitro și este utilizată pentru a identifica mecanismele care stau la baza procesului natural de îmbătrânire [1-4]. Studiile anterioare arată că declinul cognitiv la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-galactoză este legat de nivelurile reduse de proteine ​​ale factorului de creștere a nervilor (NGF) și creșterea speciilor reactive de oxigen (ROS) în creier, ambele provocând degenerarea neuronilor hipocampali și reducând. neurogeneza [3, 4]. Studii recente au arătat, de asemenea, că compoziția și numărul microbiotei intestinale umane se schimbă semnificativ în timpul procesului de îmbătrânire[5].

Cistanche deserticola este o plantă care crește în principal în regiunea deșertică de nord-vest a Chinei și este folosită în medicina tradițională chineză. Este cunoscut în mod obișnuit ca „ginseng-ul deșertului”. Extractele de Cistanche deserticola conțin mai mulți compuși activi farmacologic, inclusiv glicozide feniletanoide, iridoide, lignoză, oligozaharide, polizaharide și aminoacizi; acești compuși sunt asociați cu proprietăți antiinflamatorii, antioxidante, antisenescente, neuroprotectoare și imunomodulatoare [6, 7]. De exemplu, polizaharidele extrase din Cistanche deserticola au fost folosite în medicina tradițională chineză pentru a trata cancerul colorectal [8]. O gamă largă de polizaharide slab toxice cu bioactivități utile au fost izolate din mai multe organisme, cum ar fi polizaharida Chuanqiong, polizaharida Ganoderma lucidum și polizaharida Lycium barbarum [9-11]. CDA 0.05 este un galactoglucan izolat din Cistanche deserticola care promovează creșterea mai multor bacterii intestinale benefice, inclusiv mai multe specii de Bacteroides și Lactobacillus [12].

Mecanismele de bază ale procesului normal de îmbătrânire sunt, de asemenea, implicate în mai multe boli umane, cum ar fi tulburările neurodegenerative, ateroscleroza coronariană, diabetul de tip 2 (T2DM) și hipertensiunea [13, 14]. Studii recente au arătat că modificările florei intestinale joacă un rol semnificativ în îmbătrânirea umană [15]. Mai multe studii au arătat că administrarea prelungită de D-galactoză la șoareci și șobolani experimentali imită procesul normal de îmbătrânire și este un model util pentru studiul fenotipurilor legate de îmbătrânire, cum ar fi declinul cogniției [16]. În plus, șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-galactoză prezintă modificări în compoziția microbiotei intestinale [17]. Prin urmare, am emis ipoteza că modificările compoziției microbiotei intestinale pot cauza declin cognitiv la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D galactoză și am investigat dacă polizaharidele Cistanche deserticola (CDPS) pot atenua declinul cognitiv prin restabilirea disbiozei microbiotei intestinale.

cistanche stem

REZULTATE

Șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-galactoză demonstrează declin cognitiv și disbioză microbiană intestinală

Am analizat performanța comportamentală a șoarecilor de tip sălbatic (WT) și a celor tratați cu 150 mg D-gal per kg de greutate corporală timp de 2 luni (model sau Mod) utilizând teste noi de recunoaștere a obiectelor și teste Morris Water Maze (MWM). Valorile indicelui preferențial în testul de recunoaștere a obiectelor noi au fost reduse semnificativ la șoarecii din grupul Mod în comparație cu șoarecii din grupul WT (Figura 1A, 1B). Rezultatele testului MWM au arătat că timpul de latență de evadare după a șasea zi a fost semnificativ crescut în grupul Mod în comparație cu grupul WT (Figura 1C, 1D). În plus, traversările platformei țintă și timpii de înot în cadranul țintă au fost reduse semnificativ în grupul Mod în comparație cu grupul WT (Figura 1E, 1F). Aceste rezultate au demonstrat o scădere semnificativă a abilităților de învățare și memorie ale șoarecilor model de îmbătrânire indusă de legalitate.

