Expresia Clr-f reglează homeostazia imună și metabolică a rinichilor Ⅲ
Nov 24, 2023
Discuţie
Infamare și mediată de celule imuneafectarea joacă un rol principal în dezvoltarea și progresia leziunii și disfuncției renale. În acest studiu, raportăm o cerință pentru Clr-f în întreținereasănătatea rinichilorși funcțiaca un control homeostatic intrinsec împotrivaafectare renală mediată imun și metabolic. Descoperirile noastre arată infiltrarea celulelor imune și depunerea de imunoglobuline și proteine de complement în rinichii șoarecilor cu deficit de Clr-f. Aceste caracteristici imune ale șoarecilor cu deficit de Clr-f sunt asociate cu aspectul asociat cu vârsta a leziunilor tubulare și glomerulare, acumularea de lipide ectopice și dereglarea numeroaselor procese transcripționale.
Faceți clic pentru a cistanche herba pentru boli de rinichi
Proteinele Clr codificate în NKC printre receptorii lor NKR-P1 legați genetic au fost în centrul studiului ca mediatori independenți de clasa I MHC neredundanți ai auto-recunoașterii lipsei de către NKR-P1 care exprimă celulele imune9,27-31. Expresia crescută a proteinelor Clr selectate ca răspuns la stresul celular este, de asemenea, raportată că limitează funcțional răspunsurile imune ale celulelor imune rezidente în țesut7,12,32. În consecință, Clr-f intestinal a fost considerat că contribuie la toleranța imună în mediul intestinal, altfel foarte imunogen, prin interacțiunea sa cu limfocitele intraepiteliale inhibitoare care exprimă receptorul NKR-P1G7. Lucrările efectuate de Leibelt et al. a arătat că șoarecii provocați cu poli(I:C) au prezentat o expresie crescută a Clr-f și că interacțiunile Clr-f/NKR-P1G in vitro sunt puternic inhibitoare pentru celulele care exprimă NKR-P1G. Împreună, aceste constatări pot fi interpretate ca un mecanism potențial prin care Clr-f poate preveni reactivitatea subgrupurilor pozitive NKR-P1G intraepiteliale intestinale față de bariera epitelială care este provocată în mod constant de stimuli microbieni7.
Generarea de șoareci cu deficit de Clr-f ne-a oferit prima oportunitate de a evaluaimplicatii functionalea expresiei Clr-f in vivo și ne-a permis să investigăm potențialele roluri homeostatice imune ale Clr-f în rinichi. Leziunile renale observate la șoarecii Clr-f-/- se aliniază cu modelul conform căruia reglarea descendentă a Clr-f servește ca un indicator al stresului și rănilor celulare care eliberează constrângeri asupra celulelor efector care exprimă NKR-P1G. Creșterea NKR-P1G pe celulele T în rinichii șoarecilor Clr-f-/- sugerează că fie expresia NKR-P1G este crescută printre celulele T rezidente la rinichi în absența Clr-f, fie că rinichii Clr- Șoarecii f-/- sunt supuși infiltrării celulelor T care exprimă NKR-P1G. Absența unei modificări detectabile în prezența sau distribuția celulelor care exprimă NKR-P1G în intestinul șoarecilor Clr-f-/- ar putea indica faptul că consecințele funcționale ale interacțiunii NKR-P1G: Clr-f în intestin sunt limitate. la controlul reactivității imune în contextul infecției, mai degrabă decât toleranța imună. Alternativ, interacțiunile redundante pot controla și activitatea celulelor care exprimă NKR-P1G. Acest lucru este susținut de constatările că NKR-P1G se leagă nu numai de Clr-f, ci și de Clr-d și Clr-g33, acesta din urmă fiind moderat exprimat în țesuturile atât ale rinichilor, cât și ale intestinului6. În timp ce descoperirile