Apoi am analizat diferențele în abundența și compoziția filelor, genurilor și speciilor microbiene intestinale din probele de fecale ale grupurilor de șoareci Mod și WT utilizând datele de secvențiere ARN ribozomal 16S (ARNr) din probele fecale. Flora intestinală predominantă la șoarecii din grupul WT și Mod au fost Firmicutes și Bacteroides. Cu toate acestea, abundența Bacteroides a fost redusă semnificativ, iar abundența Firmicutes a crescut semnificativ în grupul Mod comparativ cu grupul WT (Figura 2A). Apoi, am efectuat o analiză discriminantă liniară (LDA) pentru a determina scorurile pentru mărimea efectului LDA (LEfSe), urmată de teste Kruskal-Wallis și Wilcoxon pentru a evalua abundența relativă a diferiților taxoni la șoarecii din grupul WT și Mod. Rezultatele LDA sunt prezentate în Figura 2B. În plus, am construit cladograme care arată îmbogățirea diferențială a diferitelor genuri și specii aparținând phyla Bcteriodes și Firmicutes în grupurile WT și model (Figura 2C). În general, rezultatele noastre au demonstrat capacitatea cognitivă afectată și disbioza microbiană intestinală la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-galactoză.

beneficii cistanche pentru sănătate: antioxidare

Tratamentul CDPS îmbunătățește capacitatea cognitivă la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-gal

Am analizat dacă tratamentul CDPS atenuează declinul cognitiv la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-gal. Pe parcursul celor 2 luni de administrare, greutatea corporală a fost măsurată o dată la două zile. Greutățile corporale ale modelului și ale grupurilor de șoareci CDPS au fost similare (Figura 3A). Efectuați experimente comportamentale după ultima doză. Recunoașterea obiectelor noi și rezultatele testului Morris labirintul de apă au arătat că memoria pe termen scurt a fost semnificativ mai mare în grupurile de șoareci CDPS, comparativ cu grupul model de șoareci; Memoria pe termen lung în grupul de șoareci CDPS a fost mai mare, dar nesemnificativă statistic în comparație cu grupul de șoareci model (Figura 3B, 3C). Acest lucru a sugerat că tratamentul CDPS a abrogat pierderea memoriei de recunoaștere a obiectelor pe termen scurt la șoarecii tratați cu D-gal.

Învățarea și memoria spațială a acestor șoareci au fost evaluate prin testul labirintului de apă Morris, iar rezultatele au arătat că timpii de latență de evadare ai grupului de șoareci CDPS au fost comparabili cu grupul de șoareci WT și semnificativ mai scurti decât șoarecii de grup Mod (Figura 3D) . În plus, timpii de latență de evacuare au fost semnificativ mai mici în a șasea zi post-administrare CDPS, comparativ cu grupul model (Figura 3E). Timpul de înot în cadranul țintă a fost semnificativ mai mare în grupurile CH și CM comparativ cu grupul model. Grupul CL este mai mare decât grupul model, dar nu are semnificație statistică (Figura 3F). În plus, numărul de traversări ale platformei a fost semnificativ mai mare în grupurile CM și CL comparativ cu grupul model. Cu toate acestea, grupul CH este mai mare decât grupul model și nu are semnificație statistică (Figura 3G). Aceste rezultate au demonstrat că tratamentul cu CDPS a îmbunătățit învățarea și memoria spațială la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-gal.

Figura 1. Administrarea prelungită a D-galactozei induce învățarea și afectarea memoriei la șoareci.

Figura 2. Administrarea prelungită a D-galactozei induce disbioza microbiană intestinală la șoareci.

Tratamentul CDPS restabilește homeostazia compoziției microbiotei intestinale la șoarecii model de îmbătrânire cu D-galactoză

Monozaharidele și polizaharidele sunt nutrienții esențiali necesari pentru creșterea bacteriilor [18–21]. De asemenea, este raportat că CDPS reglează compoziția microbiotei intestinale [22]. Prin urmare, am analizat dacă tratamentele CDPS au atenuat disbioza microbiană intestinală la șoarecii din grupul model prin evaluarea datelor de secvențiere a ARNr 16S ale probelor de fecale din grupurile de șoareci WT, model și CDPS.

În primul rând, am calculat indici de diversitate alfa pentru a evalua bogăția generală a microbiotei fecale și diferența structurală dintre aceste grupuri. Am analizat indici de diversitate alfa (-diversitate), cum ar fi speciile observate, valorile indicilor Shannon, Chao 1, ACE și Simpson pentru a determina modificări în compoziția diferitelor specii de bacterii în probele de fecale ale diferitelor grupuri de murine. Indicii de diversitate (specii observate, indici Shannon, Chao 1, ACE și Simpson) au fost mai mari în grupurile de șoareci WT și CDPS comparativ cu grupul model, dar semnificația statistică a fost observată doar pentru valorile indicelui Chao 1 între CM grup și grup de mod. Acesta a indicat că administrarea cu CDPS crește bogăția microbiomului (Figura 4A-4E). Apoi, am analizat indicii de diversitate pentru a identifica diferențele dintre speciile microbiene intestinale între grupurile de șoareci WT, model și CDPS utilizând scalarea multidimensională nonmetrică (NMDS), analiza coordonatelor principale (PCoA) și analiza componentelor principale (PCA) . PCA a arătat variații în compoziția microbiană intestinală a șoarecilor din grupul model în timpul procesului de îmbătrânire, inclusiv reducerea dimensiunii și menținerea modelelor și tendințelor (Figura 4F). Diferențele dintre microbiota fecală dintre grupurile WT, model și CDPS au fost identificate pe baza PCoA a distanțelor UniFrac neponderate pentru genele ARNr 16S (Figura 4G). Analiza grupării a arătat diferențe semnificative în NMDS între grupul model și grupurile WT și CDPS (Figura 4H).

Am evaluat primele 10 phyla ale microbiotei intestinale și am constatat că abundența phyla Bacteroides a fost semnificativ mai mare în grupurile CH, CM și CL comparativ cu grupul model (Figura 4I). Acest lucru a sugerat că CDPS a restabilit homeostazia microbiotei intestinale la șoarecii tratați cu D-gal. Cladogramele au arătat îmbogățirea diferențială a diferitelor genuri și specii aparținând phyla Bacteriodes și Firmicutes în grupele WT, model și CDPS (Figura 4J). După cum se arată în hărțile termice, tratamentele cu CDPS au redus abundența relativă de Thermoplasmata, Bacili, Actinobacteria neidentificate, Fusobacteriia și Elusimicrobia neidentificate și au crescut abundența relativă de Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, _Deferribacteres, Nitrolinesosphaeria, Nitrolinesosphaeria neidentificate. , Erizipelotrichia și cianobacteriile neidentificate_ în comparație cu grupul model (Figura 4K). Aceste rezultate au demonstrat că tratamentul cu CDPS a restabilit în mod semnificativ homeostazia microbiotei intestinale la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-gal.

Figura 3. Tratamentul CDPS îmbunătățește învățarea și memoria la șoarecii model de îmbătrânire D-gal.

Tratamentul CDPS atenuează neurodegenerarea la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-gal prin reducerea stresului oxidativ

Apoi am analizat efectele CDPS asupra inflamației prin analiza nivelurilor serice ale citokinelor proinflamatorii (IL-2 și TNF-) și citokinelor antiinflamatorii (IL-4 și IL{-10). ) la diferite grupuri de șoareci. Nivelurile serice de IL-2 și TNF- au fost semnificativ mai mici, iar nivelurile serice de IL-4 și IL{-10 au fost semnificativ mai mari în grupurile CH, CM și CL comparativ cu modelul grup. Se arată că CDPS are efecte antiinflamatorii (Figura 5A-5D).

Stresul oxidativ este cauzat de creșterea producției de specii reactive de oxigen (ROS) și este unul dintre principalii factori care favorizează îmbătrânirea [23]. Prin urmare, am analizat efectele CDPS asupra stresului oxidativ în modelul de șoarece îmbătrânit indus de D-gal prin evaluarea nivelurilor serice ale enzimei antioxidante, SOD și a produsului de peroxidare a lipidelor, malondialdehida (MDA). Nivelurile serice de MDA au fost semnificativ mai mari și nivelurile serice de SOD au fost semnificativ reduse în grupul Mod comparativ cu grupul WT, dar tratamentul cu CDPS a inversat aceste efecte (Figura 5E, 5F). Aceste rezultate au demonstrat că stresul oxidativ a fost crescut la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-gal, dar a fost redus prin tratamentul CDPS.