noastre dezvăluie o cerință ca Clr-f să protejeze împotriva leziunilor renale autoimune, rolul mediat de NKR-P1G în patologiile renale autoimune ale șoarecilor Clr-f-/- este incomplet. În special, deși există o creștere a celulelor T care exprimă NKR-P1G în rinichiul șoarecilor Clr-f-/-, diferența este dezamăgitoare. Este posibil ca un receptor alternativ să participe la supravegherea Clr-f în rinichi. Pentru a aborda pe deplin această axă de control în homeostazia rinichilor, sunt necesare investigații suplimentare
Afectarea renală mediată imun este caracterizată de o infiltrare a celulelor inflamatorii în spațiul interstițial sau în glomerul34. Acumulările renale de monocite, celule B și T, anticorpi anti-glomerulari, citokine IL{3}} și IFN crescute și diferite patologii glomerulare la șoarecii Clr-f-/- seamănă foarte mult cu peisajul autoimun al modelelor de șoareci LN ( adică LMR-Faslpr)35–37. Deși rinichii Clr-f-/- prezintă depozite mezangiale dominante IgA cu depunere asociată de IgM și IgG și gruparea profilurilor transcripționale Clr-f-/- și IgAN, este probabil prematur să se sugereze că aceste fenotipuri sunt indicative pentru un tip de CKD cu IgAN38. Mai degrabă, aceste leziuni, împreună cu prezența mesangiolizei, îngroșarea GBM și moartea podocitelor în rinichii Clr-f-/-, precum și modificări tubulointerstițiale, acumularea de grăsime și dereglarea semnificativă a căilor metabolice sunt elemente comune pentru o varietate de patologii. derivate din defecte metabolice exacerbate de sistemul imunitar37,39,40. Indiferent de cauza de bază sau tipul de boală al disfuncției renale a șoarecelui Clr-f-/-, Clr-f pare să joace un rol de atenuare împotriva dezvoltării autoimunității cu o patologie clară legată de glomerulonefrită.
Examinarea noastră a șoarecilor Rag1-/-Clr-f-/- indică o contribuție proeminentă a mediatorilor independenți de celulele T și B la răspunsurile autoimune ale șoarecilor Clr-f-/-. În special, acumularea de celule periglomerulare CD11c+, celule F4/80+ și celule NKp{46+ a fost chiar mai pronunțată în absența celulelor T și B și a fost corelată cu o prezență semnificativă a leziunilor glomerulare. Acest lucru sugerează că, în timp ce celulele T și B pot contribui la infamarea dăunătoare rinichilor și la complexele de autoanticorpi, la șoarecii Clr-f-/- aceștia pot să nu fie determinanți centrali ai patologiei, ci fie contribuitori secundari la activitatea inflamatorie a altor celule imune sau potențial. joacă un rol imunoregulator la șoarecii cărora le lipsește Clr-f. Acest lucru contrastează dovezile din modelul de șoarece ddY al IgAN care arată un răspuns puternic polarizat T1, celulele T producătoare de IFN crescând odată cu vârsta și cu progresia leziunii glomerulare41. Infiltrarea renală a celulelor B la șoarecii cu deficit de Clr-f a fost, de asemenea, demonstrată în modelele de șoarece ale SLE42. Până în prezent, nu este clar dacă celulele B din rinichi contribuie la infamarea dăunătoare în CKD sau joacă mai multe roluri de reglementare43. Dovezile recente ale BRC la pacienții vârstnici au constatat că scăderea populațiilor de celule B a fost asociată cu progresia bolii renale44. S-a demonstrat că atât celulele T, cât și celulele B au activitate imunosupresoare în bolile de rinichi autoimune45,46 și, prin urmare, măsura în care contribuie sau reglează patologiile șoarecilor Clr-f-/- necesită investigații suplimentare.