În plus, am evaluat nivelurile de stres oxidativ din țesuturile creierului analizând nivelurile produsului proteic oxidat avansat (AOPP), peroxidarea lipidică directă (LPO) și MDA, precum și activitățile enzimelor antioxidante, cum ar fi glutation peroxidaza (GSH-Px). ) și superoxid dismutază (SOD) în țesutul cerebral se omogenizează. Creierele șoarecilor din grupul Mod au arătat activități semnificativ reduse ale SOD și GSH-PX și niveluri crescute semnificativ de AOPP, LPO și MDA în comparație cu grupul WT, dar aceste efecte au fost inversate în grupul CH, CM și CL (Figura 6A-). 6E).

În plus, am efectuat colorarea histologică a secțiunilor creierului cu colorații H&E și Nissl pentru a evalua efectele protectoare ale CDPS asupra creierului șoarecilor model de îmbătrânire indusă de D-gal. Șoarecii din grupul Mod au arătat o reducere semnificativă a numărului și volumului neuronal, decalajul crescut între neuroni, aranjarea neregulată a neuronilor și picnoza nucleară în regiunea CA1 a hipocampului în comparație cu grupul WT, dar aceste modificări patologice au fost reduse semnificativ prin tratamentele CDPS ( Figura 6F). Aceste rezultate au demonstrat că tratamentele CDPS au redus semnificativ stresul oxidativ și patologia creierului la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D gal.

Figura 4. Tratamentul CDPS restabilește compoziția microbiană intestinală la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-galactoză.

Tratamentul CDPS reduce inflamația periferică și stresul oxidativ prin menținerea homeostaziei microbiene intestinale la șoarecii model induși de D-gal

Apoi, am analizat dacă modificările în compoziția microbiotei intestinale au fost asociate cu inflamația periferică crescută și stresul oxidativ în timpul îmbătrânirii. În acest sens, am folosit un cocktail cu triplu antibiotic (grup ABX) sau ciclofosfamidă (grup Cy; vezi și Materiale și metode) pentru a elimina microbiota intestinală sau a induce imunosupresia la șoarecii model de îmbătrânire tratați cu CDPS. Tratamentul cu antibiotice a abrogat efectele benefice ale tratamentului CDPS la șoarecii model în vârstă. Am observat tulburări de învățare și memorie (Figura 7A) și modificări ale compoziției microbiotei intestinale (Figura 7B, 7C) la șoarecii din grupul ABX în comparație cu grupul tratat cu CDPS. Rezultatele de mai sus indică faptul că chiar și administrarea de CDPS nu poate crește capacitatea de învățare și memorie a șoarecilor după modificarea florei intestinale. Mai mult, am observat niveluri crescute de citokine proinflamatorii în creier și serul șoarecilor din grupul ABX în comparație cu grupul CDPS (Figura 7D-7N). Rezultatele grupului ABX și grupului CY au arătat că, după ce flora intestinală și funcția imună au fost distruse, nici măcar administrarea de CDPS nu a putut îmbunătăți capacitatea de învățare și memorie a șoarecilor. Aceste rezultate au sugerat că tratamentul cu CDPS a scăzut inflamația periferică, stresul oxidativ și declinul cognitiv la șoarecii model de îmbătrânire indusă de legal prin prevenirea disbiozei intestinale.

Am folosit apoi medicamentul imunosupresor, ciclofosfamida [24] pentru a determina rolul inflamației în efectele benefice ale CDPS. Șoarecii CDPS tratați cu ciclofosfamidă (grupul Cy) au prezentat abilități de învățare și memorie afectate, modificări ale compoziției microbiotei intestinale și niveluri aberante de citokine pro și antiinflamatorii în creier și ser în comparație cu șoarecii de tip sălbatic și grupul CDPS. Cu toate acestea, nu există nicio semnificație în comparație cu modelul și grupul ABX. (Figura 7A–7N). Aceste date demonstrează că modificările în compoziția microbiotei intestinale cresc inflamația periferică la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-gal.