Descoperirile noastre împreună arată o cerință pentru exprimarea Clr-f în epiteliul tubular al tubilor contorți proximali, podocitelor și/sau epiteliului intestinal. Pierderea expresiei Clr-f duce la o cascadă autoimună și inflamatorie pronunțată care duce la afectarea rinichilor și adipozitatea asociată. Răspunsurile imune provocate de pierderea Clr-f par a fi independente de celulele T și B. În general, un rol funcțional pentru Clr-f în rinichi poate fi imaginat ca o moleculă inhibitoare pentru surveillant efector celulele imune din rinichi, așa cum sunt poziționate în intestin, sau ca unregulator intrinsec al funcției celulelor tubulare.
Materiale şi metode Şoareci.
Toți șoarecii au fost menținuți într-un mediu dedicat fără agenți patogeni. Șoarecii C57BL/6 (WT) și B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1-/-) au fost achiziționați de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME, SUA). Șoarecii care poartă mutațiile nule combinate în Rag1 și Clr-f (Rag1-/-; Clr-f -/-) au fost generați prin încrucișarea șoarecilor Clr-f-defficient (Clr f -/-) cu șoareci (Rag1-/-) . Toate reproducerea și manipulările efectuate asupra animalelor au fost în conformitate cu ghidurile universității și aprobate de Comitetul de etică a animalelor de la Universitatea Dalhousie și de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Universității din Ottawa. Toate modelele de studii pe animale, experimentele și raportarea au fost efectuate în conformitate cu ghidurile ARRIVE.
Generarea de șoareci Clr-f-deficienți. Șoarecii cu deficit de Clr-f (Clr-f -/-) au fost generați prin recombinarea omoloagă a unui construct de țintire care conține o casetă fosfoglicerat kinază (PGK)-neomicină și o secvență genomică care acoperă exonii 3, 4 și o parte a exonului 5 ai Gena Clr-f. Construcția de țintire completă a fost confirmată prin secvențiere la Institutul de Cercetare a Spitalelor din Ottawa (OHRI) înainte de electroporare în celule stem embrionare (ES) C57BL/6 Bruce-4. Selecția clonelor ES prin rezistența G{{10}}a fost efectuată de IRCM (Montreal Clinical Research Institute) Transgenic Core Facility (Montreal, QC, Canada). Între timp, sondele 5′ și 3′ Clr-f au fost testate într-o analiză a polimorfismului de lungime a fragmentului de restricție (RFLP) utilizând ADN genomic timic de la un șoarece WT B6, care a fost digerat cu BamHI și, respectiv, PstI. Fragmentele de ADN digerate au fost rezolvate pe gel de agaroză 1% și transferate pe bloturi de membrană de nailon. Sondele de ADNc Clr-f au fost marcate cu 32P-dCTP radioactiv (Perkin Elmer, Guelph, ON, Canada) folosind trusa lotului NEB (New England Biolabs, SUA). Petele au fost sondate cu sonde de ADNc Clr-f marcate cu 32P într-o soluție de hibridizare (10% (g/v) sulfat de dextran; 1 M NaCI; 1% SDS). Hibridizarea a fost efectuată peste noapte la 65 de grade și s-au efectuat spălări post-hibridare cu o soluție care conține 2x SSC și 1% SDS preîncălzită la 65 de grade. Petele au fost expuse la filme fotografice pentru a dezvălui semnalele de hibridizare (Figurile S1A, S3B). Membranele au fost stripate cu 0,2% SSC/0,2% SDS timp de 30 de minute la 85 de grade între diferite hibridizări. Clonele rezistente la neomicină au fost analizate prin analiză Southern blot și a fost observată o eficiență de țintire de ~15%. Clonele ES selectate au fost microinjectate în blastociste la IRCM Microinjection Service Facility pentru a genera șoarecii fondatori Clr-flox himeric. Șoarecii au fost analizați prin analiză Southern blot și apoi au fost crescuți cu femele B6 pentru a produce șoareci heterozigoți Clr-fwt/lox. Șoarecii heterozigoți au fost încrucișați pentru a obține șoareci Clr-flox/lox. Pentru a îndepărta caseta cu neomicină, șoarecii Clr-flox/lox au fost crescuți cu șoareci transgenici CMV-cre homozigoți pe un fundal B6 (Jackson Laboratory). CMV-CreTg/0 dublu heterozigot rezultat; Șoarecii Clr-f-/+ au fost încrucișați pentru a produce șoareci Clr-f-/- cărora le lipsea transgena CMV-cre. Șoarecii au fost genotipați folosind primeri specifici (Tabelul 1, Fig. S1B, C și Fig. S3C, D). Amplificarea PCR a fost efectuată utilizând polimeraza AccuStart II Taq (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, SUA). Amestecul PCR a fost preparat urmând instrucțiunile producătorului. ADN-ul urechii extras cu fenol/cloroform a fost folosit ca șabloane. Au fost utilizați următorii parametri de cicluri PCR: 30 de cicluri de amplificare de 94 de grade timp de 40 s, 60 de grade timp de 45 s, 72 de grade timp de 60 s. WT și Clr-f -/- littermates au fost utilizați în toate experimentele, dacă nu se indică altfel.