Figura 5. Tratamentul CDPS modulează nivelurile circulante ale citokinelor pro și antiinflamatorii și factorii legați de stresul oxidativ la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-galactoză.

CDPS previne îmbătrânirea indusă de D-gal prin reglarea metabolismului aminoacizilor

Sistemul imunitar al gazdei este influențat de metaboliții generați de microbiota intestinală [25]. Metaboliții fecali reprezintă o citire funcțională a metabolismului microbian intestinal și a compoziției microbiene intestinale[26]. Mai mult, metaboliții microbiotei intestinale intră în circulația sângelui și au impact asupra metabolismului și sănătății gazdei [26, 27]. Un total de 1058 de metaboliți au fost identificați în probele de ser de la șoareci FWT, Mod și CDPS. Apoi, am analizat acești metaboliți folosind BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) și Human Metabolome Database (HMDB) și am constatat că 65 de metaboliți au fost exprimați diferențial în grupul Mod în comparație cu grupul WT. În plus, am constatat că nivelurile a 8 metaboliți (creatinină, valină, L-(-)-metionină, o-toluidină, N etilanilină, acid uric, prolină și fenilalanină) diferă semnificativ între grupurile WT, Mod și CDPS. Analiza de îmbogățire a căilor acestor 8 metaboliți folosind MetaboAnalyst [28, 29] a arătat că acești metaboliți au fost legați de metabolismul argininei, histidinei, argininei, prolinei și purinei (Figura 8A, 8B). 7 metaboliți diferiți ai grupului MOD și grupului CDPS în grupul WT.

Am analizat apoi dacă modificările metabolismului aminoacizilor au fost legate de modificări ale compoziției microbiotei intestinale. Am observat că 7 metaboliți diferiți ai grupurilor WT, Mod și CDPS (creatinină, valină, L-(-)-metionină, o-toluidină, N-etilanilina, acid uric și prolină) au fost semnificativ scăzute în ABX, Cy, și grupurile Mod în comparație cu grupurile WT și CDPS. Mai mult, nu există nicio semnificație între grupurile ABX și Cy (Figura 8C). În cele din urmă, pentru a explora, există o corelație între metabolismul diferențial și alte boli legate de îmbătrânire. Am analizat corelația dintre acești șapte metaboliți exprimați diferențial și bolile umane folosind baza de date MetaboAnalyst și am constatat că acești metaboliți au fost asociați cu boala Alzheimer (p=0.00173; Figura 8D, 8E). În general, aceste date au sugerat că CDPS protejează împotriva îmbătrânirii induse de D-gal prin reglarea metabolismului aminoacizilor.

Figura 6. Tratamentul CDPS reduce stresul oxidativ în creierul șoarecilor model de îmbătrânire indusă de D-galactoză

DISCUŢIE

O scădere progresivă a funcției cognitive este o trăsătură caracteristică a îmbătrânirii. Studiile anterioare au arătat că tratamentul cu CDPS a îmbunătățit semnificativ învățarea și memoria la șoarecii model în vârstă [30-33]. În acest studiu, am demonstrat că tratamentul cu CDPS a îmbunătățit funcția cognitivă prin inhibarea inflamației periferice și a stresului oxidativ prin restabilirea homeostaziei microbiene intestinale la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-gal (Figura 9). Șobolanii Sprague-Dawley hrăniți cu polizaharide Cistanche au prezentat o creștere crescută a bacteriilor intestinale benefice și o diversitate microbiană intestinală îmbunătățită [34]. CDA-0.05, o polizaharidă neutră Cistanche, a îmbunătățit creșterea lactobacililor probiotici [22]. Aceste date au sugerat că polizaharidele Cistanche au îmbunătățit homeostazia bacteriilor intestinale.

În acest studiu, am demonstrat că CDPS are efecte antiinflamatorii și îmbunătățește capacitatea cognitivă a șoarecilor model de îmbătrânire prin modularea abundenței genurilor bacteriene intestinale, cum ar fi Bacteroidetes, Firmicutes și Proteobacteria. Prin urmare, CDP-urile pot fi benefice din punct de vedere terapeutic pentru bolile legate de îmbătrânire prin remodelarea compoziției microbiotei intestinale [35,36]. Mai mult, studiile anterioare au arătat că nivelurile de citokine inflamatorii din ser și colon sunt asociate cu abundența relativă a genurilor bacteriene precum Bacteroidetes, Firmicutes și Proteobacteria [37, 38]. În plus, compoziția microbiană intestinală reglează funcția creierului prin modularea nivelurilor circulante ale mai multor citokine [39-43]. Rezultatele noastre au arătat că tratamentul cu CDPS a scăzut abundența relativă de Thermoplasmata, Bacili, Actinobacteria neidentificate, Fusobacteriia și Elusimicrobia neidentificate și a crescut abundența relativă de Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, Deferribacteres, Mollisosphaeria, Nitrolinesophaeria, Nitrolinea, Deltaproteobacteria neidentificate. Erizipeltrichia și cianobacteriile_neidentificate.

Metaboliții microbieni intestinali sunt eliberați în fluxul sanguin și reglează sănătatea și metabolismul gazdei [26, 27]. Metaboliții microbieni intestinali pot fi estimați prin evaluarea compoziției metaboliților fecali, care se modifică odată cu modificările compoziției microbilor intestinali [44]. Studii recente au arătat că nivelurile plasmatice de citrulină, prolină, arginină, asparagină, fenilalanină și treonină sunt asociate cu tulburări neurodegenerative, inclusiv boala Alzheimer [45, 46]. Studiul nostru a arătat că nivelurile serice de creatinină, valină, L-metionină, o-toluidină, N etilanilină, acid uric și prolină au fost asociate cu îmbătrânirea indusă de D-gal la șoareci.

Extract de Cistanche: anti-boala Alzheimer

Brațele înnăscute și adaptative ale sistemului imunitar joacă un rol semnificativ în menținerea homeostaziei microbiene gazdă în suprafața luminală intestinală [47]. Microbiota intestinală joacă, de asemenea, un rol semnificativ în reglarea sistemului nervos central (SNC) și a imunității prin eliberarea de citokine și metaboliți în fluxul sanguin [48, 49]. Citokinele proinflamatorii joacă un rol cheie în mai multe boli neurodegenerative [50–52]. De exemplu, degenerescența maculară legată de vârstă (AMD) și glaucomul sunt asociate cu acumularea extracelulară de amiloid (A) și depunerea intracelulară de tau hiperfosforilat (p tau) și fier în celulele ganglionare retiniene (RGC) [44]. Mai mult, inflamația joacă un rol semnificativ în patogeneza asociată cu glaucomul [53]. Deficiența vizuală este un simptom precoce al bolii Alzheimer (AD) și se manifestă înainte de debutul declinului cognitiv [54]. Studiul nostru a demonstrat că CDPS protejează împotriva declinului cognitiv și a inflamației periferice prin menținerea homeostaziei microbiotei intestinale.

Există mai multe limitări ale acestui studiu. În primul rând, relația dintre metabolismul aminoacizilor și compoziția microbiotei intestinale nu este bine cunoscută. În al doilea rând, compoziția și structura moleculară a CDPS nu sunt cunoscute. Prin urmare, sunt necesare studii viitoare pentru a explora în continuare rolul de reglementare al CDPS în ameliorarea AD prin axa microbiota intestinală-subsemnare.

În concluzie, studiul nostru a demonstrat că CDPS a îmbunătățit capacitatea cognitivă la șoarecii model de îmbătrânire indusă de D-gal prin restabilirea homeostaziei microbiotei intestinale, restabilind astfel dezechilibrul de aminoacizi, inflamația periferică și stresul oxidativ. Aceste descoperiri sugerează că CDPS este un potențial terapeutic pentru pacienții cu tulburări de învățare și memorie, în special cei asociati cu disbioza intestinală.