Hibridarea in situ.
Analizele de hibridizare in situ ale Clr-f au fost realizate prin donarea catenei sens de lungime completă CDS și a catenei antisens care se întinde Clr-f într-un vector pGEM-T Easy așa cum s-a descris anterior. Sondele ARN antisens și sens marcate cu genină Digoxi au fost transcrise din plasmide linearizate care codifică gena Clr-f cu polimeraza T7 utilizând amestecul de marcare ARN DIG (Roche, Basel, Elveția). Țesuturile au fost colectate de la șoareci B6 adulți și au fost fixate fie în formol 10% la RT, fie în paraformaldehidă 4% la 4 grade cu agitare ușoară timp de până la 24 de ore. Țesuturile au fost apoi încorporate în parafină și secțiuni de 4 um au fost preparate pe lame de sticlă. Lamele de țesut au fost decarbonatate prin tratament cu 0.2 N HCI timp de 15 min și 3{0 µg/mL de proteinază K la 37 de grade timp de 20 min. Țesutul a fost fixat în PFA 4% timp de 10 minute, urmat de tratament cu anhidridă acetică 0,25% în trietanolamină 0,1 M de două ori timp de 5 minute fiecare. Lamele au fost apoi pre-hibridizate cu soluție de hibridizare (50% (v/v) formamidă/5xSSC, pH 4,5; 2% (g/v) pulbere de blocare (Roche); 0,05% (g/v) CHAPS; 5 mM EDTA; 50 pg/mL heparină; 1 pg/mL ARN de drojdie) într-un cuptor de 58 de grade timp de cel puțin 1 oră, apoi incubat cu soluție de hibridizare care conține 500 ng/mL sondă marcată cu digoxigenină peste noapte la 58 de grade. Spălările post-hibridare au fost efectuate cu 50% formamidă/2x SSC, pH 4,5 la 55 grade 3x timp de 20 de minute fiecare, iar lamele au fost colorate cu anticorp de oaie anti-digoxigenină fosfatază alcalină conjugată la diluție 1:1000 în soluție de blocare ( Roche). Dezvoltarea culorii a fost realizată prin adăugarea de substraturi de tetrazoliu/5-Bromo, 4-clor și 3-indoilfosfat (NBT/BCIP, Roche) albastru nitro pe lame. Lamele au fost ținute în întuneric la RT până când au apărut semnalele optime. Etichetarea controlului a fost efectuată utilizând o sondă sens-catenă și studii de legare competitivă cu specificitate confirmată de sondă sens și antisens. Lamele au fost apoi colorate cu verde deschis sau verde de metil și vizualizate la microscop cu lumină.