MATERIALE ȘI METODE

Pregătirea CDPS

Aproximativ 1,0 kg de Cistanche deserticola curățată a fost uscată la aer în cuptor la 40 de grade C și pulverizată în pulbere brută. Pulberea a fost extrasă în etanol fierbinte timp de 3 ore. Reziduul a fost filtrat prin tifon pentru a îndepărta filtratul și apoi diluat cu apă (8X) și refluxat secvenţial timp de 2 ore, 1,5 ore și 1 oră la 90 grade C. La fiecare moment, soluția a fost centrifugata pentru a separa supernatantul și combinate cu filtratul brun-rosu. Apoi, filtratul a fost concentrat la presiune redusă, răcit la temperatura camerei, adăugat lent la 95% etanol (3X) şi lăsat să stea la 4 grade C timp de 24 de ore. Apoi, soluția a fost centrifugată la 6000 r/min timp de 20 min la 4 grade C. Precipitatul a fost colectat după repetarea extracției cu apă și precipitarea cu alcool de trei ori. Precipitatul a fost reconstituit în apă, deproteinizat, dializat și liofilizat pentru a obține polizaharidă brută de Cistanche deserticola (CDP). Conținutul de polizaharide a fost mai mult de 90 la sută, după cum a fost evaluat prin spectrofotometrie ultravioletă.

extract de cistanche

Gruparea animalelor și tratamente

Șoarecii Kunming masculi în vârstă de opt săptămâni (Nr. de licență SCXK 2019-0010) au fost achiziționați de la SPF Biotechnology Co. Ltd (Beijing, China), găzduiți într-o cameră cu lumină și temperatură controlată și hrăniți cu hrană și apă. Toate experimentele pe animale au fost efectuate conform protocoalelor aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor al Universității Medicale din Mongolia Interioară. Experimentele au fost efectuate conform Ghidului National Institutes of Health (NIH) pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator.

După o săptămână de adaptare la noul mediu, 120 de șoareci au fost împărțiți în următoarele 7 grupuri: (1) control de tip sălbatic (WT); grup model (150 mg/Kg/zi D-gal; Mod); (3) CH: D-gal plus 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal plus 25 mg/kg CDPS; (6) Grupa ABX: antibiotice plus D-gal plus 50 mg/Kg CDPS; (7) Grupa Cy: ciclofosfamidă plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS.

Șoarecii din grupele model, ABX, Cy și CDPS au primit injecții subcutanate de 150 mg/kg D-gal dizolvat în soluție salină în fiecare zi timp de 2 luni. Grupul WT a fost injectat subcutanat cu un volum egal de soluție salină timp de 2 luni. Şoarecii din grupul CDPS au fost, de asemenea, administraţi zilnic cu injecţii intragastrice care conţin 100 mg/kg, 50 mg/Kg sau 25 mg/Kg CDPS timp de 2 luni. Șoarecii din grupul ABX au primit apă de băut cu 0,1 mg/ml ampicilină și 0,5 mg/ml streptomicină timp de 2 luni în plus față de injecțiile cu D-gal și CDPS. Înainte de a administra D-gal, șoarecii au primit injecții care conțineau 0,1 mg/ml ampicilină, 0,5 mg/ml streptomicină și 0,1 mg/ml colistina timp de 7 zile în grupul ABX. Șoarecii din grupul Cy au primit injecții intraperitoneale de 20 mg/Kg ciclofosfamidă la două zile (qod) timp de 2 luni în plus față de injecțiile zilnice cu D-gal și CDPS.

Test nou de recunoaștere a obiectelor

Efectuați experimente comportamentale după ultima doză. Testul de recunoaștere a obiectelor a implicat etapele de familiarizare, antrenament și testare. În timpul etapei de familiarizare, șoarecii au fost obișnuiți într-o cameră de testare goală timp de 10 minute timp de două zile. Apoi, în a treia zi (ziua de antrenament), două obiecte de aceeași dimensiune, formă și culoare (A1 și A2) au fost plasate la capetele opuse ale camerei. Fiecare mouse a primit apoi 10 minute pentru a explora cele două obiecte similare. După intervale de 1-oră (în a treia zi) și 24- oră (în a patra zi) de antrenament până la testare, unul dintre obiectele similare (A1 sau A2) a fost înlocuit cu un B sau C obiect care este diferit ca dimensiune, culoare și formă în ziua testării. În timpul etapei de testare, fiecare mouse a fost testat timp de 5 minute, iar indexul preferențial a fost calculat pentru a determina memoria recunoașterii obiectului nou (B sau C) folosind următoarea formulă: Index preferențial=Timp pe obiectul B sau C/ (Timp pe obiectul B sau C plus Timpul pe obiectul A)×100 la sută .

Testul labirintului cu apă Morris

Testul labirintului cu apă Morris a fost efectuat într-o piscină rotundă care avea 45 cm în adâncime și 90 cm în diametru. Protocolul descris de Ruediger S, et al. (2011) [55] și Wood RA, și colab. (2018) [56] a fost angajat aici. Adâncimea apei în piscină a fost de 30 cm, iar temperatura apei a fost de 20±1 grade C. Platforma avea 6 cm în diametru și 1 cm sub apă. Timpul pentru antrenament și testare a fost de 60 de secunde fiecare. Pentru antrenament, am efectuat patru teste de 60 de secunde fiecare cu o platformă ascunsă în fiecare zi, timp de cinci zile continue. Dacă platforma nu a fost descoperită de șoareci în 60 de secunde, aceștia au fost ghidați către platformă și așezați pe platformă timp de 5 secunde. În timpul etapei de testare, au fost înregistrate și analizate latența de a ajunge la platforma ascunsă în sesiunile de antrenament și probe de probă, numărul de treceri peste locația platformei îndepărtate și timpul petrecut în cadranul țintă (platformă).

teste ELISA

Nivelurile serice ale citokinelor proinflamatorii, cum ar fi IL-2(), IL-4, IL{-10 și TNF- au fost analizate pentru fiecare grup de șoareci folosind truse ELISA achiziționate de la Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) conform instrucțiunilor producătorului. Activitatea enzimei antioxidante, superoxid dismutază (SOD) și nivelurile de produs de peroxidare a lipidelor, malondialdehida (MDA), în serul fiecărui grup de șoareci au fost analizate prin truse de testare achiziționate de la Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng (Nanjing, China) . Nivelurile de produse proteice de oxidare avansată (AOPP) din probele de hipocamp murin au fost estimate utilizând un kit ELISA de la Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Shanghai, China) conform instrucțiunilor producătorului.

Estimarea stresului oxidativ în creierul murin

Am omogenizat 100 mg țesut de hipocamp cu 0,9 ml de soluție salină răcită cu gheață și omogenatul a fost centrifugat la 12000 rpm timp de 30 de minute la 4 grade C. Conținutul de proteine ​​din supernatant a fost analizat utilizând kitul de testare a proteinelor BCA ( Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Nivelurile de peroxidare a lipidelor (LPO) și malondialdehidei (MDA) și activitățile GSH-Px și SOD din probele de hipocamp au fost analizate prin colorimetrie folosind kituri de la Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng (Nanjing, China), conform instrucțiunilor producătorului.

Supliment de Cistanche: imbunatateste memoria

Compoziția microbiotei intestinale

Probele de fecale au fost colectate de la toți șoarecii și stocate imediat la -80 grade C. Regiunea V3 plus V4 a genei ARNr 16S a fost secvențiată utilizând Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Beijing, China) și analizată utilizând QIIME platformă deschisă pentru determinarea profilurilor microbiotei intestinale.

Analiza LC/MS a metaboliților serici

Probele de ser au fost incubate timp de 10 minute cu metanol pre-răcit într-un raport de 1: 3 pentru a precipita proteinele. Probele au fost centrifugate la 12000r/min timp de 15 minute la 4 grade C. Supernatanții au fost analizați prin cromatografie lichidă cu rezoluție rapidă Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 și spectru de masă QExactive. Condițiile cromatografice sunt prezentate în Tabelul 1. Analiții au fost separați într-o coloană cromatografică XBridge BEH Amide (2,1 x 100 mm; Waters Co., Milford, MA, SUA) folosind acid formic 0,1% și acetonitril ca faze mobile A și B , respectiv. Debitul a fost stabilit la 0,4 ml/min, volumul de injectare a fost de 5 ui, iar temperatura coloanei a fost stabilită la 25 grade C (Tabelul 1). Semnalele din spectrul de masă au fost obținute utilizând modurile de scanare cu ioni pozitivi și negativi. Tensiunea de pulverizare ionică și alți parametri specifici MS sunt prezentate în Tabelul 2.

analize statistice

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 și p< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">