RT-PCR. Țesuturile renale de la șoareci WT și Clr-f -/- potriviți în funcție de vârstă și sex au fost excizate, clătite cu PBS și congelate la grade -80. ARN a fost izolat din țesuturi congelate folosind reactiv de extracție RiboZol ARN (AMRESCO Inc., West Chester, PA, SUA) urmând instrucțiunile producătorului. Aproximativ 1 ug de ARN a fost transcris în cADN utilizând un kit Verso cDNA (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA). Amplificarea PCR a fost efectuată pe 1 μL de produs ADNc utilizând primeri specifici (Tabelul 1). Condițiile PCR utilizate au fost 94 de grade pentru 30 s, 58 de grade pentru 30 s, 72 de grade pentru 60 s și 35 de cicluri de amplificare. Produsele PCR au fost vizualizate pe gel de agaroză 1% colorat cu bromură de etidio (Fig. 1C, Fig. S3A).
Imunohistochimie.
Țesuturile renale ale șoarecilor WT și Clr-f -/- potriviți în funcție de vârstă și sex au fost deparafinate prin trei incubații de 5 minute în xilen, două incubații de 5 minute în 100% etanol, urmate de 90 % etanol, apoi 80% etanol și în final 70% etanol. Lamele au fost rehidratate prin spălare în apă distilată (20 de scufundări), iar extragerea epitopului indusă de căldură a fost efectuată utilizând o oală sub presiune în tampon citrat (pH 6,0). Peroxidazele endogene au fost blocate cu peroxid de hidrogen 3% în apă sterilă timp de 10 minute, iar proteinele au fost blocate folosind Background Sniper (Biocare Medical, Pacheco, CA, SUA). Secțiunile au fost apoi incubate cu anticorpi monoclonali anti-Clr-f de șobolan anti-șoarece7 la 4 grade peste noapte. A doua zi, lamelele au fost clătite cu 0,1 M PBS și incubate timp de 1 oră în anticorpi secundari. Colorarea a fost dezvoltată folosind un kit Goat-on-Rodent HRP-Polymer (Biocare Medical) și Betazoid DAB Bufer (Biocare Medical), urmat de contracolorare cu hematoxilină. Același proces a fost folosit pentru a colora secțiunea de țesut renal pentru marcarea IHC a celulelor NKp46+ și CD{{3+, folosind anti-NKp46 (eBioscience, Santa Clara, CA, SUA, clona 29A1.4, CAT# 48-3351-82) și respectiv anti-CD3 (BioLegend CAT#100,327) ca anticorpi primari. Marcarea IHC a F4/80 a fost efectuată pe secțiuni de rinichi înghețate folosind un anticorp monoclonal BM8 de șobolan anti-F4/80. Un anticorp secundar conjugat cu IgG H&L HRP de capră anti-șobolan (Abcam, Cambridge, UK CAT#ab97057) a fost utilizat ca mai sus și IHC-urile au fost dezvoltate cu, un substrat de peroxidază de hrean (HRP) a fost utilizat DAB Substrate Kit (Abcam, CAT# ab64238).
Imunofluorescență.
Rinichii și/sau țesuturile intestinale ale șoarecilor WT și Clr-f -/- potriviți în funcție de vârstă și sex au fost crioconservate în zaharoză 30% la -80 de grade în compusul cu temperatură optimă de tăiere Tissue-Tek (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, SUA). Secțiunile de criostat de 20 μm au fost fixate cu acetonă într-o hotă la temperatura camerei timp de 16 minute și uscate la aer timp de cel puțin 30 de minute, după spălare în PBS 0,01 M, pH 7,4. Legarea nespecifică a fost blocată cu ser de măgar 10%. Secțiunile au fost incubate peste noapte la 4 grade cu anticorpii primari: anti-Clr-f7, anti-NKR-P1G (un anticorp monoclonal anti-șoarece de șobolan descris anterior7), anti-IgA (lanț alfa IgA de capră anti-șoarece (Abcam, Cambridge). , Marea Britanie CAT#ab97235), anti-IgG-PE (BioLegend, San Diego, CA, SUA CAT#405324, anti-IgM-FITC (Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA CAT#A21042), Complement C3 Anticorp (11H9) ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, SUA Cat# NB200-540), anti-IFN-PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SUA CAT#554411), anti-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), anti-CD45-FITC (BioLegend CAT#103108), anti-CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85), anti-F4/80- APC (BioLegend CAT#123116) și anti-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#{48-3351-82) la concentrație 1:100 în ser normal 5% într-o cameră umidificată. Marcarea cu anticorpi secundare a anti Anticorpii -Clr-f și anti-NKR-P1G folosind anticorpi policlonali conjugați FITC au fost efectuate la RT timp de incubare de 1 h. Probele au fost colorate nuclear DAPI la RT timp de 5 minute, spălate cu PBS și montate pe lame de sticlă cu o picătură de VECTASHIELD PLUS suport de montaj antidecolorare (Vector Laboratories, San Francisco, CA, SUA) și acoperit cu o lamă de sticlă. Lamele au fost examinate folosind un microscop confocal cu scanare laser Zeiss LSM 510.
Scor histologie și patologie.
Secțiunile de rinichi ale șoarecilor WT, Clr-f -/-, Rag1-/- și Rag1-/-Clr-f -/- (3 μm) potrivite pentru vârstă și sex (3 μm) au fost colorate cu acid periodic (PAS). Țesutul renal a fost evaluat pentru celularitatea mezangială (definită ca 4 sau mai mulți nuclei pe zonă mezangială), proliferarea endocapilară, semilunare și scleroza glomerulară. Secțiunile au fost, de asemenea, evaluate pentru prezența tubulopatiei, fibrozei interstițiale, atrofiei tubulare și infiltratelor de celule tubulointerstițiale. Pentru scorul patologiei glomerulare a fost utilizat un scor semi-cantitativ pentru a evalua gradul de afectare glomerulară. Au fost examinați minimum 50 glomeruli în fiecare grup și severitatea leziunii a fost gradată de la 0 la+3: o+1 leziune a reprezentat o implicare mai mică sau egală cu 30% a glomerulului,+2 de 30–60%, în timp ce o leziune+3 a indicat că a fost implicat mai mult sau egal cu 60% din glomerul. Măsurarea grosimii GBM a fost efectuată pe micrografii electronice glomerulare ale WT și Clr-f -/- folosind imaginea J V1.53a47. Țesutul renal colorat cu PAS de la doi șoareci Rag1-/- și doi Rag1-/-Clr-f -/- a fost, în plus, punctat orb pentru prezența caracteristicilor patologice de mai sus, iar caracteristicile cuantificate au fost calculate din cele patru secțiuni de rinichi medii per fiecare mouse.
Microscopia electronică.
Procesarea țesutului pentru microscopia electronică cu transmisie a urmat protocolul publicat48. Pe scurt, bucăți mici de țesut renal de la șoareci 12-WT și Clr-f -/- vechi de o săptămână au fost fixate în soluție de glutaraldehidă 2,5% și apoi procesate folosind metoda tetroxid de osmiu/acetat de uranil 1%. Probele au fost încorporate în rășină Epon Araldite înainte de tăiere folosind un ultramicrotom Reichert-Jung ultra cut E. Probele au fost vizualizate pe un microscop electronic cu transmisie JEOL JEM 1230 și imaginile au fost capturate folosind o cameră digitală Hamamatsu ORCA-HR.
Măsurarea deșeurilor chimice în urină și plasmă și electroliți.
Aproximativ 150 μL de urină au fost colectați zilnic de la șoareci masculi WT și Clr-f -/- în vârstă de 12-săptămâni, în același moment al zilei, timp de 5 zile consecutive. Urina a fost centrifugată la 10,000 rpm pentru a îndepărta resturile și apoi stocată la -80 de grade. Sângele din vena facială a fost colectat de la aceiași șoareci în tuburi heparinizate și izolat prin centrifugare la 3000 g timp de 5 minute și depozitat la -80 de grade. Probele de urină și plasmă au fost trimise la Idexx Laboratories (Markham, Ontario) pentru măsurarea concentrației de proteine, creatinine și electroliți.
Măsurătorile tensiunii arteriale la șoareci de 12 și 24 de săptămâni. Tensiunile arteriale sistolice și diastolice (BP) au fost măsurate prin pletismografie cu manșeta coadă pe șoareci masculi WT și Clr-f -/- în vârstă de 12 și 24-săptămâni la starea de echilibru, folosind un model BP2000 Visitech. TA a fost măsurată zilnic în aceeași cameră și la aceeași oră a zilei timp de 5 zile consecutive. Valorile TA din ultimele 3 măsurători consecutive au fost utilizate pentru a calcula valoarea medie a TA, deoarece primele 2 zile au fost considerate esențiale pentru adaptarea șoarecilor.
Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>30 × 106 adâncime de citire per probă.
RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 și limita de modificare a pliului de jurnal de 1,5. Sunt furnizate valori FPKM pentru toate punctele de timp și mostrele (Fișierul 1 al setului de date suplimentar). Analiza îmbogățirii funcționale. Ontologia genetică și analiza de îmbogățire funcțională a fost efectuată utilizând g: Profiler (versiunea e102_de exemplu49_p{15_7a9b4d6) cu g: metoda de corecție a testării multiple SCS aplicând un prag de semnificație de 0,05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 și sistemul de clasificare PANTHER cu testarea Fisher's Exact și pragul FDR de<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53.
Au fost create rețele de îmbogățire funcțională folosind seturi de gene ale proceselor biologice GO (GO: BP) pentru Mus Musculus (GRCm38. p6) Versiunea BioMart: 2020-12-08 descărcată de la g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee /gprofiler/gost). Analiza de îmbogățire a seturilor de gene (GSEA) a fost efectuată utilizând GSEA V4.0354,55 utilizând îmbogățirea rețelei bazată pe FDR<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).
Analiza lipidelor abdominale și ectopice. Acumularea de grăsime a fost determinată de greutatea grăsimii abdominale disecate de la șoareci individuali. Măsurătorile greutății corporale au fost luate înainte de extracția grăsimilor. Pentru colorarea Oil Red O (ORO), secțiunile de rinichi înghețate au fost tăiate la 10 μm folosind un criostat și apoi uscate la aer timp de 30 de minute. Colorarea ORO a fost realizată prin fixarea secțiunilor cu 3 spălări de izopropanol 60%, incubarea lor cu o concentrație de lucru (66%) de soluție ORO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) colorare timp de 15 min. Lamelele au fost apoi spălate rapid cu izopropanol 60%, colorate rapid cu hematoxilină Mayer pentru a evidenția nucleele și apoi montate folosind VectaMount AQ Aqueous Mounting Media (Vector Laboratories).
Analiza patotipului. Analiza patotipului a fost efectuată folosind gene exprimate diferențial (DEG) cu q<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation.
Țesutul digerat a fost trecut printr-un filtru de nailon de 70-μm, spălat cu PBS, iar celulele roșii rămase au fost lizate cu tampon de lizare ACK timp de 5 minute pe gheață. Celulele imune ale rinichilor au fost izolate prin centrifugare RT la 2000 rpm timp de 30 de minute în Percoll 40%. Peletul celular a fost resuspendat în PBS și numărul de celule a fost obținut prin hemocitometru. Diverse mAb au fost utilizate pentru a verifica expresia proteinei de la suprafața celulară, celulele au fost colorate pentru analiza citometrică cu anticorpi de șoarece marcați cu fluorocrom: anti-CD45 (eBioscience, clona 30-F11), anti-TCR (eBioscience, clona H{ {12}}), anti-NK1.1 (eBioscience, clona PK136), anti-CD19 (BioLegend, clona 1D3/CD19), anti-CD11b (BioLegend, clona M1/70), anti-F4/80 (BioLegend, clona BM8), anti-MHCII(IA/IE) (BioLegend, clona M5/114.15.2), anti-Ly6G (BioLegend, clona 1A8), anti-NKp46 (eBioscience, clona 29A1.4) și controale izotip. Viabilitatea celulară a fost determinată utilizând un colorant de viabilitate fixabil (eBioscience, Cat# 65-0865-14). Pentru a identifica și cuantifica populațiile de celule imune în rinichii WT și Clr-f -/-, au fost utilizate analize multiparametrice de citometrie fow folosind anticorpi împotriva markerilor specifici celulei pentru a identifica neutrofile (CD11b+Ly6G+), macrofage (CD11b+Ly6G-F4/{ {57}}MHCII+), celule NK (CD11bloLy6G−TCR -NK1.1+) și celule NKp{46+ (CD11bloLy6G−TCR −NKp{46+), celule T (Ly6G−NK1 .1−TCR +) și celulele B (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). Toate probele au fost achiziționate pe un citometru BD-Fortessa.
Referințe
1. Hato, T. & Dagher, PC Cum sistemul imunitar înnăscut simte probleme și provoacă probleme.Clin. J. Am. Soc. Nefrol.10, 1459–1469 (2015).
2. Krüger, T.et al.Identificarea și caracterizarea funcțională a celulelor dendritice în rinichiul murin sănătos și în experimentalglomerulonefrita.J. Am. Soc. Nefrol.15, 613–621 (2004).
3. Weisheit, CK, Engel, DR & Kurts, C. Celulele dendritice și macrofagele: santinelele în rinichi.Clin. J. Am. Soc. Nefrol.10, 1841–1851 (2015).
4. Woltman, AMet al.Cuantificarea subgrupurilor de celule dendritice în țesutul renal uman în condiții normale și patologice.Rinichi Int.71, 1001–1008 (2007). 5. Gottschalk, C.et al.Celulele dendritice dependente de Batf3-din ganglionul limfatic renal induc toleranță față de antigenele circulante.J. Am.Soc. Nefrol.24, 543–549 (2013).
6. Zhang, Q.et al.Secvența grupului de gene Nkrp1-Clr de șoarece și analizele de expresie dezvăluie conservarea MHC-ului specific țesuturilorimunosupraveghere independentă.Plus unu7, e50561 (2012).
7. Leibelt, S.et al.Imunosensibilizarea dedicată a epiteliului intestinal de șoarece facilitată de o pereche de lectine cuplate geneticreceptori.Imunol mucoase.
8, 232–242 (2015). 8. Rahim, MMAet al.La șoarece NKR-P1B: Sistemul de recunoaștere Clr-b este un regulator negativ al răspunsurilor imune înnăscute.Sânge125, 2217–2227 (2015).
9. Carlyle, JRet al.Lipsește auto-recunoașterea Ocil/Clr-b de către receptorii inhibitori ai celulelor natural killer NKR-P1.Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004).
10. Rutkowski, E.et al.Clr-a: O moleculă nouă, asemănătoare lectinei de tip C, legată de imunitate, exprimată exclusiv de epiteliul intestinal de șoarece.J. Imunol.198, 916–926 (2017).
11. Balaji, GRet al.Recunoașterea gazdei Clr-b de către receptorul inhibitor NKR-P1B oferă o bază pentru recunoașterea de sine lipsă.Nat.comun.9, 4623 (2018)
12. Friede, ME, Leibelt, S., Dudziak, D. & Steinle, A. Selectați expresia Clr-g pe celulele dendritice activate facilitează interacțiunea înrudităcu un subset minor de celule NK splenice care exprimă receptorul inhibitor Nkrp1g.J. Immunol.200, 983–996 (2018).
13. Abou-Samra, E.et al.Expresia NKR-P1B în celulele limfoide înnăscute asociate intestinului este necesară pentru controlul gastrointestinal.infectii ale tractului.Celulă. Mol. Imunol.16, 868–877 (2019).
14. Germain, C.et al.Caracterizarea variantelor de transcripție îmbinate alternativ ale genei CLEC2D.J. Biol. Chim.285, 36207–36215 (2010).
Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
